白樺APETALA2基因啟動(dòng)子的克隆及其表達(dá)分析

趙 桐 胡曉晴 朱德財(cái) 田 晶 辛琪琪 劉雪梅

(東北林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150040)

APETALA2/ethylene-responsive element binding protein(AP2/EREBP)轉(zhuǎn)錄因子家族普遍存在于所有植物中，參與植株的生長(zhǎng)發(fā)育、脅迫應(yīng)答和多種生理生化反應(yīng)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。近年來(lái)，在動(dòng)物中也已經(jīng)發(fā)現(xiàn)其家族成員[1]。該家族中的AP2轉(zhuǎn)錄因子亞家族參與調(diào)控花、胚珠和種子的發(fā)育。APETALA2(AP2)基因是AP2亞家族的成員，作為花發(fā)育模型中的A類基因，參與植物花器官的發(fā)育過(guò)程，控制萼片和花瓣的生長(zhǎng)[2]。AP2基因與其他花發(fā)育基因不同，具有獨(dú)特的AP2結(jié)構(gòu)域[3]，該結(jié)構(gòu)域能識(shí)別DNA并結(jié)合。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，矮牽?；?Petuniahybrida)的AP2類基因?qū)ǖ陌l(fā)育產(chǎn)生影響[4]，在擬南芥(Arabidopsisthaliana)中過(guò)表達(dá)挪威云杉(Piceaabies)的PaAP2L2基因會(huì)阻礙植株生長(zhǎng)[5]，在雜交落葉松(Larix×marschlinsii)中發(fā)現(xiàn)的AP2同源類似物L(fēng)mAP2L1和LmAP2L2，直接影響其體細(xì)胞的胚胎發(fā)生和萌發(fā)[6]，蘋果(Maluspumila)的MAP2A基因，被發(fā)現(xiàn)在其多種組織中表達(dá)[7]，而玉米(ZeamaysL.)的AP2-like基因在18種組織中均表達(dá)[8]，水稻(Oryzasativa)的OsAP2-1基因在花和根中有較高表達(dá)[9]，不同植物中AP2基因的功能不盡相同，為研究AP2基因?qū)Π讟?BetulaplatyphyllaSuk.)生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程的影響，本試驗(yàn)通過(guò)克隆其特異性啟動(dòng)子展開(kāi)對(duì)其表達(dá)模式的研究。

白樺是我國(guó)東北地區(qū)重要的闊葉樹(shù)種，是國(guó)家科技支撐計(jì)劃研究的重點(diǎn)樹(shù)種之一，具有極高的研究和利用價(jià)值。因其具有纖維素含量高而木質(zhì)素含量低的優(yōu)良纖維性狀，白樺成為優(yōu)良的造紙?jiān)牧?，其光滑?xì)致的削面和富有韌性抗沖擊的特點(diǎn)，又使其成為極受歡迎的板材。白樺生長(zhǎng)周期和有性生殖周期較長(zhǎng)，雌雄花均為不完全花，且花器官退化為兩輪，花發(fā)育的關(guān)鍵階段歷時(shí)短，胚胎學(xué)上已對(duì)白樺生殖發(fā)育的研究有部分報(bào)道[10～13]，但對(duì)其內(nèi)在的分子機(jī)制還是研究甚少。本實(shí)驗(yàn)室先期已進(jìn)行了部分白樺花發(fā)育過(guò)程涉及的其他相關(guān)基因的克隆與研究，本試驗(yàn)在此基礎(chǔ)上，構(gòu)建BpAP2特異啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的GUS表達(dá)載體，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法，研究其組織表達(dá)模式，為后續(xù)更深入探究BpAP2基因在白樺生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的功能、分析白樺生殖發(fā)育機(jī)制、改良白樺遺傳育種奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

轉(zhuǎn)化材料為白樺四周齡組培苗第二和第三片葉、成年白樺的雌雄花及哥倫比亞擬南芥實(shí)生苗。DNA提取材料為白樺四周齡組培苗葉片，取材后液氮處理，隨即置于-80℃冰箱保存。

1.2 試劑

植物基因組DNA提取試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒以及普通質(zhì)粒小提試劑盒購(gòu)自北京天根公司。KOD FX Neo酶購(gòu)自TOYOBO公司、核酸分子量標(biāo)準(zhǔn)(DNAmarker ladder)、T4-DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶ClaⅠ和XbaⅠ等購(gòu)自NEB公司。GUS(β-葡萄糖苷酶,β-glucuronidase)組織化學(xué)染色底物5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D葡萄糖苷酸酯(X-Gluc)購(gòu)自Sigma公司。

