銅綠假單胞菌YY24的異養(yǎng)硝化—好氧反硝化功能基因的研究

劉 興，李連星，薄香蘭，陳繼楚，周勝杰，王 軍，王立紅，陳成勛

( 1.天津農(nóng)學(xué)院，天津市水產(chǎn)生態(tài)及養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300384； 2.天津立達(dá)海水資源開發(fā)有限公司， 天津 300280； 3.鼎正動(dòng)物藥業(yè)(天津)有限公司，天津市飼用微生物制劑企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300383 )

近年來，諸多關(guān)于異養(yǎng)硝化—好氧反硝化菌研究已見報(bào)道，但其研究重點(diǎn)仍然聚焦在可行性分析運(yùn)用上的宏觀脫氮效果，針對(duì)異養(yǎng)硝化—好氧反硝化分子機(jī)制，即微觀方面的研究卻依然鮮見。異養(yǎng)硝化菌在脫氮過程中是通過硝化過程和反硝化過程兩個(gè)步驟完成的，每個(gè)過程都有不同的酶參與。硝化過程主要由氨單加氧酶和羥胺氧化酶參與[1]；反硝化過程中主要由硝酸鹽還原酶、亞硝酸還原酶、一氧化氮還原酶、一氧化二氮還原酶發(fā)揮效應(yīng)[2]。

銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa) YY24是在天津立達(dá)海水資源開發(fā)有限公司海水養(yǎng)殖池篩選獲得的脫氮高效細(xì)菌，研究結(jié)果表明，該菌在最佳生長條件下的氨氮去除率可達(dá)99.06%，脫氮率達(dá)到97.27%[3]。筆者以銅綠假單胞菌YY24為研究對(duì)象，就銅綠假單胞菌YY24的9種硝化反硝化基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增、鑒定及測序，從分子水平對(duì)銅綠假單胞菌YY24的異養(yǎng)硝化—好氧反硝化分子機(jī)制進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 菌種及培養(yǎng)基

銅綠假單胞菌YY24保存于本實(shí)驗(yàn)室，已測出的16S rDNA部分基因序列長度為1428 bp(NR_037000.1)[3]。YY24用30%甘油保存于-80 ℃冰箱中，使用時(shí)提前1 d活化培養(yǎng)。

異養(yǎng)硝化培養(yǎng)基：NH4Cl 0.5 g/L；檸檬酸鈉5.66 g/L；維氏鹽溶液50 mL；調(diào)節(jié)pH到7.0。

維氏鹽溶液：K2HPO45.0 g/L；MgSO4·7H2O 2.5 g/L；FeSO4·7H2O 0.05 g/L；MnSO4·4H2O 0.05 g/L；鹽度為15的海水(NaCl 15)。

所有培養(yǎng)基于121 ℃滅菌15 min，待培養(yǎng)基冷卻至室溫再使用。

1.2 主要儀器與試劑

1.2.1 主要儀器

Eppendorf梯度PCR儀(Mastercycle公司)，SN-NJ0601電泳凝膠成像分析系統(tǒng)(北京信諾萊伯儀器有限公司)，DYCP-44N快速凝膠電泳儀(北京市六一儀器廠)，SW-CJ-2FD超凈工作臺(tái)(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)，F(xiàn)A2104 1/1000電子天平(天津億諾科學(xué)儀器有限公司)，THX-83B恒溫?fù)u床(常州市國立實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)，BS-lE震蕩培養(yǎng)箱(金壇市環(huán)宇科學(xué)儀器廠)，UVmini-1240紫外可見分光光度計(jì)(東莞市塘廈眾和電子儀器設(shè)備商行)，LEGEND MACH 1.6R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(Thermo公司)，METTLER TOLEDO臺(tái)式pH計(jì)(上海升隆電子科技有限公司)，TOMY SX500高壓蒸汽滅菌鍋(上海麥森醫(yī)療科技有限公司)，Leica DM500光學(xué)顯微鏡(德國徠卡微系統(tǒng)有限公司)。

