玉米MATE基因在植物生長發(fā)育和下胚軸伸長中的調(diào)控作用

薛盛祥,賈 敏，郁 飛

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

多藥及有毒化合物外排家族(multidrug and toxic compound extrusion,MATE)蛋白是具有高保守性的陽離子次級轉(zhuǎn)運蛋白，古細(xì)菌、細(xì)菌和真核生物中都存在該蛋白家族[1]。MATE蛋白依賴H+或Na+形成的跨膜電化學(xué)動力勢能，以主動運輸方式轉(zhuǎn)運細(xì)胞內(nèi)小分子化合物[2]。植物中MATE蛋白分布廣泛，在模式植物擬南芥中已發(fā)現(xiàn)有56個MATE家族蛋白[3]。在植物中的研究發(fā)現(xiàn)，MATE蛋白參與眾多生理功能，包括次級代謝產(chǎn)物生物堿和類黃酮等的積累[4-6]、鐵離子運輸[7-8]、抗鋁毒脅迫[9]、病原體抗性[10-11]、重金屬抗毒性[12]、植物器官發(fā)生[13-14]等。隨著對MATE蛋白家族研究的深入，越來越多的MATE蛋白被發(fā)現(xiàn)，但是對于MATE蛋白家族的功能了解卻非常有限。在玉米中已報道的MATE家族蛋白有ZmMATE1和ZmMATE2，二者參與玉米抗鋁毒作用[15]，MATE轉(zhuǎn)運蛋白BIGE1參與玉米器官發(fā)生和器官大小的調(diào)控[16]。目前對玉米中MATE家族蛋白的研究還很少，而玉米是我國最重要的糧食、飼料和工業(yè)原料作物之一，MATE家族蛋白參與了植物生長階段的諸多生理功能調(diào)控，所以對玉米MATE家族蛋白的研究意義重大。

玉米全基因組測序在2009年已經(jīng)完成[17]，為玉米基因的研究提供了極大便利。Suzuki等[16]在2015年發(fā)現(xiàn)，玉米MATE轉(zhuǎn)運蛋白BIGE1功能缺失會導(dǎo)致植株葉片和根的發(fā)生速率加快，并且使玉米種子胚盾片增大。而BIGE1在擬南芥中的高度同源蛋白ABS3的過表達(dá)突變體abs3-1D，也表現(xiàn)出葉片發(fā)生速率加快表型[18]。兩個高度同源的MATE蛋白在各自所屬物種中對于葉片的發(fā)生速率分別產(chǎn)生了相反的影響，這在以往的研究中是很少見的。由于ZmMATE884蛋白部分定位于高爾基體/內(nèi)體，猜測玉米MATE蛋白還可能參與了內(nèi)膜運輸過程或細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)途徑[19-21]。因此，本研究以玉米BIGE1高度同源基因ZmMATE884為對象，探討ZmMATE884(GRMZM2G423884)在植物生長發(fā)育階段的功能，以期為玉米MATE家族蛋白的研究提供新思路和新方向。

1 材料與方法

1.1 植物材料

擬南芥野生型為Columbia(Col)生態(tài)型，abs3-1D擬南芥突變體由西北農(nóng)林科技大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院郁飛教授提供，玉米組織材料取自玉米(Zeamays)自交系B73。

1.2 玉米DNA的提取和基因克隆

采用CTAB法提取玉米B73植株葉片總基因組DNA。從MaizeGDB數(shù)據(jù)庫下載得到玉米ZmMATE884基因，發(fā)現(xiàn)該基因不具有內(nèi)含子，因此設(shè)計引物(表1)直接以玉米基因組DNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)程序為:98 ℃ 10 s,53 ℃ 15 s,72 ℃ 2 min 40 s,40個循環(huán)。PCR反應(yīng)體系50 μL：5×Primer STAR Buffer 10 μL,2.5 mmol/L dNTP Mix 4 μL,DMSO 5 μL,正向、反向引物各1 μL, gDNA 1 μL,Primer STAR DNA聚合酶0.5 μL,蒸餾水27.5 μL。PCR產(chǎn)物經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳后切膠回收，用XbaⅠ酶切后連接至pUC18HE-NGFP載體[22]，由生物科技公司測序校對。

