環(huán)氧樹脂固定化L-谷氨酸氧化酶

張利坤，肖延銘，楊衛(wèi)華，李敬亞

(1.長興制藥股份有限公司 工業(yè)生物催化與轉(zhuǎn)化浙江省工程研究中心，浙江 長興 313100；2.鄭州大學(xué) 化學(xué)與分子工程學(xué)院，河南鄭州 450001)

L-谷氨酸氧化酶(L-glutamate oxidase，LGOX)是一種以黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)為輔基的黃素蛋白酶類，可以氧化L-谷氨酸(L-glutamic acid)生成H2O2、氨和α-酮戊二酸(α-KG)[1]，這一反應(yīng)過程不需要添加外源輔因子，且對L-谷氨酸有很強(qiáng)的底物專一性[2]。該酶常用于L-谷氨酸定量檢測、臨床生化檢驗(yàn)中的谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶和γ-谷氨?；D(zhuǎn)移酶活性測定等，該酶自20世紀(jì)80年代被發(fā)現(xiàn)以來，一直是工具酶研究的熱點(diǎn)之一[3]。α-KG作為一種新型有機(jī)酸，其在三羧酸循環(huán)和氨基酸代謝中扮演著重要角色，因此，廣泛應(yīng)用于食品、藥品及農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域[4-5]。近年來，國內(nèi)L-谷氨酸鈉存在產(chǎn)能過剩現(xiàn)象，可將L-谷氨酸中氨基氧化為酮基生成α-KG，實(shí)現(xiàn)L-谷氨酸的高值化[6]。

目前，α-KG的生產(chǎn)方法包括化學(xué)合成法、發(fā)酵法和酶法?；瘜W(xué)法存在環(huán)境污染嚴(yán)重、產(chǎn)品應(yīng)用范圍窄等缺點(diǎn)；微生物發(fā)酵法發(fā)酵周期較長，易產(chǎn)生丙酮酸、乳酸等副產(chǎn)物，不易分離；酶法具有專一性強(qiáng)、反應(yīng)條件溫和、副產(chǎn)物少等優(yōu)點(diǎn)，適合α-KG工業(yè)化生產(chǎn)[7-9]。

固定化酶方法主要有物理吸附、共價(jià)結(jié)合、交聯(lián)法和包埋法，其中，共價(jià)結(jié)合法具有操作簡單、重復(fù)使用次數(shù)多、易回收等優(yōu)點(diǎn)[10]。環(huán)氧基由于在常溫條件下即可與蛋白質(zhì)的氨基發(fā)生反應(yīng)，反應(yīng)前無需對環(huán)氧基進(jìn)行額外處理、操作簡便，因此，眾多研究者將含有環(huán)氧基基團(tuán)的高分子聚合材料作為載體用于酶固定化進(jìn)而應(yīng)用于產(chǎn)業(yè)化[11]。

目前，有關(guān)LGOX固定化研究報(bào)道較少，本文中，筆者通過篩選合適環(huán)氧樹脂作為載體，對LGOX進(jìn)行固定化工藝研究，并利用固定化LGOX進(jìn)行α-KG轉(zhuǎn)化小試，以考察固定化LGOX的操作穩(wěn)定性。

1 材料與方法

1.1 菌種

基因工程重組菌E.coliBL21(DE3)/pET-28a(+)-LGOX，構(gòu)建并保存于長興制藥研發(fā)中心分子實(shí)驗(yàn)平臺(tái)，其中L-谷氨酸氧化酶(LGOX)基因來源于Streptomycessp.X-119-6。

1.2 培養(yǎng)基

LB發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨10，酵母膏5，NaCl 5。向滅菌后的培養(yǎng)基添加事先配制成一定濃度過濾除菌后的卡那霉素(Kan)，使其終質(zhì)量濃度為50 μg/mL。

LB斜面培養(yǎng)基：在液體培養(yǎng)的基礎(chǔ)上加瓊脂粉20 g/L。待培養(yǎng)基冷卻至40～50 ℃，過濾除菌后的卡那霉素(Kan)，使其終質(zhì)量濃度為50 μg/mL，制作斜面。