1.2.2 主要試劑

EB染色劑(TaKaRa)、TAE核酸電泳緩沖液(TaKaRa)、瓊脂糖(TaKaRa)、TE緩沖液(TaKaRa)、rTaq DNA Polymerass(TaKaRa)、10×PCR Buffer(Mg2+plus，TaKaRa)、dNTP Mixture(2.5 mol/L，TaKaRa)、DL 2000 DNA Marker(TaKaRa)、6×Loading Buffer(TaKaRa)。其他試劑均為分析純級(jí)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 DNA提取

DNA提取方法按照天根生化科技(北京)有限公司的細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.3.2 凝膠DNA回收

使用無菌的解剖刀對(duì)目的片段進(jìn)行切割，然后利用天根生化科技(北京)有限公司出產(chǎn)的普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒，進(jìn)行目的片段的純化，按其說明書進(jìn)行操作。

1.3.3 試劑配制

DL 23000 Marker：5 μL DL 2000 Marker+12.5 μL 6×Loading Buffer+57.5 μL TE緩沖液+0.8%的瓊脂糖凝膠，在60 ℃下預(yù)熱5 min，即可制成。

引物的稀釋：將引物放在4 ℃、12 000 r/min的離心機(jī)中離心5 min；將離心管輕慢打開，按標(biāo)簽上的要求加入去離子水，并稀釋至20 nmol；而后輕搖混勻，3000 r/min離心，使液體降至管底；引物置于-20 ℃下保存。

制膠過程：稱取0.2 g瓊脂糖，放入20 mL 1×TAE；放置在微波爐中加熱1 min，取出，加入2 μL EB染料，混勻，倒入模具中冷卻25 min，即可制成。

1.3.4 反應(yīng)體系

反應(yīng)體系見表1。

表1 PCR反應(yīng)體系

1.3.5 試驗(yàn)步驟

第一步，進(jìn)行細(xì)菌的培養(yǎng)(LB培養(yǎng)基)；第二步，使用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取細(xì)菌DNA，并凝膠電泳檢驗(yàn)DNA提取含量；第三步，使用已合成的特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并在凝膠成像系統(tǒng)中觀察記錄；第四步，使用普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒進(jìn)行切膠回收，再次進(jìn)行PCR擴(kuò)增；第五步，送金唯智生物科技有限公司檢測序列。

1.4 銅綠假單胞菌YY24硝化反硝化酶基因PCR反應(yīng)條件的確定

1.4.1 引物

YY24硝化反硝化酶基因鑒定所用引物：根據(jù)美國國立生物技術(shù)信息中心公布的9種假單胞菌屬的硝化反硝化基因序列，利用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)合成9對(duì)簡并性擴(kuò)增引物(表2)。引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。

表2 鑒定YY24硝化反硝化酶基因的引物

續(xù)表2

目的基因引物名稱引物序列(5'→3')目的產(chǎn)物大小/bpnirS[15]nirS 1F5'-CCTA(C/T)TGGCCGCC(A/G)CA(A/G)T-3'nirS 2R5'-CGTTGAACTT(A/G)CCGGT-3'890cnorB[15]cnorB 1F5'-CGNGARTTYCTSGARCARCC-3'cnorB 2R5'-CRTADGCVCCRWAGAAVGC-3'669qnorB[15]qnorB 1F5'-GGNCAYCARGGNTAYGA-3'qnorB 2R5'-GGNGGRTTDATCADGAANCC-3'637nosZ[15]nosZ 1F5'-CGYTGTTCMTCGACAGCCAG-3'nosZ 2R5'-CATGTGCAGNGCRTGGCAGAA-3'700nifHnifH 1F5'-GAACTCGGCAAGAAGGTCAT -3'nifH 2R5'-CGTAGAAGACGAAGTCCAGGT-3'292