1.3 方法

1.3.1 白樺BpAP2基因啟動(dòng)子的克隆和元件分析

根據(jù)已知的BpAP2基因序列(圖4)，與白樺基因組數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，得到啟動(dòng)子序列，命名為proBpAP2，設(shè)計(jì)含酶切位點(diǎn)的全長(zhǎng)引物F(CCATCGATTAGACGGAATAGACGCACTT，下劃線處為酶切位點(diǎn)ClaⅠ)和R(CGTCTAGAACGAGAACCCGAACAACT，下劃線處為酶切位點(diǎn)XbaⅠ)。以白樺組培苗葉片基因組為模板擴(kuò)增全長(zhǎng)啟動(dòng)子序列，PCR反應(yīng)程序參照TOYOBO KOD FX Neo說(shuō)明書：94℃，2 min；98℃，10 s；65℃，30 s，每循環(huán)降低0.5℃；68℃，35 s，共15次循環(huán)；98℃，10 s；50℃，30 s；68℃，35 s；共15次循環(huán)；68℃，7 min?？寺≈帘磉_(dá)載體pBI121-35S::GUS后測(cè)序鑒定，命名為pBI121-proBpAP2::GUS質(zhì)粒，利用PLACE(http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/signalscan.html)和PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)在線分析軟件進(jìn)行啟動(dòng)子元件分析。

1.3.2 農(nóng)桿菌滲透法轉(zhuǎn)化白樺及擬南芥

將構(gòu)建好的pBI121-proBpAP2::GUS質(zhì)粒用液氮法轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌EHA105菌株。參照李萌等[14]的方法侵染白樺，程序如下：培養(yǎng)菌液至OD600=0.5，用1/2MS液體培養(yǎng)基重懸菌體至OD600=0.8，將白樺組培苗葉片放入，25℃ 120 r·min-1培養(yǎng)2 d，每16 h更換1次新鮮1/2MS液體培養(yǎng)基。

擬南芥的轉(zhuǎn)化參照郭勇等[15]的方法，當(dāng)菌液OD600為0.6～0.7時(shí)，5 000 r·min-1離心7 min收集菌體。將擬南芥置于25%蔗糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的1/4MS高滲溶液中25℃下浸泡15 min，轉(zhuǎn)入OD600=1.0的侵染液中，25℃搖床內(nèi)120 r·min-1培養(yǎng)2.5 h，500 mmol·L-1甘露醇洗3 min，取出后置于共培養(yǎng)培養(yǎng)基上，放在(23±2)℃培養(yǎng)條件下培養(yǎng)72 h。

1.3.3 GUS染色

X-GLUC染色液配制和染色參照郭勇等[15]的方法，染液配方：200 mmol·L-1的磷酸緩沖液50 mL(pH=7.0)；100 mmol·L-1的Na2EDTA溶液10 mL，5 mmol·L-1的K3[Fe(CN)6]10 mL，5 mmol·L-1的K4[Fe(CN)6]10 mL，100% Triton-100 10 μL，X-GLUC 60 mg。將侵染后的擬南芥和白樺苗放入含有染液的50 mL離心管中，37℃黑暗染色過(guò)夜，卡諾固定液脫色1～3 h，觀察拍照，每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 白樺AP2啟動(dòng)子的獲得及表達(dá)載體構(gòu)建

以白樺組培苗DNA為模板PCR擴(kuò)增獲得長(zhǎng)度為2 308 bp的單一條帶(圖1)，測(cè)序后確認(rèn)為白樺AP2基因的啟動(dòng)子序列proBpAP2，將其與植物表達(dá)載體pBI121-35S::GUS重組后獲得proBpAP2特異啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的植物表達(dá)載體，命名為pBI121-proBpAP2::GUS(圖2)。

圖1 proBpAP2啟動(dòng)子片段的擴(kuò)增Fig.1 Amplification of proBpAP2 fragment M.DL5000 marker

圖2 proBpAP2-pBI121-GUS表達(dá)載體構(gòu)建示意圖Fig.2 pBI121-BpAP2::GUS expression vector construction diagram