1.3 系統(tǒng)進(jìn)化分析與蛋白同源性比對

從TAIR(https://www.Arabidopsis.org/)數(shù)據(jù)庫下載56個已報道的擬南芥MATE轉(zhuǎn)運蛋白家族成員的蛋白序列，再從MaizeGDB(http://www.maizegdb.org/)數(shù)據(jù)庫下載得到玉米MATE轉(zhuǎn)運蛋白家族ZmMATE877(GRMZM2G135877)、ZmMATE884(GRMZM2G423884)和ZmMATE937(GRMZM2G148937)的基因序列。采用鄰接法，通過MEGA 6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

運用EMBL數(shù)據(jù)庫中的Clustal Omega程序(http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/)，將ZmMATE884、ZmMATE937與PfMATE[23]的蛋白序列進(jìn)行多序列比對，之后使用ExPasy上的Box Shade(http://www.ch.embnet.org/software/BOX_form.html)工具進(jìn)行修飾，將相同區(qū)域用黑色標(biāo)出，相似區(qū)域用灰色標(biāo)出。

表1 本研究所用引物及其序列Table 1 Primers and their sequences used in this article

1.4 玉米不同組織RNA的提取和基因表達(dá)分析

采用CTAB-PVP法提取玉米根、氣根、莖、上枝葉、下枝葉、包葉、花穗、雌蕊、雄蕊、授粉后40 d胚、授粉后40 d胚乳3個生物學(xué)重復(fù)樣本的總RNA。取5 μL RNA稀釋100倍后測波長260 nm處吸光值A(chǔ)260，再將A260乘以4 000得到RNA質(zhì)量濃度(ng/μL)。根據(jù)Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit (Roche)操作說明書，吸取1 μg的RNA 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，由之前測得的RNA質(zhì)量濃度計算所需要的RNA樣品體積，以GAPDH基因為內(nèi)參進(jìn)行定量RT-PCR，從基因轉(zhuǎn)錄水平分析該基因的組織特異性表達(dá)模式，從而了解該基因的可能作用機制。

1.5 ZmMATE884和ZmMATE937蛋白的亞細(xì)胞定位

植物MATE轉(zhuǎn)運蛋白大多定位于細(xì)胞液泡膜上[3,6]，但近年來有較多研究認(rèn)為MATE轉(zhuǎn)運蛋白定位在細(xì)胞膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和葉綠體上[9,12,24]。為研究玉米MATE蛋白ZmMATE884和ZmMATE937在植物中的亞細(xì)胞定位，設(shè)計引物(表1)進(jìn)行ZmMATE884和ZmMATE937基因全長ORF序列的克隆，再分別構(gòu)建相應(yīng)熒光蛋白融合表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化擬南芥葉肉細(xì)胞原生質(zhì)體，利用原生質(zhì)體瞬時表達(dá)系統(tǒng)對ZmMATE884和ZmMATE937蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位研究。為此，構(gòu)建ZmMATE884和ZmMATE937蛋白C端融合綠色熒光蛋白瞬時表達(dá)載體P35S∷ZmMATE884-GFP和P35S∷ZmMATE937-GFP。將這2個融合表達(dá)載體分別與本實驗室構(gòu)建的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)特異標(biāo)志蛋白融合標(biāo)簽蛋白的瞬時表達(dá)載體，共轉(zhuǎn)化野生型擬南芥的葉肉細(xì)胞原生質(zhì)體[25]，22 ℃孵育8～16 h后利用激光共聚焦顯微鏡觀察熒光信號。本研究進(jìn)行如下共轉(zhuǎn)化試驗：P35S∷ZmMATE884-GFP與P35S∷mCherry-ARA7，P35S∷ZmMATE937-GFP與P35S∷m-Cherry-ARA7，P35S∷ZmMATE884-GFP與P35S∷mCherry-RabA5d，P35S∷ZmMATE937-GFP與P35S∷mCherry-RabA5d，P35S∷ZmMATE884-GFP與P35S∷mCherry-RabD2a。

