超低溫冷凍保存中華鱘F1精子授精方法研究

舒德斌，劉雪清，張建明，肖 衎，趙 珣，郭柏福，姜 華，杜合軍

( 1.中國(guó)長(zhǎng)江三峽集團(tuán)有限公司中華鱘研究所，湖北 宜昌 443100；2.三峽工程魚類資源保護(hù)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 宜昌 443100 )

中華鱘(Acipensersinensis)隸屬于鱘形目、鱘科、鱘屬，是典型的溯河生殖洄游性魚類，主要分布于我國(guó)東海、黃海和渤海大陸架水域及流入其中的大型河流中[1]，是我國(guó)特有的大型古老魚類，屬國(guó)家一級(jí)重點(diǎn)保護(hù)動(dòng)物。葛洲壩水利樞紐的修建阻隔了中華鱘生殖洄游通道，其他人類活動(dòng)和環(huán)境因素對(duì)其影響日益加重，中華鱘自然繁殖群體資源已極度瀕危[2-3]。中華鱘自然繁殖種群的性腺發(fā)育質(zhì)量也有明顯下降的趨勢(shì)，雌雄性比失調(diào)及種群結(jié)構(gòu)的變化和產(chǎn)卵場(chǎng)環(huán)境的改變將對(duì)中華鱘種群自然繁殖產(chǎn)生重要影響[4-5]。

精液超低溫冷凍保存技術(shù)在眾多的物種保護(hù)領(lǐng)域中具有重要的科研和應(yīng)用價(jià)值，不僅可以用于種質(zhì)資源的保存，也可以解決雌雄個(gè)體發(fā)育時(shí)空上的不一致[6]。國(guó)內(nèi)外有學(xué)者對(duì)魚類精子超低溫冷凍保存技術(shù)進(jìn)行了研究，并取得了一定進(jìn)展[6-8]。中華鱘精液超低溫冷凍保存技術(shù)的研究與應(yīng)用對(duì)解決中華鱘人工增殖過程中遇到的雄魚數(shù)量不足、雌雄親魚性腺發(fā)育不同步及其遺傳多樣性和種質(zhì)資源的保存問題具有十分重要的意義。目前，柳凌等[9-10]先后開展了中華鱘精子超低溫冷凍保存和凍精授精試驗(yàn)，獲得2.22%～6.98%的受精率；郭柏福等[11]在成功實(shí)現(xiàn)中華鱘全人工繁殖成功后，進(jìn)行了中華鱘凍精授精試驗(yàn)，獲得5%的受精率和0.5%的孵化率。這些研究雖然取得了初步成效，但超低溫凍存的精子受精率和孵化率均較低。凍精授精技術(shù)為魚類精子冷凍保存技術(shù)中關(guān)鍵一環(huán)。為此，筆者于2011—2013年間連續(xù)開展了研究工作，研究了授精方式、凍精用量及激活液對(duì)凍精授精效果的影響，旨在提高中華鱘凍精受精率和孵化率，優(yōu)化中華鱘全人工繁殖技術(shù)體系。

1 材料與方法

1.1 材料來源

用于試驗(yàn)的中華鱘精、卵均取自2010—2013年中華鱘研究所三峽基地和黃柏河基地蓄養(yǎng)成熟的中華鱘F1雄、雌親魚。雄魚經(jīng)人工催產(chǎn)采集無污染的精液，按60～80 mL/袋分裝于雙層塑料保鮮袋中充氧，置于2～4 ℃的培養(yǎng)箱中短期保存，用作對(duì)照組，部分精液于-196 ℃的液氮中超低溫冷凍保存，用作凍精授精試驗(yàn)。雌魚經(jīng)催產(chǎn)采卵后立即進(jìn)行授精試驗(yàn)。

1.2 精子冷凍、解凍及質(zhì)量評(píng)價(jià)

取活力大于80%的鮮精按兩步降溫法進(jìn)行冷凍后浸入液氮中保存[9]。38～40 ℃水浴解凍，精液溶解后立即在顯微鏡下檢查精子活力。具體方法為：用一次性注射器針頭蘸取精液與載玻片上30 μL的井水混合，用針頭攪散，立即在100倍顯微鏡下觀察精子的運(yùn)動(dòng)情況?；盍z測(cè)由同一個(gè)人完成，每樣重復(fù)3次。精子活力為視野內(nèi)快速活動(dòng)精子占精子總數(shù)的百分比。用伊紅染色法對(duì)精子活力評(píng)估進(jìn)行補(bǔ)充校驗(yàn)[13]。

1.3 不同激活液授精效果比較

1.3.1 激活液的配制

用于比較的4種激活液配方見表1。

表1 4種不同的激活液

注: B液參考文獻(xiàn)[14].

