江鱈類志賀鄰單胞菌的分離鑒定及藥敏試驗(yàn)

張效平，楊 星，李小義，李正友，商寶娣

( 貴州省水產(chǎn)研究所，貴州 貴陽(yáng) 550025 )

江鱈(Lotalota)屬鱈形目、鱈科、江鱈屬，是鱈科魚(yú)類中唯一的淡水種類，分布于北緯45°以北的歐亞和北美內(nèi)陸水域，在我國(guó)僅分布于新疆額爾齊斯河及黑龍江水系上游，是我國(guó)冷水魚(yú)類珍稀物種，也是世界搶救性開(kāi)發(fā)的品種之一[1-2]。江鱈具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值、藥用價(jià)值和特殊的科學(xué)研究?jī)r(jià)值[3]。目前國(guó)內(nèi)外研究主要集中在江鱈的生物學(xué)特性、人工繁育及馴養(yǎng)等方面[4-7]，尚未見(jiàn)江鱈細(xì)菌性疾病的報(bào)道。我國(guó)已攻克了江鱈人工繁殖技術(shù)，可大批量培育出夏花魚(yú)種。貴州省安順市某養(yǎng)殖場(chǎng)于2013年從新疆建設(shè)兵團(tuán)引進(jìn)江鱈魚(yú)種進(jìn)行馴養(yǎng)。2014年7—8月，引進(jìn)的江鱈出現(xiàn)以“魚(yú)體瘦弱，進(jìn)食減少，體表發(fā)黑；離群獨(dú)游；下頜嚴(yán)重出血，腹部出血；鰭條腐爛；肝臟出血；腎臟有出血點(diǎn)；腸道內(nèi)無(wú)食物；部分魚(yú)頭后背部有破損”為主要癥狀的疾病反應(yīng)，持續(xù)時(shí)間為4周，約有50%的魚(yú)體發(fā)病并死亡。筆者從該養(yǎng)殖場(chǎng)取部分癥狀明顯的活體江鱈，實(shí)驗(yàn)室條件下從發(fā)病江鱈體內(nèi)分離得到菌株LLL-K-1，通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察、生理生化特性檢測(cè)、16S rDNA基因序列分析等試驗(yàn)結(jié)果鑒定該菌株為類志賀鄰單胞菌(Plesiomonasshigellode)。菌株LLL-K-1回歸感染健康江鱈，可表現(xiàn)出與自然發(fā)病江鱈相同的癥狀，并從瀕死江鱈體內(nèi)分離得到該菌，確定其為致病菌。并對(duì)致病菌的藥物敏感性進(jìn)行了研究，旨在為其防治提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)用魚(yú)

患病江鱈取自貴州省安順市某養(yǎng)殖場(chǎng)，體長(zhǎng)(15.2±0.4) cm。

人工感染試驗(yàn)所用江鱈購(gòu)于安順市另一未發(fā)病養(yǎng)殖場(chǎng)，試驗(yàn)用魚(yú)體色正常、體表無(wú)損傷、活力較好，平均體長(zhǎng)(15±1.0) cm，暫養(yǎng) 7 d后用于試驗(yàn)。

1.1.2 主要試劑及試劑盒

TSA培養(yǎng)基、TSB培養(yǎng)基、細(xì)菌微量生化鑒定管、MH培養(yǎng)基、藥敏試紙(購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司)；Primer Star HS DNA聚合酶、EasyTaq DNA聚合酶、dNTP 混合物、DNA Marker DL2000[大連寶生物工程(Takara)有限公司]；細(xì)菌DNA提取試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(天根生化科技公司)；細(xì)菌16S rDNA通用引物(27F：AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG和1492R：TAC GGT TAC CTT GTT ACG ACT T，生工生物工程股份有限公司合成)。

1.1.3 主要儀器

生化培養(yǎng)箱(LRH-250F)、PCR基因擴(kuò)增儀(BioRad)、核酸蛋白檢測(cè)儀(Eppendorf)、-80 ℃超低溫冰箱(海爾)、凝膠成像系統(tǒng)(Tanon)、全自動(dòng)高壓滅菌鍋(HVE-50， HIRAYAMA)、常量天平(TE601-L， Sartorius)、超凈工作臺(tái)(蘇凈安泰BLB-1300)、正置顯微鏡(尼康 50i)等。