1.6 擬南芥ZmMATE884基因過表達(dá)轉(zhuǎn)基因系的建立

在與ZmMATE884屬于同一進(jìn)化分支的9個擬南芥MATE蛋白中，已報道ABS3(At4g29140)、ABS4(At1g58340)、ABS3L1(At5g19700)和ABS3L2(At5g52050)基因過表達(dá)株系均表現(xiàn)為葉片發(fā)生速率加快、植株矮化叢生[18]。由于該分支4個基因的過表達(dá)都對植物產(chǎn)生了相似影響，且ZmMATE884基因同屬于這一分支，為研究該基因是否也具有相似功能，克隆ZmMATE884基因的全長ORF序列，利用二元表達(dá)載體pBI111L[22]構(gòu)建含3個強CaMV 35S啟動子且融合玉米ZmMATE884基因的二元表達(dá)載體。然后將構(gòu)建得到的重組二元表達(dá)載體電轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101，利用農(nóng)桿菌蘸花侵染法侵染野生型擬南芥植株。將轉(zhuǎn)基因T1代種子經(jīng)體積分?jǐn)?shù)75%乙醇和50%的84消毒液加0.1% Triton-X100消毒處理后，蒸餾水漂洗干凈，4 ℃黑暗冷處理3 d后于Kan+抗性的MS培養(yǎng)基上篩選轉(zhuǎn)基因植物，7 d后將具有Kan抗性的植株移栽于營養(yǎng)土中生長，收獲T2代種子。T2代轉(zhuǎn)基因植株矮化叢生，因此以矮化叢生為表型鑒定標(biāo)準(zhǔn)，再經(jīng)多代自交表型鑒定后收取T5代表型不分離轉(zhuǎn)基因株系種子，從而得到ZmMATE884基因的過表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系。

分別取生長2周的野生型和ZmMATE884過表達(dá)系1～3號整株植株樣品，參照Invitrogen公司的Trizol試劑盒RNA提取說明書進(jìn)行擬南芥植株RNA提取。采用1.4節(jié)方法檢測RNA樣品質(zhì)量濃度，根據(jù)Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit (Roche)操作說明書，吸取1 μg RNA 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。采用ACTⅡ基因作內(nèi)參進(jìn)行半定量RT-PCR，鑒定轉(zhuǎn)基因株系是否有ZmMATE884基因表達(dá)。

1.7 各基因型擬南芥幼苗下胚軸表型觀測

玉米MATE蛋白ZmMATE884的高度同源蛋白ABS3參與調(diào)控植物下胚軸伸長[18]，為進(jìn)一步研究分析玉米MATE轉(zhuǎn)運蛋白在生長發(fā)育過程中的功能，選取ABS3蛋白的對應(yīng)過表達(dá)株系abs3-1D作為共同試驗對象，觀察ZmMATE884基因過表達(dá)對植物下胚軸伸長的影響。將WT、abs3-1D和ZmMATE884基因過表達(dá)系植物種子裝于1.5 mL 離心管內(nèi)，經(jīng)消毒處理后用蒸餾水反復(fù)漂洗，再將種子懸于蒸餾水中4 ℃黑暗處理3 d。3 d后將種子分別種植在含質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%蔗糖或無蔗糖的1/2 MS固體培養(yǎng)基上，22 ℃、100 μmol/(m2·s)持續(xù)光照1 h后，將培養(yǎng)皿用鋁箔紙包裹，放入封閉紙盒22 ℃豎直培養(yǎng)，在黑暗培養(yǎng)6 d后取出拍照，記錄表型并觀察下胚軸生長情況。光下植物下胚軸表型的觀察，則是在種子種于固體培養(yǎng)基后用封口膜密封培養(yǎng)皿，然后于22 ℃、100 μmol/(m2·s)持續(xù)光照培養(yǎng)7 d，拍照記錄表型。使用Image J 軟件測量照片中植物下胚軸長度，采用t檢驗法對不同基因型植物的下胚軸長進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 ZmMATE884蛋白系統(tǒng)進(jìn)化分析與同源性比對

由圖1可以看出，ZmMATE877、ZmMATE884和ZmMATE937與擬南芥MATE轉(zhuǎn)運蛋白家族具有很高的同源性，與其中9個擬南芥MATE蛋白屬于同一個進(jìn)化分支，具有較近的親緣關(guān)系。