1.4.2 PCR擴(kuò)增

PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系見表3。

表3 PCR反應(yīng)體系

amoA的PCR程序：預(yù)變性95 ℃ 5 min，變性95 ℃ 60 s，退火50 ℃ 45 s，延伸72 ℃ 45 s，共30個(gè)循環(huán)，74 ℃ 10 min。

nifH的PCR程序：預(yù)變性94 ℃ 5 min，變性94 ℃ 60 s，退火53 ℃ 45 s，延伸72 ℃ 45 s，共30個(gè)循環(huán)，74 ℃ 10 min。

napA的PCR程序：預(yù)變性94 ℃ 5 min，變性94 ℃ 60 s，退火41 ℃ 45 s，延伸72 ℃ 45 s，共30個(gè)循環(huán)，74 ℃ 10 min。

narG的PCR程序：預(yù)變性95 ℃ 5 min，變性95 ℃ 60 s，退火40 ℃ 45 s，延伸72 ℃ 45 s，共30個(gè)循環(huán)，74 ℃ 10 min。

nirK的PCR程序：預(yù)變性94 ℃ 5 min，變性94 ℃ 60 s，退火56 ℃ 45 s，延伸72 ℃ 45 s，共30個(gè)循環(huán)，74 ℃ 10 min。

nirS的PCR程序：預(yù)變性95 ℃ 5 min，變性95 ℃ 60 s，退火50 ℃ 45 s，延伸72 ℃ 45 s，共30個(gè)循環(huán)，74 ℃ 10 min。

nosZ的PCR程序：預(yù)變性溫度94 ℃ 5 min，變性溫度94 ℃ 30 s，退火溫度50 ℃ 45 s，延伸溫度72 ℃ 60 s，共30個(gè)循環(huán)，72 ℃ 10 min。

qnorB的PCR程序：預(yù)變性95 ℃ 5 min，40個(gè)循環(huán)包括變性94 ℃ 60 s，退火50 ℃ 45 s，延伸72 ℃ 45 s，最后72 ℃ 10 min。

cnorB的PCR程序：預(yù)變性94 ℃ 4 min，變性94 ℃ 60 s，退火55 ℃ 45 s，延伸72 ℃ 60 s，共30個(gè)循環(huán)，72 ℃ 10 min。

PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物，通過瓊脂糖凝膠電泳初步檢測后，拍照保存，切膠回收，送至天津金唯智生物科技有限公司測序，并將結(jié)果在美國國立生物技術(shù)信息中心數(shù)據(jù)庫進(jìn)行在線比對(duì)。

1.4.3 統(tǒng)計(jì)方法

測序由金唯智生物科技有限公司完成，將測序結(jié)果提交GenBank數(shù)據(jù)庫檢索，根據(jù)Blast同源性比對(duì)的結(jié)果，用Mega 4.0進(jìn)行分析多序列比對(duì)，從核酸數(shù)據(jù)庫中下載具有代表性且同源性高的各基因氨基酸序列。

2 結(jié)果與分析

2.1 銅綠假單胞菌YY24硝化酶氨單加氧酶基因類型的確定

為確定銅綠假單胞菌YY24氨單加氧酶的基因類型及其是否具有硝化功能，對(duì)amoA的部分基因序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果見圖1。

圖1 銅綠假單胞菌YY24氨單加氧酶amoA基因電泳圖

由產(chǎn)物大小判斷，引物amoAF-amoAR得到了目的片段，片段長度為491 bp。通過克隆、測序后得到的amoA部分序列如下：

經(jīng)在線比對(duì)，序列長491 bp的amoA序列提交GenBank，序列號(hào)為CP019005.1。通過Blast在GenBank中進(jìn)行核酸比對(duì)，結(jié)果顯示，銅綠假單胞菌YY24的amoA基因與大腸桿菌(Escherichiacoli)的同源性最高，達(dá)到86%。amoA與其他氨單加氧酶基因具有較高的相似性，因而可以確定銅綠假單胞菌YY24具有硝化作用的功能基因amoA。

2.2 銅綠假單胞菌YY24反硝化酶基因類型的確定

2.2.1 硝酸還原酶Nar基因類型的確定

為確定銅綠假單胞菌YY24的硝酸還原酶基因類型，分別用引物napAF-napAR和narGF-narGR進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果見圖2。

圖2 銅綠假單胞菌YY24硝酸還原酶基因電泳a：周質(zhì)硝酸鹽還原酶基因； b：膜結(jié)合硝酸鹽還原酶基因.