以上培養(yǎng)基都需調(diào)節(jié)pH至7.2，再在121 ℃條件下滅菌20 min。

1.3 主要試劑

環(huán)氧樹脂LX-EP200、LX-1000EP和LX-1000EPF，西安藍(lán)曉科技有限公司；環(huán)氧樹脂ES-105(孔徑，150～300 μm)、ES-107和ES-103B，天津南開和成科技有限公司；L-谷氨酸鈉，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；過氧化氫酶(300 000 U/mL)，蘇州奧維科生物科技有限公司；其他常規(guī)試劑均為市售分析純。

1.4 LGOX的獲得

1.4.1 LGOX粗酶液制備

將重組菌E.coliBL21(DE3)/pET-28a(+)-LGOX接種至LB斜面，37 ℃培養(yǎng)12 h，獲得斜面菌體；用無菌水洗下培養(yǎng)好的斜面菌體接入裝有100 mL LB含Kan發(fā)酵培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，37 ℃、150 r/min培養(yǎng)6～8 h后，IPTG誘導(dǎo)量0.3 mmol/L，25 ℃、150 r/min誘導(dǎo)培養(yǎng)10～12 h。將發(fā)酵液離心(5 000 r/min，10 min)收集沉淀菌體。用100 mmol/L、pH 7.0 K3PO4緩沖液懸浮菌體，使菌體終質(zhì)量濃度為200 g/L，超聲破碎(冰浴，功率400 W，工作5 s，間隔5 s) 20 min，4 ℃下9 000 r/min離心10 min，保留上清液得到粗酶液。

1.4.2 (NH4)2SO4分級沉淀

將由上步得到的粗酶液分裝為20 mL體系，在冰浴條件下輔助以磁力攪拌，向各個(gè)體系中分別緩慢加入事先研磨成粉狀的(NH4)2SO4以形成不同飽和度的溶液，4 ℃靜置3 h，5 000 r/min離心分離上清液及沉淀，將沉淀用10 mL 100 mmol/L、pH 7.0 K3PO4緩沖液溶解后，以最高酶活(100%)作為參照，分別計(jì)算上清液和沉淀反應(yīng)體系相對酶活，以確定(NH4)2SO4最適飽和度。

1.5 固定化載體篩選

將(NH4)2SO4鹽析處理后沉淀用100 mmol/L、pH 7.0 K3PO4緩沖液配制成14 U/mL酶液，分別向15 mL酶液加入2 g不同型號樹脂，置于25 ℃水浴搖床中，150 r/min振蕩24 h。抽濾水洗，檢測不同固定化樣品酶活。

1.6 固定化LGOX的制備

1.6.1 濃縮酶液的制備

將(NH4)2SO4鹽析處理后的沉淀用10 mmol/L、pH 7.0 K3PO4緩沖液配制成140 U/mL濃縮酶液。

1.6.2 LGOX的固定化

用100 mmol/L、pH 7.0 K3PO4緩沖液將濃縮酶液稀釋10倍，制備成初始酶濃度為14 U/mL的固定化酶液，取3 g樹脂與20 mL該酶液混合，置于20 ℃水浴搖床中，150 r/min振蕩20 h，抽濾水洗3遍得固定化酶，4 ℃冷藏備用。

1.7 分析方法

1.7.1 L-谷氨酸與α-KG的HPLC分析

L-谷氨酸和α-KG的含量均由HPLC測定，分析條件：流動(dòng)相為25 mmol/L KH2PO4(含5%的甲醇)水溶液(pH 3.0)，流速為l mL/min，檢測波長為203 nm，柱溫為30 ℃，進(jìn)樣量為10 μL，色譜柱為InerSustain? C18(250 mm×4 mm)。在該條件下，L-谷氨酸和α-KG的出峰時(shí)間分別為2.36 min和2.96 min。

1.7.2 固定化LGOX固定化率及酶活回收率的計(jì)算

固定化LGOX的固定化率及回收率計(jì)算見式(1)～(2)。

A=(W1-W2)/W1×100%

(1)

B=W0/(W1-W2)×100%

(2)

式中：A為固定化LGOX的固定化率；W1為游離酶總酶活；W2為固定化后清液酶活力；B為固定化LGOX的酶活回收率；W0為固定化酶的酶活。

1.7.3 游離LGOX酶活測定

酶活定義：在25 ℃、pH 7.0條件下，1 min產(chǎn)生1 μmolα-KG所需的酶量定義為1個(gè)酶活單位，即1 U。

取100 mmol/L、pH 7.0的H3PO4緩沖液180 mL，向其中加入15 g L-谷氨酸鈉，500 μL過氧化氫酶，5 mL(NH4)2SO4鹽析處理后濃縮酶液，反應(yīng)條件為25 ℃、pH 7.0、轉(zhuǎn)速120 r/min、通氣量2.0 vvm(1個(gè)vvm為每分鐘通過單位反應(yīng)體積的空氣體積)，反應(yīng)20 min，液相檢測α-KG生成量。