橢圓形中分別為ZmMATE877(GRMZM2G135877)、ZmMATE884(GRMZM2G423884)和ZmMATE937(GRMZM2G148937)在56個擬南芥MATE蛋白家族中的位置，比例尺表示氨基酸替換率Oval circle shows the positions of ZmMATE877 (GRMZM2G135877),ZmMATE884 (GRMZM2G423884) and ZmMATE937 (GRMZM2G148937) in the 56 Arabidopsis MATE proteins family,and the scale shows amino acid replacement rate圖1 ZmMATE877，ZmMATE884和ZmMATE937與擬南芥MATE轉(zhuǎn)運蛋白家族的進(jìn)化樹Fig.1 Phylogenetic tree of ZmMATE877,ZmMATE884 and ZmMATE937 with Arabidopsis MATE transporter family

蛋白同源比對結(jié)果(圖2)表明，ZmMATE884與ZmMATE937有很高的同源性，且二者與PfMATE[23]相似度均較高，故可由PfMATE蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域推測ZmMATE884和ZmMATE937的可能跨膜結(jié)構(gòu)域。

“consensus”一行表示蛋白之間氨基酸的相似度，部分相似用“.”表示，全部相同用“*”表示The “consensus” line represents the amino acid similarity between proteins,“.” stands for partially similar,“*” stands for completely same圖2 ZmMATE884、ZmMATE937與PfMATE的蛋白同源比對及跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測Fig.2 Homologous alignment of ZmMATE884 and ZmMATE937 with PfMATE protein and transmembrane domains prediction

2.2 ZmMATE884基因在玉米不同組織中的表達(dá)

以GAPDH基因作為內(nèi)參進(jìn)行定量PCR分析，由圖3可見，ZmMATE884基因在玉米根、下枝葉、上枝葉和胚的相對表達(dá)量較高，表明該基因可能參與了玉米生長發(fā)育過程中根、枝葉及授粉后胚的生長發(fā)育調(diào)控。

圖3 ZmMATE884基因在玉米B73植株不同組織中的表達(dá)Fig.3 Expression of ZmMATE884 gene in different tissues of maize B73

2.3 ZmMATE884蛋白的亞細(xì)胞定位

亞細(xì)胞定位結(jié)果(圖4)顯示，ZmMATE884-GFP和ZmMATE937-GFP在細(xì)胞中的熒光信號為小點狀離散分布于細(xì)胞的大部分區(qū)域；ZmMATE937-GFP不能與原液泡/次級內(nèi)體標(biāo)志蛋白mCherry-ARA7[26]共定位(圖4-A)，但可以和內(nèi)體/再循環(huán)內(nèi)體特異標(biāo)志蛋白mCherry-RabA5d[26]部分共定位(圖4-B)；ZmMATE884-GFP既不能與原液泡/次級內(nèi)體標(biāo)志蛋白mCherry-ARA7[26]共定位(圖4-C)，也不能與內(nèi)體/再循環(huán)內(nèi)體特異標(biāo)志蛋白mCherry-RabA5d[26]共定位(圖4-D)；ZmMATE-884-GFP可與高爾基/內(nèi)體上的標(biāo)志蛋白mCherry-RabD2a[26]部分共定位(圖4-E)。上述結(jié)果表明，ZmMATE884和ZmMATE937分別定位于內(nèi)體形成運輸過程中不同階段的內(nèi)體結(jié)構(gòu)上。由此推測ZmMATE884和ZmMATE937蛋白可能參與細(xì)胞內(nèi)膜系統(tǒng)運輸過程，同時也參與著依賴胞吞機制的物質(zhì)代謝過程[19-21]。