2.2 白樺proBpAP2啟動(dòng)子序列分析及順式元件預(yù)測(cè)

利用PLACE和Plantcare在線軟件分析，發(fā)現(xiàn)proBpAP2啟動(dòng)子序列除含有大多數(shù)高等植物啟動(dòng)子共有的TATA Box和CAAT Box保守元件外，還包含大量光調(diào)控元件如3-AF1 binding site、Box4、BoxⅠ、CATT-motif、GA-motif、GAG-motif、GT1-motif、SP1、TCCC-motif、BoxⅡ、as-2-box、chs-CMA2b，另外還有涉及ABA響應(yīng)的CE3和ABRE，MeJA響應(yīng)的TGACG-motif和CGTCA-motif，GA3響應(yīng)的GARE-motif，低溫響應(yīng)的LTR元件，SA響應(yīng)的TCA-element，生長(zhǎng)素響應(yīng)的TGA-element(表1)及高轉(zhuǎn)錄水平作用元件。除上述響應(yīng)元件外，proBpAP2還具有節(jié)律調(diào)節(jié)元件，分生組織和胚乳表達(dá)元件以及厭氧誘導(dǎo)必需元件，因此，BpAP2可能具有多種生物學(xué)功能，參與復(fù)雜的植物發(fā)育過(guò)程。

2.3 白樺proBpAP2啟動(dòng)子活性分析

2.3.1 proBpAP2在擬南芥中的轉(zhuǎn)錄活性

將構(gòu)建好的pBI121-BpAP2::GUS融合表達(dá)載體及pBI121-35S::GUS在擬南芥中進(jìn)行農(nóng)桿菌侵染后，經(jīng)GUS組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，野生型擬南芥未著色，而被proBpAP2和35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的GUS基因在轉(zhuǎn)基因擬南芥整株苗中均有轉(zhuǎn)錄活性(圖3A)，35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的GUS片段轉(zhuǎn)化后著色程度比proBpAP2更深，說(shuō)明proBpAP2啟動(dòng)子可在擬南芥多種組織中驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)錄。另外，proBpAP2在花器官如花瓣、雄蕊和心皮中均有轉(zhuǎn)錄活性(圖3C)，在柱頭、心皮底端與花柄連接處著色更深，花藥和花絲的著色程度基本一致(圖3D)，在角果維管組織中也有較深著色(圖3E)?？梢?jiàn)，白樺BpAP2基因可能參與營(yíng)養(yǎng)器官和生殖器官的發(fā)育。

2.3.2 proBpAP2在白樺中的轉(zhuǎn)錄活性

為進(jìn)一步驗(yàn)證proBpAP2在同源表達(dá)系統(tǒng)中的活性，將其進(jìn)行白樺轉(zhuǎn)化，野生型未著色，而被35S和proBpAP2啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的GUS基因在轉(zhuǎn)基因白樺葉片中均有表達(dá)，但在proBpAP2驅(qū)動(dòng)下在葉脈處著色更明顯，說(shuō)明proBpAP2啟動(dòng)子在同源表達(dá)系統(tǒng)中同樣具有一定程度的啟動(dòng)活性。另外，對(duì)白樺組培苗的腋芽、根、莖進(jìn)行了轉(zhuǎn)化和活性分析，發(fā)現(xiàn)在整個(gè)根部的顏色都較深(圖3G)，在腋芽頂部著色較深，(圖3F)，在莖中著色較淺(圖3H)。除了營(yíng)養(yǎng)器官，在花器官和果實(shí)中也有一定轉(zhuǎn)錄活性。在種翅、退化的柱頭頂端(圖I)和雌花花柄(圖J)中的著色較深，而在成熟花藥中則很低(圖K)。以上結(jié)果進(jìn)一步證明，白樺AP2基因啟動(dòng)子proBpAP2在營(yíng)養(yǎng)器官和生殖器官中都具有一定活性。

表1 proBpAP2啟動(dòng)子序列元件分析Table 1 Analysis of proBpAP2 promoter sequence elements