1.7.4 固定化L-谷氨酸氧化酶酶活測定

比酶活定義：1 g固定化LGOX所具有的酶活力單位，U/g。

取100 mmol/L、pH 7.0的H3PO4緩沖液185 mL，向其中加入15 g L-谷氨酸鈉、500 μL過氧化氫酶和3 g固定化酶，反應(yīng)條件為25 ℃、pH 7.0、轉(zhuǎn)速120 r/min、通氣量2.0 vvm，反應(yīng)20 min，液相檢測α-KG生成量。

1.8 固定化LGOX催化L-谷氨酸產(chǎn)α-KG

1 L反應(yīng)體系：向900 mL水中加入100 g L-谷氨酸鈉，1 mL過氧化氫酶，15 g固定化LGOX，機(jī)械攪拌，反應(yīng)條件為25 ℃、轉(zhuǎn)速120 r/min、通氣量2.0，反應(yīng)過程中用稀甲酸和氨水維持pH 7.0左右。

2 結(jié)果與討論

2.1 (NH4)2SO4分級沉淀

通過(NH4)2SO4分級沉淀去除部分雜蛋白，提高固定化后目的蛋白回收率，減少雜蛋白對α-KG制備的影響。以最高酶活為100%，分別測定不同飽和濃度(NH4)2SO4鹽析后上清液和沉淀的相對酶活，結(jié)果如圖1所示。由圖1可知：當(dāng)(NH4)2SO4飽和度在15%～35%時(shí)，酶活主要存在于上清液中，此時(shí)的鹽析作用還未將大量目的蛋白沉淀下來；當(dāng)(NH4)2SO4飽和度在45%～65%時(shí)，上清液中殘留酶活較少，沉淀中保留大量酶活，且在此濃度區(qū)間內(nèi)，上清液和沉淀中酶活相差不大，表明當(dāng)(NH4)2SO4飽和度達(dá)到45%時(shí)，幾乎可將目的蛋白完全沉淀下來，繼續(xù)提高(NH4)2SO4飽和濃度，不但不會(huì)提高對目的蛋白的鹽析作用，還會(huì)給目的蛋白帶來更多的雜蛋白，因此為選用45%(NH4)2SO4飽和度為最佳鹽析濃度。

圖1 粗酶液的(NH4)2SO4鹽析曲線Fig.1 Salting-out curves of ammonium sulfate for crude enzyme

2.2 固定化樹脂篩選

由于環(huán)氧樹脂形狀、孔徑、粒徑及表面的環(huán)氧基團(tuán)數(shù)目不同，導(dǎo)致目的酶蛋白與樹脂間結(jié)合位置不同，從而形成不同數(shù)目共價(jià)鍵，表現(xiàn)出不同的固定化效果。利用實(shí)驗(yàn)室已有的6種不同環(huán)氧樹脂對LGOX進(jìn)行固定化，結(jié)果如圖2所示。由圖2可知：ES-105與ES-103B固定化率較高，但ES-103B酶活回收率較低，盡管兩者固定化率相當(dāng)，可能由于酶蛋白與ES-103B發(fā)生了不規(guī)律共價(jià)結(jié)合，使一部分酶蛋白失去活性，導(dǎo)致固定化后酶活損失較多，ES-105固定化后比酶活最高，達(dá)26.9 U/g。因此，選用ES-105作為最佳固定化載體進(jìn)行下一步研究。

圖2 不同樹脂固定化效果Fig.2 Effects of different resin on immobilization of LGOX

2.3 樹脂加量對酶固定化的影響

在固定化酶的研究中，載體投放量應(yīng)與酶蛋白濃度維持在合適比例，載體量過高會(huì)造成樹脂浪費(fèi)，載體量過低會(huì)致使大部分酶蛋白未被結(jié)合，導(dǎo)致酶蛋白浪費(fèi)，進(jìn)而增加固定化成本。保持固定化其他條件不變，分別在20 mL固定化酶液中加入不同質(zhì)量ES-105樹脂，考察樹脂加量對固定化影響，結(jié)果如圖3所示。由圖3可知：隨著樹脂量的增加，固定化效果在提高，當(dāng)樹脂量為3.5 g時(shí)，樹脂與酶蛋白結(jié)合達(dá)到飽和，酶活回收率為85.9%，比酶活達(dá)到55.7 U/g，樹脂量繼續(xù)提高，固定化效果沒有明顯變化，比酶活反而逐漸降低，導(dǎo)致樹脂浪費(fèi)。因此，樹脂加量控制在20 mL的酶液(14 U/mL)加入3.5 g載體為最佳。