A.ZmMATE937-GFP和mCherry-ARA7瞬時轉(zhuǎn)化野生型擬南芥葉肉細(xì)胞原生質(zhì)體；B.ZmMATE937-GFP和mCherry-RabA5d瞬時轉(zhuǎn)化野生型擬南芥葉肉細(xì)胞原生質(zhì)體；C.ZmMATE884-GFP和mCherry-ARA7瞬時轉(zhuǎn)化野生型擬南芥葉肉細(xì)胞原生質(zhì)體；D.ZmMATE884-GFP和mCherry-RabA5d瞬時轉(zhuǎn)化野生型擬南芥葉肉細(xì)胞原生質(zhì)體；E.ZmMATE884-GFP和mCherry-RabD2a瞬時轉(zhuǎn)化野生型擬南芥葉肉細(xì)胞原生質(zhì)體；F和G.分別為在merge 圖B、E 中，白線經(jīng)過的像素點上綠色和紅色熒光信號強度的量化圖。圖中‘GFP’一列是綠色熒光信號；‘mCherry’一列是紅色熒光信號；‘merge’一列是綠色與紅色熒光信號疊加效果；‘DIC’一列是明場視野下的原生質(zhì)體。圖中展示均為單個原生質(zhì)體細(xì)胞A.Transient co-expression of ZmMATE937-GFP and mCherry-ARA7；B.Transient co-expression of ZmMATE937-GFP and mCherry-RabA5d；C.Transient co-expression of ZmMATE884-GFP and mCherry-ARA7；D.Transient co-expression of ZmMATE884-GFP and mCherry-RabA5d；E.Transient co-expression of ZmMATE884-GFP and mCherry-RabD2a；F,G.Co-localization analysis plots for merged images in B and E,respectively.Plots were generated by tracking the relative intensities of GFP and mCherry fluorescent signals marked by white lines in merged images using the ‘plot profile’ function of ImageJ.In the figure,the ‘GFP’ column is a green fluorescent signal,the ‘mCherry’ column is a red fluorescent signal,the ‘merge’ column is a green and red fluorescent signal superimposed effect,and the ‘DIC’ is bright field view of the protoplasts.All are for a single protoplast cell圖4 ZmMATE884和ZmMATE937在擬南芥葉肉細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位Fig.4 Subcellular localization of ZmMATE884 and ZmMATE937 in Arabidopsis mesophyll cell

2.4 ZmMATE884過表達(dá)轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的表型及半定量RT-PCR

由表型觀察可知，ZmMATE884過表達(dá)轉(zhuǎn)基因擬南芥植株蓮座葉發(fā)生速率較野生型快，在野生型只有6片真葉時，過表達(dá)系已經(jīng)長出7片真葉。同時，ZmMATE884過表達(dá)植株開花時間較野生型明顯提前(圖5-A,B)。半定量RT-PCR結(jié)果顯示，野生型植株中ZmMATE884基因無表達(dá)，而過表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株中ZmMATE884基因有明顯表達(dá)(圖5-C)。另外，ZmMATE884過表達(dá)系1號、2號、3號的開花時間存在一定差異(圖5-A)，推測這可能與農(nóng)桿菌介導(dǎo)的T-DNA插入轉(zhuǎn)基因植物中目的基因表達(dá)不穩(wěn)定及T-DNA插入位點有差異有關(guān)。上述結(jié)果表明，玉米MATE蛋白家族基因ZmMATE884在擬南芥中的過表達(dá)，可使植物生長發(fā)育速率加快，開花提前，與已經(jīng)報道的ABS3基因過表達(dá)突變體有相似特征[18]，說明玉米ZmMATE884基因參與了植物生長發(fā)育的調(diào)控。

2.5 ZmMATE884基因過表達(dá)植株的下胚軸表型

2.5.1 參與黑暗中下胚軸伸長的負(fù)調(diào)控 在固體培養(yǎng)基上黑暗培養(yǎng)6 d,不同基因型植物萌發(fā)后下胚軸的伸長情況見圖6。