1.2 臨床診斷

現(xiàn)場(chǎng)觀察病魚(yú)的攝食情況、行為特點(diǎn)等。將病魚(yú)放入白色的搪瓷盤中，檢查病魚(yú)眼晴、鰭條、體表和鰓絲等部位的充血、潰爛、發(fā)炎、黏液情況，腹部腫大及肛門腫脹情況；解剖后觀察肝、腎、腸等器官病變反應(yīng)。

1.3 實(shí)驗(yàn)室診斷

隨機(jī)取6條癥狀明顯的病魚(yú)，塑料袋充氧迅速帶回實(shí)驗(yàn)室做進(jìn)一步檢查。

1.3.1 病原菌分離

75%的酒精擦拭病魚(yú)體表，無(wú)菌條件下解剖病魚(yú)，對(duì)肝、腎組織進(jìn)行采樣，接種于TSA培養(yǎng)基，于28 ℃倒置培養(yǎng)24 h。平板上生長(zhǎng)的菌落形態(tài)大小一致，隨機(jī)挑取單菌落，再次劃線TSA培養(yǎng)基，獲得純培養(yǎng)菌株共10株，來(lái)源于腎臟的8株編號(hào)為L(zhǎng)LL-K-1～LLL-K-8，來(lái)源于肝臟的2株編號(hào)為L(zhǎng)LL-L-1和LLL-L-2，10株分離菌呈一致的菌落特征，初步判定為1種菌，選擇LLL-K-1為代表株進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。純培養(yǎng)物接種胰蛋白胨培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)24 h，菌種保存于15%甘油保種液中，置于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 病原菌形態(tài)學(xué)觀察

將細(xì)菌分離物接種于TSA培養(yǎng)基平板，28 ℃倒置培養(yǎng)過(guò)夜，肉眼觀察單菌落形態(tài)。將菌株培養(yǎng)12 h后進(jìn)行革蘭氏染色觀察。

1.3.3 生理生化鑒定

參照《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊(cè)》[8]中的細(xì)菌鑒定方法，采用細(xì)菌微量生化鑒定管對(duì)待測(cè)菌株進(jìn)行各項(xiàng)生化指標(biāo)的測(cè)定。

1.3.4 16S rDNA基因序列測(cè)定及系統(tǒng)發(fā)育分析

參照細(xì)菌DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)，提取病原菌DNA。以菌株基因組DNA為模板，細(xì)菌通用引物27F和1492R進(jìn)行16S rDNA 序列的PCR擴(kuò)增。PCR體系：5 μL 10×PCR緩沖液、2 μL 10 mmol/L dNTP、10 μmol/L引物各1 μL、1 μL DNA模板、1 μL 聚合酶、39 μL ddH2O。擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性1 min、55 ℃退火30 s、72 ℃延伸90 s、30 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。

擴(kuò)增產(chǎn)物參照瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行DNA回收純化，由生工生物工程(上海)有限公司測(cè)序。

測(cè)序結(jié)果在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行Blast分析，從比對(duì)結(jié)果中選取相似度最高的菌株序列，使用Clustal X 1.83進(jìn)行多重比對(duì)分析，然后通過(guò)Mega 4 軟件及鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)，所建發(fā)育樹(shù)各分支的置信度由Bootstrap進(jìn)行1000次循環(huán)檢驗(yàn)。

1.3.5 回歸感染試驗(yàn)

將分離株接種于TSB培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)18 h，7200 r/min離心10 min，棄上清液，磷酸鹽緩沖液漂洗3次，調(diào)節(jié)菌懸液密度為1.0×109、1.0×108、1.0×107、1.0×106、1.0×105cfu/mL。取暫養(yǎng)7 d的健康江鱈，隨機(jī)分為6組，每組6尾。采用腹腔注射的方法，對(duì)5個(gè)試驗(yàn)組分別注射5種密度的菌懸液，0.3 mL/尾，同時(shí)設(shè)對(duì)照組，注射等量滅菌磷酸鹽緩沖液。每個(gè)試驗(yàn)組均設(shè)置一平行組。每日觀察、記錄各組的發(fā)病癥狀和死亡數(shù)量，對(duì)剛死亡的病魚(yú)進(jìn)行細(xì)菌分離鑒定，試驗(yàn)周期為10 d。通過(guò)SPSS 13.0 軟件計(jì)算半數(shù)致死密度。

1.3.6 病原菌藥物敏感試驗(yàn)