由產(chǎn)物大小判斷，引物narGF-narGR得到了目的片段，而引物napAF-napAR未得到目的片段(目的產(chǎn)物應(yīng)為890 bp，而實(shí)際超過了1200 bp)。在第一次PCR后發(fā)現(xiàn)，得到的narG條帶含有非特異性條帶，因此又以第一次PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為模板進(jìn)行了第二次PCR后，切膠回收目的DNA條帶，通過克隆、測序后得到的narG部分序列如下：

經(jīng)在線比對(duì)，序列長1008 bp的narG序列提交GenBank，序列號(hào)為CP003071.1。通過Blast在GenBank中進(jìn)行核酸比對(duì)，結(jié)果顯示，銅綠假單胞菌YY24的narG基因與斯氏假單胞菌(P.stutzeri) RCH2的同源性最高，達(dá)到95%。narG與其他膜結(jié)合硝酸還原酶基因具有較高的相似性，因而可以確定銅綠假單胞菌YY24的硝酸還原酶基因是narG，而不是napA。

2.2.2 亞硝酸還原酶Nir基因類型的確定

為確定銅綠假單胞菌YY24的亞硝酸還原酶基因類型，分別用引物nirSF-nirSR和nirKF-nirKR進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果見圖3。

圖3 銅綠假單胞菌YY24亞硝酸還原酶基因電泳a：含銅型亞硝酸還原酶基因; b：細(xì)胞色素cd1型亞硝酸鹽還原酶基因.

由產(chǎn)物大小判斷，引物nirSF-nirSR得到了目的片段，引物nirKF-nirKR未得到目的片段(目的產(chǎn)物應(yīng)為514 bp，而實(shí)際約為1000 bp)。通過克隆、測序后得到的nirS部分序列如下：

序列長度通過Blast在GenBank中進(jìn)行核酸比對(duì)，結(jié)果顯示，銅綠假單胞菌YY24的nirS基因與現(xiàn)已報(bào)道的nirS基因序列有極大差別，導(dǎo)致利用引物對(duì)nirSF-nirSR不能擴(kuò)增出目的片段。將引物序列及兩端序列去掉，在Blast中megablast中尚未找到相似序列，但在Blastn中能夠找出相似度不高的序列，僅與微小鏈霉菌(Streptomycesparvulus) strain 2297有94%的相似度(序列號(hào)CP015866.1)。nirS與其他亞硝酸鹽還原酶基因不具有較高的相似性，但是其確實(shí)存在，因而初步斷定銅綠假單胞菌YY24的亞硝酸鹽還原酶基因是nirS，而不是nirK。

2.2.3 一氧化氮還原酶基因類型的確定

為確定銅綠假單胞菌YY24亞硝酸還原酶的基因類型，分別用引物qnorBF-qnorBR和cnorBF-cnorBR進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果見圖4。

圖4 銅綠假單胞菌YY24一氧化氮還原酶基因電泳a：cnorB基因； b：qnorB基因.

由產(chǎn)物大小判斷，引物qnorBF-qnorBR得到了目的片段，引物cnorBF-cnorBR未得到目的片段(目的產(chǎn)物應(yīng)為669 bp，而實(shí)際超過1000 bp)。在第一次PCR后發(fā)現(xiàn)，得到的qnorB條帶含有非特異性條帶，因此又以第一次PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為模板進(jìn)行了第二次PCR后，切膠回收目的DNA條帶，通過克隆、測序后得到的qnorB部分序列如下：

經(jīng)在線比對(duì)，序列長637 bp的qnorB序列提交GenBank，序列號(hào)為CP000446.1。通過Blast在GenBank中進(jìn)行核酸比對(duì)得知，銅綠假單胞菌YY24的qnorB基因與希瓦氏菌(Shewanellasp.) MR-4的同源性最高，達(dá)到90%。對(duì)比發(fā)現(xiàn)，qnorB與其他一氧化氮還原酶基因具有相似度較高，因此可以確定銅綠假單胞菌YY24的一氧化氮還原酶基因是qnorB，而不是cnorB。