A.添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%蔗糖1/2 MS培養(yǎng)基上黑暗生長6 d的野生型(WT)、abs3-1D和ZmMATE884基因的2個獨立過表達(dá)系表型；B.不添加蔗糖1/2 MS培養(yǎng)基上黑暗生長6 d的野生型(WT)、abs3-1D和ZmMATE884基因的2個獨立過表達(dá)系表型；C.分別在不添加蔗糖和添加添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%蔗糖1/2 MS固體培養(yǎng)基中黑暗生長6 d的野生型(WT)、abs3-1D和ZmMATE884基因2個獨立過表達(dá)系下胚軸的平均長度。利用t檢驗進(jìn)行顯著性分析(n≥30),“**”表示P≤0.001A.Phenotypes of WT,abs3-1D and ZmMATE884 overexpressing lines grown on the 1/2 MS solid medium supplemented with 1% sucrose for 6 days in the dark;B.Phenotypes of WT,abs3-1D and ZmMATE884 overexpressing lines grown on the 1/2 MS solid medium without sucrose for 6 days in the dark;C.The average hypocotyls lengths of WT,abs3-1D and ZmMATE884 gene two independent overexpressing lines grown in 1/2 MS solid medium in the dark for 6 days.Using t test for significant analysis (n≥30),“**”stands for P≤0.001圖6 野生型、ZmMATE884基因過表達(dá)轉(zhuǎn)基因擬南芥植株與abs3-1D在黑暗條件下生長6 d后的下胚軸表型Fig.6 Hypocotyl type of wild type,ZmMATE884 gene overexpression transgenic Arabidopsis plants and abs3-1D in the dark for 6 days

由圖6可以看出，在不添加蔗糖的1/2 MS培養(yǎng)基上,黑暗環(huán)境下生長的轉(zhuǎn)基因植物的下胚軸長度明顯短于野生型，表明其下胚軸的伸長受到抑制(圖 6-B,C)。在添加1%蔗糖的1/2 MS培養(yǎng)基上，黑暗環(huán)境中生長的轉(zhuǎn)基因植物的下胚軸長度較不添加蔗糖時的顯著增長，但低于野生型(圖 6-A,C)。上述結(jié)果表明，在黑暗環(huán)境下，ZmMATE884基因過表達(dá)會抑制植物下胚軸的伸長，添加外源蔗糖可以促進(jìn)下胚軸伸長，但與野生型相比，過表達(dá)系植株下胚軸伸長仍然受到明顯抑制。

2.5.2 參與光下下胚軸伸長的負(fù)調(diào)控 野生型、abs3-1D和ZmMATE884過表達(dá)系1號、2號植物光下生長7 d后下胚軸的伸長情況見圖7。由圖7可以看出，在不添加蔗糖的1/2 MS培養(yǎng)基上，光下生長的轉(zhuǎn)基因植物的下胚軸伸長較野生型明顯受到抑制(圖 7-A,C)。與無糖培養(yǎng)基相比，在添加1%蔗糖的1/2 MS培養(yǎng)基上生長的轉(zhuǎn)基因植物及野生型的下胚軸長度有所增長，但轉(zhuǎn)基因植物下胚軸伸長與野生型相比仍然受到抑制(圖 7-B,C)。上述結(jié)果表明，在光下生長時，ZmMATE884過表達(dá)植物下胚軸伸長受到抑制，添加外源蔗糖可以促進(jìn)下胚軸伸長，但與野生型相比，過表達(dá)系植株下胚軸伸長仍受到明顯抑制。

A.添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%蔗糖1/2 MS培養(yǎng)基上光下生長7 d的野生型(WT)、abs3-1D和ZmMATE884基因的2個獨立過表達(dá)系表型；B.不添加蔗糖1/2 MS培養(yǎng)基上光下生長7 d的野生型(WT)、abs3-1D和ZmMATE884基因的2個獨立過表達(dá)系表型；C.分別在不添加蔗糖和添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%蔗糖1/2 MS固體培養(yǎng)基中光下生長7 d的野生型(WT)、abs3-1D和ZmMATE884基因2個獨立過表達(dá)系下胚軸的平均長度。利用t檢驗進(jìn)行顯著性分析(n≥30)，“**”表示P≤0.001。A，B中標(biāo)尺為5 000 μmA.Phenotypes of WT,abs3-1D and ZmMATE884 overexpressing lines grown on the 1/2 MS solid medium supplemented with 1% sucrose for 7 days under constant light;B.Phenotypes of WT,abs3-1D and ZmMATE884 gene two independent overexpressing lines grown on the 1/2 MS solid medium without sucrose for 7 days under constant light;C.The average hypocotyls lengths of WT,abs3-1D and ZmMATE884 overexpressing lines grown in 1/2 MS solid medium for 7 days under constant light.The histogram shows the average “l(fā)ength±standard” deviation.Using t test for significant analysis (n≥30),“**”stands for P≤0.001.A,B.Bars:5 000 μm圖7 野生型、ZmMATE884基因過表達(dá)轉(zhuǎn)基因擬南芥植株與abs3-1D在光下生長7 d后的下胚軸表型Fig.7 Hypocotyl type of wild type,ZmMATE884 overexpression Arabidopsis transgenic plants and abs3-1D under constant light for 7 days