根據(jù)紙片擴(kuò)散法將藥敏紙片貼于涂布有密度為5×106cfu/mL分離菌的MH瓊脂平板上，28 ℃培養(yǎng)24 h，測(cè)量抑菌圈直徑。所用的抗生素及含量為：氨芐青霉素(10 μg/片)、先鋒霉素Ⅴ(30 μg/片)、克拉霉素(15 μg/片)、依諾沙星(10 μg/片)、氟苯尼考(30 μg/片)、慶大霉素(10 μg/片)、卡那青霉素(30 μg/片)、新霉素(30 μg/片)、哌拉西林(100 μg/片)、利福平(5 μg/片)、大觀霉素(100 μg/片)、鏈霉素(10 μg/片)、復(fù)方新諾明[(23.75+1.25) μg/片]、四環(huán)素(10 μg/片)、妥布霉素(10 μg/片)、氧氟沙星(5 μg/片)、恩諾沙星(5 μg/片)、諾氟沙星(10 μg/片)、多西環(huán)素(30 μg/片)、氟氧頭孢(30 μg/片)、多黏菌素B(30 IU/片)、頭孢曲松(30 μg/片)、先鋒霉素Ⅵ(30 μg/片)、青霉素G(10 U/片)。

2 結(jié) 果

2.1 患病江鱈臨床表現(xiàn)及宏觀病理變化

病魚(yú)魚(yú)體瘦弱，體表發(fā)黑，攝食量減少；離群獨(dú)游；下頜嚴(yán)重出血，腹部出血；鰭條腐爛；肝臟出血；腎臟有出血點(diǎn)；腸道內(nèi)無(wú)食物；部分魚(yú)頭后背部有破損。

2.2 病原菌形態(tài)特征

10株分離菌呈一致的菌落特征：在TSA瓊脂培養(yǎng)基上菌落圓形、邊緣整齊、中間凸起、白色不透明、表面濕潤(rùn)、直徑為1～2 mm；在營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中均勻渾濁生長(zhǎng)，表面無(wú)菌膜形成。

革蘭氏染色鏡檢結(jié)果顯示，病原菌呈革蘭氏陰性。

2.3 分離菌生理生化特征

分離株主要生理生化特征為氧化酶陽(yáng)性，發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，產(chǎn)賴氨酸脫羧酶、鳥(niǎo)氨酸脫羧酶、精氨酸脫氫酶，不產(chǎn)脲酶，不產(chǎn)硫化氫，產(chǎn)吲哚，硝酸鹽還原陽(yáng)性，能發(fā)酵肌醇、葡萄糖、麥芽糖、甘露糖，明膠液化、V-P試驗(yàn)、七葉苷發(fā)酵等指標(biāo)陰性(表1)。結(jié)果顯示，菌株LLL-K-1與類志賀鄰單胞菌具有相似的表型特征。

2.4 16S rDNA基因序列測(cè)定及系統(tǒng)發(fā)育分析

PCR擴(kuò)增獲得長(zhǎng)度約1500 bp的基因片段。經(jīng)純化測(cè)序，測(cè)定的菌株序列(登錄號(hào)：KP284552)在GenBank 中進(jìn)行Blast同源性比對(duì)，結(jié)果顯示,菌株LLL-K-1所測(cè)序列與已上傳的類志賀鄰單胞菌16S rDNA核苷酸序列相似性達(dá)99%。選擇GenBank中同源性較高的細(xì)菌16S rDNA序列，并以柱狀黃桿菌(Flavobacteriumcolumnare)為外群，進(jìn)行比對(duì)分析并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖1)，發(fā)現(xiàn)菌株LLL-K-1與類志賀鄰單胞菌聚為一族。

綜合常規(guī)生理生化和16S rDNA 基因序列分析結(jié)果表明，菌株LLL-K-1為類志賀鄰單胞菌。

2.5 回歸感染試驗(yàn)

用類志賀鄰單胞菌LLL-K-1進(jìn)行腹腔注射感染健康江鱈，回歸感染試驗(yàn)表明，江鱈在注射1.0×109cfu/mL 菌懸液6 d后開(kāi)始出現(xiàn)死亡，隨著攻毒時(shí)間的延長(zhǎng)各密度菌液對(duì)江鱈的累積死亡率結(jié)果見(jiàn)圖2。由表2可知，注射菌液密度為1.0×105cfu/mL 組在攻毒后10 d內(nèi)未出現(xiàn)死亡，1.0×106cfu/mL 組的累積死亡率為16.67%，1.0×107cfu/mL組的累積死亡率為33.33%，而1.0×109cfu/mL組和1.0×108cfu/mL組在10 d內(nèi)的累積死亡率分別為83.33%和58.33%；在整個(gè)試驗(yàn)期間，空白對(duì)照組魚(yú)未見(jiàn)異常。經(jīng)計(jì)算，類志賀鄰單胞菌LLL-K-1的半數(shù)致死密度為4.3×107cfu/mL。