圖3 proBpAP2在擬南芥和白樺中的活性分析 A.擬南芥；B.白樺葉片；C～E.擬南芥組織。C.花；D.雌蕊；E.角果；F～K.白樺組織。F.腋芽；G.根；H.莖段；I.雌花翅果；J.雌花花柄；K(i/ii).花藥Fig.3 Activity analysis of proBpAP2 in A.thaliana and B.platyphylla A. A.thaliana; B. B.platyphylla leaves; C-E. A.thaliana tissues(C. Flower; D. Pistil; E. Silique); F-K. B.platyphylla tissues(F. Axillary bud; G. Root; H. Stem segment; I. Samara of female flower; J. Floral shoot of female flower; K(i/ii). Anther)

圖4 BpAP2基因序列 起始密碼子和終止密碼子Fig.4 The sequence of the BpAP2 indicates the start codon and the stop codon

3 討論

高等植物的開(kāi)花過(guò)程受到光周期途徑、春化途徑、自主調(diào)節(jié)途徑、GA途徑和年齡途徑這五種開(kāi)花途徑調(diào)控。轉(zhuǎn)錄因子AP2和SQUAMOSA PROMOTER-BINDING PROTEIN-LIKE(SPL)與miR172共同作用，參與年齡調(diào)控途徑[16～18]。在本研究的白樺AP2啟動(dòng)子GUS活性檢測(cè)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，衰老葉片不易染色(未附圖)，這與相關(guān)文獻(xiàn)中描述的AP2基因會(huì)隨植物年齡的增長(zhǎng)而表達(dá)量下降相似[19]。proBpAP2驅(qū)動(dòng)的GUS基因在萼片、花瓣以及雌、雄蕊中均表達(dá)，說(shuō)明BpAP2基因可能不僅參與前兩輪花器官的發(fā)育[20～23]，也影響第三、四輪花器官的發(fā)育及開(kāi)花時(shí)間[5,22]。而在擬南芥角果中的表達(dá)說(shuō)明該基因可能與種子的發(fā)育也息息相關(guān)[24]。張妍等研究表明[25]，AP2基因在白樺的莖、葉、花序中都有表達(dá)，這與本實(shí)驗(yàn)中proBpAP2在白樺雌花、葉、莖等組織中表達(dá)的結(jié)果一致。另外，proBpAP2在白樺的成熟花藥中的啟動(dòng)活性較低，不同于在擬南芥中的異源轉(zhuǎn)化，因此，還需進(jìn)一步深入驗(yàn)證。

基因特異啟動(dòng)子對(duì)于基因功能的分析非常重要，白樺AP2基因啟動(dòng)子具有高等植物啟動(dòng)子的典型特征，能驅(qū)動(dòng)GUS基因在轉(zhuǎn)基因白樺和擬南芥中特異表達(dá)。該序列除了具有TATA-box、CAAT-box等真核生物的基本轉(zhuǎn)錄起始元件，還包括多種光響應(yīng)元件、參與各種激素調(diào)節(jié)的元件以及與植物生長(zhǎng)發(fā)育有關(guān)的元件如參與分生組織表達(dá)的CAT-box，胚乳表達(dá)的GCN4、Skn-1等，可見(jiàn)該啟動(dòng)子元件具有豐富的多樣性，可能涉及多種生長(zhǎng)發(fā)育和激素響應(yīng)過(guò)程，為后續(xù)構(gòu)建外源基因的高效表達(dá)載體提供了重要的表達(dá)元件參考，也為進(jìn)一步研究BpAP2在白樺中的表達(dá)特點(diǎn)和功能機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。此外,該啟動(dòng)子下游所包含的5′UTR區(qū)，對(duì)基因的表達(dá)調(diào)控也起著重要作用[26～29]。

4 結(jié)論

本研究克隆了白樺AP2基因啟動(dòng)子，命名為proBpAP2，其序列中存在大量的光響應(yīng)元件、激素響應(yīng)元件和低溫響應(yīng)元件等。該啟動(dòng)子在同源表達(dá)系統(tǒng)和異源表達(dá)系統(tǒng)中都具有表達(dá)活性，在擬南芥和白樺的營(yíng)養(yǎng)器官和生殖器官中均有不同程度的轉(zhuǎn)錄活性，為后續(xù)進(jìn)一步研究AP2基因在白樺花發(fā)育和營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)中的作用、白樺退化花器官的形成機(jī)制以及縮短白樺生殖發(fā)育時(shí)間和改良白樺的遺傳育種奠定了基礎(chǔ)，并為提高或改進(jìn)外源基因在不同表達(dá)系統(tǒng)中的表達(dá)效率提供可能。