圖3 樹脂加量對固定化影響Fig.3 Effects of resin addition on immobilization of LGOX

2.4 緩沖液離子濃度對酶固定化影響

在環(huán)氧樹脂固定酶蛋白過程中，增加一定鹽離子會(huì)促進(jìn)酶蛋白結(jié)合在載體疏水表面，提高酶蛋白固定化效果。保持固定化其他條件不變，用不同濃度的K3PO4緩沖液與濃縮酶液混合，制備成初始酶濃度為14 U/mL的固定化酶液，取3.5 g ES-105樹脂與20 mL該酶液混合，考察緩沖液離子濃度對酶固定化的影響，結(jié)果如圖4所示。由圖4可知：隨著鹽離子濃度的提高，酶活回收率與比酶活均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，當(dāng)K3PO4緩沖液濃度為0.2 mol/L時(shí)，比酶活達(dá)到最高52.7 U/g。盡管已有高濃度鹽離子濃度有利于固定化，但在本研究中，酶活回收率在0.2～1.0 mol/L K3PO4濃度的范圍內(nèi)下降幅度較小，比酶活在0.2～0.6 mol/L范圍內(nèi)下降幅度較大，可能是由于目的蛋白在此范圍內(nèi)易出現(xiàn)鹽析或變性等現(xiàn)象，該現(xiàn)象占主導(dǎo)作用，導(dǎo)致部分酶活損失。因此，選用0.2 mol/L K3PO4緩沖液為固定化的最佳離子濃度。

圖4 緩沖液離子濃度對酶固定化影響Fig.4 Effects of phosphate buffer concentration on immobilization of LGOX

2.5 pH對酶固定化的影響

載體環(huán)氧基與酶蛋白表面氨基殘基能以共價(jià)結(jié)合方式進(jìn)行固定，酶液pH會(huì)影響酶蛋白的氨基酸殘基的解離狀態(tài)[12]，pH的改變可能會(huì)使更多酶蛋白表面氨基殘基與環(huán)氧基進(jìn)行共價(jià)結(jié)合，這可能會(huì)對酶蛋白構(gòu)象發(fā)生較大改變，進(jìn)而導(dǎo)致酶活下降。保持固定化其他條件不變，用不同pH的K3PO4緩沖液與濃縮酶液混合，制備成初始酶濃度為14 U/mL的固定化酶液，取3.5 g ES-105樹脂與20 mL該酶液混合，考察pH對酶固定化的影響，結(jié)果如圖5所示。由圖5可知：當(dāng)pH為7.0時(shí)比酶活達(dá)到最高值(52.5 U/g)，偏酸時(shí)pH對酶活影響較大；pH在7.0～9.0時(shí)，盡管其對游離酶蛋白酶活影響較小，但可能影響環(huán)氧基與酶蛋白表面氨基殘基共價(jià)結(jié)合，導(dǎo)致酶活回收率降低。因此，確定7.0為最佳固定化pH。

圖5 pH對酶固定化的影響Fig.5 Effects of pH on immobilization of LGOX

2.6 溫度對酶固定化的影響

溫度會(huì)影響酶蛋白的氨基酸殘基與環(huán)氧基發(fā)生反應(yīng)的進(jìn)程，溫度升高可以加速該反應(yīng)，但溫度過高可能會(huì)使酶蛋白變性。保持固定化其他條件不變，考察溫度對酶固定化的影響，結(jié)果如圖6所示。由圖6可知：隨著溫度升高，固定化酶活在20～25 ℃時(shí)上升幅度較大，且在25 ℃達(dá)到53.1 U/g；固定化酶活在25～35 ℃呈小幅下降趨勢，而35～40 ℃下降幅度較大，可能是游離酶長時(shí)間處于該溫度范圍易失活。因此，選用25 ℃作為最佳固定化溫度。