2.2.4 一氧化二氮還原酶基因的確定

為確定銅綠假單胞菌YY24一氧化二氮還原酶的基因類型，用引物nosZF-nosZR對(duì)一氧化二氮還原酶的部分基因序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果見圖5。

圖5 銅綠假單胞菌YY24一氧化二氮還原酶基因電泳

由產(chǎn)物大小可以判斷出，引物nosZF-nosZR經(jīng)PCR后，得到了目的片段，片段長度為700 bp。通過克隆、測序后得到的nosZ部分序列如下：

經(jīng)在線比對(duì)，序列長700 bp的nosZ序列提交GenBank，序列號(hào)為AY957390.1。通過Blast在GenBank中進(jìn)行核酸比對(duì)，結(jié)果顯示，銅綠假單胞菌YY24的nosZ基因與斯氏假單胞菌的同源性最高，達(dá)到99%。nosZ與其他一氧化二氮還原酶基因具有較高的相似性，因而可以確定銅綠假單胞菌YY24的一氧化二氮還原酶基因是nosZ，主要產(chǎn)物是N2。

3 討 論

3.1 銅綠假單胞菌YY24硝化關(guān)鍵酶基因研究

氨單加氧酶是氨氮氧化成亞硝酸鹽的硝化作用中限制性步驟的關(guān)鍵酶[4]。氨單加氧酶是細(xì)菌體內(nèi)的一種三聚體膜結(jié)合蛋白，由amoA、amoB和amoC編碼的3個(gè)亞基組成[5]，其中amoA被公認(rèn)為該酶的活性位點(diǎn)，可將氨氧化為羥胺[6]。有研究發(fā)現(xiàn)，amoA基因在所有自養(yǎng)硝化菌中均有發(fā)現(xiàn)，并且由于菌株的不同，導(dǎo)致其amo基因也存在較大差異。異養(yǎng)硝化菌中是否含有氨單加氧酶基因可以通過PCR手段來判斷[7]。本試驗(yàn)利用兼并引物amoAF-amoAR[8]對(duì)銅綠假單胞菌YY24 DNA樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增的結(jié)果顯示，與銅綠假單胞菌YY24的amoA相似度最高的為大腸桿菌的氨氧化基因，且只有86%，與其他氨單加氧酶相似性也不高。因此，可以確定銅綠假單胞菌YY24的amoA序列具有較強(qiáng)特異性，氨單加氧酶于其他脫氮細(xì)菌也有較大差異。研究發(fā)現(xiàn)，氨單加氧酶不僅在不同屬的脫氮細(xì)菌中，而且在相同屬不同細(xì)菌中差異性也較顯著。Cao等[9]通過研究不同水體中6200條脫氮細(xì)菌氨單加氧酶amoA序列發(fā)現(xiàn)，不同環(huán)境中細(xì)菌的amoA序列有顯著差異。Van Kessel等[10]研究發(fā)現(xiàn)，amoA基因序列能夠執(zhí)行完整的硝化作用，打破了傳統(tǒng)的分步硝化理論。本試驗(yàn)通過對(duì)銅綠假單胞菌YY24中amoA基因片段的PCR擴(kuò)增的試驗(yàn)研究，確定了銅綠假單胞菌YY24中存在amoA基因，為后續(xù)研究銅綠假單胞菌YY24除氮功能提供參考依據(jù)。