經(jīng)注射類志賀鄰單胞菌LLL-K-1患病魚(yú)出現(xiàn)病癥與自然發(fā)病癥狀一致，主要表現(xiàn)為體表發(fā)黑，下頜出血，腹部出血，鰭條腐爛，解剖可見(jiàn)肝臟出血、腎臟有出血點(diǎn)。從人工感染發(fā)病的魚(yú)體中重新分離到的菌株經(jīng)生化鑒定和分子鑒定表明其與感染用的類志賀鄰單胞菌LLL-K-1一致，由此可以確定該菌株為患病鱈魚(yú)的病原菌。

2.6 藥敏試驗(yàn)

K-B紙片擴(kuò)散法進(jìn)行藥物敏感性測(cè)試，在24種供試藥物中，類志賀鄰單胞菌LLL-K-1對(duì)氧氟沙星、恩諾沙星、諾氟沙星、依諾沙星極度敏感，對(duì)先鋒霉素Ⅴ、多西環(huán)素、新霉素高度敏感，對(duì)氟苯尼考、復(fù)方新諾明、四環(huán)素、大觀霉素、氧氟頭孢鈉、多黏菌素B中度敏感，對(duì)哌拉西林、克拉霉素、妥布霉素、慶大霉素、氨芐青霉素、鏈霉素、卡那青霉素、利福平頭孢曲松、先鋒霉素Ⅵ、青霉素G耐藥(表3)。

表1 分離株的生理生化試驗(yàn)結(jié)果

注：*，《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊(cè)》[8]中對(duì)類志賀鄰單胞菌的描述；+，陽(yáng)性反應(yīng)；-，陰性反應(yīng)；F，發(fā)酵反應(yīng)；R，拮抗反應(yīng)；D，菌株間有差異.

圖1 基于16S rDNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

分組密度/cfu·mL-1注射劑量/mL試驗(yàn)魚(yú)數(shù)量/尾死亡量/尾死亡率/%11×1090.3121083.3321×1080.312758.3331×1070.312433.3341×1060.312216.6751×1050.31200對(duì)照00.31200

表3 類志賀鄰單胞菌LLL-K-1的藥敏試驗(yàn)結(jié)果

注：S，敏感(直徑≥15 mm)；I，中度敏感(10 mm<直徑<15 mm)；R，耐藥(直徑≤10 mm).

圖2 隨著攻毒時(shí)間的延長(zhǎng)江鱈的累積死亡率

3 討 論

3.1 類志賀鄰單胞菌的分離鑒定

類志賀鄰單胞菌是鄰單胞菌屬的唯一菌種，曾一度劃歸到弧菌科，后根據(jù)其在分子水平上與鄰單胞菌和變形桿菌更為接近，于2005年《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊(cè)》(第2版)確立為腸桿菌科。

3.2 藥物敏感試驗(yàn)及防控

超級(jí)菌(多重耐藥菌)、藥物殘留、環(huán)境污染等問(wèn)題已引起世界范圍的高度重視。對(duì)分離到的類志賀鄰單胞菌LLL-K-1進(jìn)行藥物敏感性分析發(fā)現(xiàn)，該菌對(duì)氧氟沙星、恩諾沙星、諾氟沙星、依諾沙星等幾種藥物敏感，對(duì)哌拉西林、克拉霉素、妥布霉素、慶大霉素等耐藥。這些結(jié)果與Salgado-Miranda 等[16,20]的試驗(yàn)結(jié)果不同，可能是由于地域、環(huán)境和宿主不同引起的，也可能是由于分離株不同的藥物接觸史造成的，菌株間耐藥性的差異給細(xì)菌病的治療帶來(lái)極大困難。所以在實(shí)際工作中要做到以防為主，改善養(yǎng)殖環(huán)境、保持良好水質(zhì)、投喂優(yōu)質(zhì)飼料是防病的關(guān)鍵。在養(yǎng)殖過(guò)程中一旦發(fā)現(xiàn)江鱈有減食、停食、活動(dòng)異常等情況時(shí)，應(yīng)及時(shí)送檢，根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果和漁用藥物使用準(zhǔn)則科學(xué)地選用藥物，避免因誤診和延誤治療引起更大的經(jīng)濟(jì)損失，又可避免因亂用、濫用和長(zhǎng)期反復(fù)使用同一種藥物造成細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性。