3 討論與結(jié)論

陽離子次級轉(zhuǎn)運MATE家族蛋白最早是在副溶血弧菌和大腸桿菌多藥外排蛋白鑒定中得到的，主要參與小分子化合物的跨膜轉(zhuǎn)運[27-28]。MATE普遍存在于細(xì)菌和真核生物中，隨著越來越多的MATE家族蛋白成員被鑒定，對于該家族蛋白的了解也逐步加深，但絕大多數(shù)MATE蛋白的功能仍不明確。在植物中，以擬南芥MATE蛋白的研究最為突出，如TT12基因參與花青素積累[29]、ALF5基因參與植物側(cè)根發(fā)育[30]、FRD3基因參與鐵離子運輸[31]等。而對于玉米MATE家族蛋白的研究較少，目前只有關(guān)于ZmMATE1和ZmMATE2基因參與玉米抗鋁毒作用[15]、BIGE1基因參與玉米器官發(fā)生和器官大小的調(diào)控[16]等少數(shù)研究報道。

本研究從MaizeGDB數(shù)據(jù)庫中得到玉米MATE家族蛋白基因ZmMATE884(GRMZM2G423884)的序列，將該基因克隆后建立了擬南芥ZmMATE884基因過表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系，對轉(zhuǎn)基因植物的表型分析發(fā)現(xiàn)，ZmMATE884基因過表達(dá)可導(dǎo)致植物蓮座葉發(fā)生速率加快、開花提前，說明該基因參與植物多個生長發(fā)育階段的調(diào)控，可以縮短植物的整個生長周期。半定量PCR結(jié)果表明，該基因在根、下枝葉和上枝葉中均有較高表達(dá)，推測該基因可能參與了玉米生長發(fā)育過程中根、枝葉的生長發(fā)育。通過與擬南芥56個MATE蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化分析，由MATE高保守性的特點，應(yīng)用蛋白同源比對初步預(yù)測了ZmMATE884蛋白的可能跨膜結(jié)構(gòu)域。

亞細(xì)胞定位分析發(fā)現(xiàn)，ZmMATE884蛋白部分定位于高爾基體/內(nèi)體上，推測該蛋白可能參與細(xì)胞內(nèi)膜系統(tǒng)的運輸過程，或參與依賴胞吞機制的物質(zhì)代謝過程，為玉米MATE蛋白的研究提供了新思路、新方向。對ZmMATE884蛋白轉(zhuǎn)基因植物在固體培養(yǎng)基中下胚軸長度表型的觀察結(jié)果表明，ZmMATE884基因參與了植物下胚軸的負(fù)調(diào)控。植物激素如生長素可以調(diào)控下胚軸伸長[32],而以高爾基體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和內(nèi)體等組成的植物內(nèi)膜系統(tǒng)在物質(zhì)運輸,如生長素運輸中起重要作用，進(jìn)而影響細(xì)胞伸長等生長發(fā)育過程[33-36]。本研究表明,ZmMATE884蛋白部分定位于高爾基體/內(nèi)體上，且ZmMATE884基因參與植物下胚軸伸長的負(fù)調(diào)控，推測該基因可能影響了植物激素的合成、運輸、應(yīng)答過程中的某一環(huán)節(jié)，從而調(diào)控植物下胚軸發(fā)育。今后應(yīng)進(jìn)一步研究ZmMATE884轉(zhuǎn)基因植物下胚軸伸長的抑制機理，分析轉(zhuǎn)基因植物中各植物激素的變化，以深入探討玉米MATE基因?qū)χ参锷L發(fā)育調(diào)控的可能分子機制。