3.2 銅綠假單胞菌YY24反硝化酶基因研究

硝酸鹽還原酶催化反硝化反應(yīng)的第一步，硝酸鹽還原酶主要有周質(zhì)硝酸還原酶和膜結(jié)合硝酸還原酶兩種存在形式。周質(zhì)硝酸鹽還原酶是一種二聚體類物質(zhì)，由NAPA和NAPB兩個(gè)亞單位結(jié)構(gòu)組成。napA基因負(fù)責(zé)編碼大亞基NAPA，而napB基因負(fù)責(zé)編碼小亞基NAPB[11]；周質(zhì)硝酸還原酶基因操縱子除了napA和napB基因之外，還存在1個(gè)napC基因。在有氧或者無氧條件下，由基因napA編碼的Nap催化中心部位均可實(shí)現(xiàn)其功能，且優(yōu)先表達(dá)于有氧條件下。膜結(jié)合硝酸鹽還原酶是由3個(gè)亞基組成的多體蛋白，結(jié)合在細(xì)胞膜的胞質(zhì)側(cè)[12]，分別由基因narG、narH和narI編碼，其中硝酸鹽還原作用位點(diǎn)及活性中心是narG編碼的α亞基。研究證明，周質(zhì)硝酸還原酶基因與膜結(jié)合硝酸還原酶基因沒有關(guān)聯(lián)，即相互獨(dú)立，互不影響[13]。銅綠假單胞菌YY24可能存在一種在好氧條件下仍具有活性的硝酸鹽還原系統(tǒng)，所以自身菌體可以利用NO3-在好氧條件下合成NO2-，因此推測這個(gè)酶可能是周質(zhì)硝酸鹽還原酶。筆者希望通過銅綠假單胞菌YY24大亞基基因napA的存在來證明該菌中存在硝酸鹽還原系統(tǒng)，所以利用引物napAF-napAR，通過PCR擴(kuò)增和測序，試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在銅綠假單胞菌YY24中未獲得了napA的特異片斷，這與報(bào)道的硝化反硝化菌(Acinetobactersp.)YY-5[14]不同，該菌株檢測出了napA的特異片斷。分析其可能原因是引物未選對(duì)或者退火溫度沒有達(dá)到要求。其后，利用另一種硝酸鹽還原酶nar基因narG的引物narGF-narGR進(jìn)行擴(kuò)增和測序，發(fā)現(xiàn)銅綠假單胞菌YY24含有narG的特異片斷，測序結(jié)果表明它與斯氏假單胞菌RCH2的同源性最高，達(dá)到95%。綜上所述，銅綠假單胞菌YY24存在膜結(jié)合硝酸鹽還原酶nar，不存在周質(zhì)硝酸鹽還原酶nap，推測銅綠假單胞菌YY24在缺氧環(huán)境中仍具有還原硝酸鹽的功能。

亞硝酸鹽轉(zhuǎn)化為一氧化氮的反應(yīng)是由亞硝酸鹽還原酶催化的，該反應(yīng)是反硝化作用的標(biāo)志性反應(yīng)，同時(shí)反硝化過程中最重要的限速步驟也是由亞硝酸鹽還原酶催化的這一反應(yīng)。亞硝酸鹽還原酶的存在方式主要有2種：細(xì)胞色素cd1型亞硝酸鹽還原酶和含銅型亞硝酸還原酶，分別由nirS基因和nirK基因編碼[15]。Braker等[16]認(rèn)為，nirS和nirK基因不會(huì)在同一菌株中同時(shí)出現(xiàn)，但是在同屬不同種的菌株中可以存在。本試驗(yàn)利用設(shè)計(jì)兩對(duì)引物nirSF-nirSR和nirKF-nirKR對(duì)銅綠假單胞菌YY24的DNA樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示，未檢測出nirK的特異片斷，檢測出nirS的特異片段，通過Blast在GenBank中進(jìn)行核酸比對(duì)，與銅綠假單胞菌YY24的nirS相似度最高的是微小鏈霉菌strain2297的脫氮基因，但只有94%，與其他亞硝酸鹽還原酶相似性也不是較高。研究表明，自然界中有30%的反硝化菌含有nirK基因，而假單胞菌中絕大多數(shù)含有nirS基因，并且在不同菌株中其形態(tài)結(jié)構(gòu)和分子大小相似，其中分布較多的是含nirS基因的細(xì)菌[17]。這一結(jié)論就是本試驗(yàn)的最好佐證，本試驗(yàn)所用菌株為銅綠假單胞菌，檢測出其亞硝酸還原酶的類型為細(xì)胞色素cd1型亞硝酸鹽還原酶nirS。