圖6 溫度對酶固定化的影響Fig.6 Effects of temperature on immobilization of LGOX

圖8 固定化酶催化L-谷氨酸反應(yīng)3 h和20 h的HPLC圖譜Fig.8 HPLC chromatographs in the course of oxidation of L-glutamic acid catalyzed by immobilized enzyme

2.7 固定化時(shí)間對酶固定化的影響

環(huán)氧樹脂可以通過單純物理吸附酶蛋白，也可通過環(huán)氧基與酶蛋白的氨基酸殘基共價(jià)結(jié)合。固定化時(shí)間太短，酶蛋白僅簡單吸附在樹脂表面，沒有足夠時(shí)間與載體共價(jià)結(jié)合，固定化酶穩(wěn)定性較差。保持固定化其他條件不變，分別測定初始固定化酶和洗脫后固定化酶的酶活，結(jié)果如圖7所示。由圖7可知：初始固定化酶比酶活隨著固定化時(shí)間增加而升高，固定化24 h后趨于穩(wěn)定，比酶活可達(dá)54.2 U/g。初始固定化時(shí)間在12～18 h時(shí)，比酶活較為穩(wěn)定；經(jīng)洗脫后，固定化時(shí)間為12～18 h時(shí)，比酶活呈明顯上升趨勢，洗脫后固定化12 h，比酶活比初始固定化12 h比酶活低了28.3%，而固定化18 h后的比酶活，兩者相差較小，可能是因?yàn)楣潭ɑ?～12 h時(shí)，仍有大部分酶蛋白與載體只是通過物理吸附在樹脂表面，酶蛋白容易被洗脫下來，隨著時(shí)間延長，共價(jià)結(jié)合起主導(dǎo)作用，此時(shí)酶蛋白難以被洗脫；固定化24 h后，再延長時(shí)間酶活基本保持不變。因此，以24 h作為最佳固定化時(shí)間。

圖7 固定化時(shí)間對酶固定化的影響Fig.7 Effects of time on immobilization of LGOX

2.8 固定化LGOX催化L-谷氨酸產(chǎn)α-KG

L-谷氨酸鈉經(jīng)固定化LGOX催化反應(yīng)20 h后，產(chǎn)物α-KG收率98.2%。利用HPLC分析反應(yīng)3 h和20 h的情況，結(jié)果如圖8所示。由圖8可知：反應(yīng)20 h，轉(zhuǎn)化液幾乎已無L-谷氨酸殘留，反應(yīng)較為徹底。

2.9 固定化LGOX操作穩(wěn)定性驗(yàn)證

固定化酶的操作穩(wěn)定性是衡量固定化酶成本的主要指標(biāo)，也是決定其是否具有工業(yè)化價(jià)值的主要因素[13]。按照1.8節(jié)方法，反應(yīng)20 h，對固定化LGOX進(jìn)行重復(fù)批次驗(yàn)證，結(jié)果如圖9所示。由圖9可知：固定化LGOX催化14批產(chǎn)物后，收率仍保持在90%以上，重復(fù)使用20批，收率有83.2%，由此可以說明樹脂與酶蛋白結(jié)合十分牢固，該固定化酶具有良好的操作穩(wěn)定性。

圖9 固定化酶操作穩(wěn)定性Fig.9 Recycling experiment for immobilized LGOX

3 結(jié)論

通過(NH4)2SO4沉淀對破壁后LGOX粗酶液進(jìn)行鹽析，確定了(NH4)2SO4鹽析的最佳飽和度為45%。通過使用不同環(huán)氧樹脂對LGOX進(jìn)行固定化，研究比較發(fā)現(xiàn)，ES-105為最佳固定化載體，最優(yōu)固定化條件：樹脂加量為20 mL酶液(14 U/mL)加入3.5 g載體，K3PO4緩沖液濃度為0.2 mol/L，pH 7.0，固定化溫度25 ℃，固定化時(shí)間24 h，使用上述方法制備的固定化酶的酶活回收率為85.9%，比酶活55.7 U/g。當(dāng)L-谷氨酸鈉質(zhì)量濃度為100 g/L、反應(yīng)20 h時(shí)，α-KG收率為98.2%。該固定化重復(fù)使用14批后，產(chǎn)物收率仍有90%以上，重復(fù)使用20批，收率有83.2%。因此，使用上述工藝制備的固定化LGOX具有良好的工業(yè)應(yīng)用前景。