一氧化氮還原酶催化NO轉(zhuǎn)化為N2O的反應(yīng)，目前發(fā)現(xiàn)主要有2種：(1) cNor是一種由norB和norC基因編碼的2個(gè)亞基組成的異源二聚體寡聚酶，可用c型細(xì)胞色素作為電子供體；(2) qNor屬于單體酶，由qnorB基因編碼。研究表明，cnorB基因與qnorB基因相比并未表現(xiàn)出更高的多樣性[18]，同源性分析顯示，qNor與cNor有很高的同源性。常在有氧或者無氧條件下表達(dá)，在高含氧量和低pH值的環(huán)境中為反硝化的主要產(chǎn)物N2O。本試驗(yàn)利用設(shè)計(jì)兩對(duì)引物qnorBF-qnorBR和cnorBF-cnorBR對(duì)銅綠假單胞菌YY24的DNA樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示，未檢測出cnorB的特異片斷，檢測出qnorB的特異片段，通過Blast在GenBank中進(jìn)行核酸比對(duì)，與銅綠假單胞菌YY24的qnorB相似度最高的是希瓦氏菌MR-4的固氮基因，但只有90%，與其他一氧化氮還原酶相似性不高。銅綠假單胞菌B136-33的norB基因能夠在表達(dá)菌BL21中得到正確有效的表達(dá)[19]，這一報(bào)道從側(cè)面反映了銅綠假單胞菌具有norB基因，只是還未進(jìn)行更深層次的探索。綜上所述，本試驗(yàn)不僅證實(shí)了銅綠假單胞菌YY24存在一氧化氮還原酶norB，能夠?qū)O催化轉(zhuǎn)化為N2O，而且還確定了其基因類型是qnorB，并不是cnorB。

只有nosZ這一種基因可以編碼能夠?qū)2O還原成N2的一氧化二氮還原酶，其是反硝化作用最后一步反應(yīng)的關(guān)鍵酶，鄭燕等[20]研究環(huán)境樣品中反硝化細(xì)菌的功能標(biāo)志基因是nosZ。一氧化二氮還原酶是一種可溶性含銅離子蛋白酶，位于膜外周質(zhì)中，編碼nos的基因由3個(gè)轉(zhuǎn)錄單元組成：nosZ、nosR和nosDFYL，其中，結(jié)構(gòu)基因最大的是nosZ基因，常用來編碼催化亞基[21]，在低氧或缺氧條件下易表達(dá)，易受低pH值的抑制，對(duì)氧的敏感性也高于其他脫氮菌。本試驗(yàn)利用設(shè)計(jì)的引物nosZF-nosZR對(duì)YY24的DNA樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示，檢測出nosZ的特異片段(700 bp)，通過Blast在GenBank中進(jìn)行核酸比對(duì)，與銅綠假單胞菌YY24的nosZ相似度最高的是斯氏假單胞菌的nosZ基因，達(dá)99%。目前關(guān)于一氧化二氮還原酶的研究主要集中在酶學(xué)性質(zhì)及結(jié)構(gòu)方面，在細(xì)菌方面的報(bào)道還較少，目前僅在假單胞菌、芽孢桿菌(Bacillus)以及海桿菌(Mycobacterium)等少數(shù)幾種細(xì)菌中證實(shí)了nosZ的存在[22]。本試驗(yàn)也證實(shí)了楊立志等[22]的報(bào)道，通過對(duì)銅綠假單胞菌YY24中nosZ基因片段的PCR擴(kuò)增的試驗(yàn)研究，確定了銅綠假單胞菌YY24中存在nosZ基因，對(duì)后續(xù)研究銅綠假單胞菌YY24反硝化功能提供參考依據(jù)。

4 結(jié) 論

(1)確定amoA基因?yàn)殂~綠假單胞菌YY24硝化關(guān)鍵酶氨單加氧酶的編碼基因。

(2)確定銅綠假單胞細(xì)菌YY24存在膜結(jié)合硝酸鹽還原酶；亞硝酸還原酶的類型為細(xì)胞色素cd1型亞硝酸鹽還原酶nirS；銅綠假單胞菌YY24存在一氧化氮還原酶norB，能夠?qū)O催化轉(zhuǎn)化為N2O，而且還確定了其基因類型是qnorB；銅綠假單胞菌YY24中存在nosZ基因。