1.3.2 操作方法

用2010年冷凍保存的(冷凍保存360 d)活力為(37.64±3.8)%的中華鱘F1精液，按精卵體積比1∶10，分別用A液、B液、C液、D液和水激活，進(jìn)行干法授精。每組設(shè)3個(gè)平行。

1.4 不同授精方法比較

試驗(yàn)中用3 mL中華鱘F1凍精與10 mL中華鱘F1卵子，分別采用干法和濕法授精。在確認(rèn)雌魚排卵后，開始解凍復(fù)蘇精子，進(jìn)行凍精授精試驗(yàn)。每組設(shè)3個(gè)平行組，1個(gè)對(duì)照組。2012年和2013年先后進(jìn)行了3次授精方法比較試驗(yàn)。其中試驗(yàn)1和試驗(yàn)2使用的是2012年冷凍保存的中華鱘F1精液；試驗(yàn)3使用的是2010年冷凍保存的中華鱘F1精液，試驗(yàn)用卵子質(zhì)量稍差。授精操作方法在文獻(xiàn)[15]方法的基礎(chǔ)上稍加調(diào)整。

濕法授精：直徑10 cm一次性平底塑料碗，將卵子和凍精各放到碗底一側(cè)(不混合)，再加水緩慢攪拌均勻，1 min后用清水沖洗除去多余精子，置于25%的滑石粉溶液中氣動(dòng)脫黏，60 min后轉(zhuǎn)入孵化器孵化。

干法授精：直徑10 cm一次性平底塑料碗，放入卵子后加入凍精攪拌均勻，再加水緩慢攪拌1 min后，用清水沖洗除去多余精子，置于25%的滑石粉溶液中氣動(dòng)脫黏，60 min后轉(zhuǎn)入孵化器孵化。

1.5 冷凍精液用量比較

用2012年冷凍保存的中華鱘F1精液，其冷凍保存365 d，密度為3.82×109個(gè)/mL，稀釋比1∶2，活力為(35.45±5.26)%，按0.1、0.3、0.6、1.5、3 mL用量分別與10 mL中華鱘F1卵子進(jìn)行濕法授精。

1.6 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)與分析

根據(jù)《中華鱘人工繁殖技術(shù)規(guī)程》[16]，魚卵發(fā)育至原腸晚期時(shí)統(tǒng)計(jì)受精率，魚卵發(fā)育至出膜前期時(shí)統(tǒng)計(jì)孵化率。相關(guān)數(shù)據(jù)采用Excel和SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的計(jì)算分析。

2 結(jié) 果

2.1 激活液對(duì)凍精受精率的影響

冷凍保存360 d的凍精活力為(37.64±3.8)%，按精卵體積比1∶10，分別用A液、B液、C液、D液和水激活干法授精，結(jié)果顯示，用水激活授精的受精率和孵化率均顯著高于其他激活液(P<0.05)，分別獲得(15.04±0.58)%的受精率和(14.6±0.59)%的孵化率(圖1)。

圖1 不同激活液受精率和孵化率比較字母不同表示具有顯著性差異(P<0.05)，下同.

2.2 授精方式對(duì)受精率的影響

試驗(yàn)1、試驗(yàn)2和試驗(yàn)3的濕法受精率和孵化率分別為(18.3±1.45)%、(13.57±0.76)%、(18.65±0.42)%和(16.82±2.01)%、(11.03±0.98)%、(15.87±1.25)%；干法受精率和孵化率分別為(9.49±1.21)%、(6.96±2.01)%、(8.31±0.19)%和(7.66±0.53)%、(4.11±1.58)%、(6.26±0.24)%。結(jié)果顯示，濕法授精效果均優(yōu)于干法授精，且具有顯著性差異(P<0.05)(表2)。

表2 授精方式對(duì)受精率的影響 %

注:表中同列不同字母表示具有顯著性差異(P<0.05).

2.3 凍精用量對(duì)受精率的影響

凍精用量對(duì)受精率和孵化率有一定影響。隨著凍精用量的增加，受精率和孵化率先升后降(圖2)，0.6 mL時(shí)受精率和孵化率較高，分別為(16.43±1.57)%和(14.58±1.35)%。此后，隨著凍精用量的增加，受精率和孵化率呈下降趨勢(shì)，與0.6 mL組相比差異顯著(P<0.05)。

圖2 凍精用量對(duì)受精率的影響

3 討 論

3.1 激活液對(duì)受精率的影響

通常認(rèn)為，冷凍精子解凍后其活力及受精能力將會(huì)顯著降低，采用低滲溶液激活精子，其運(yùn)動(dòng)效果好于用淡水激活[17-19]。Tris-HCl為鱘魚精子激活液的常用成分，其主要用作pH緩沖成份[20-23]，適宜含量的Na+、K+、Ca2+、Mg2+和葡萄糖可以提高中華鱘精子活力[24-26]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，同樣條件下，用水激活授精的受精率和孵化率均顯著高于其他激活液?？娠@著增加中華鱘凍精被激活后運(yùn)動(dòng)速度的激活液B液[14]，在本試驗(yàn)中并未獲得較高的受精率和孵化率。分析認(rèn)為，可能提高精子活力的條件，不一定適合卵子受精的條件，即激活液對(duì)卵子受精的環(huán)境條件產(chǎn)生了不利的影響。甘芳等[27]研究顯示，適量的陽(yáng)離子和葡萄糖作為中華鱘鮮精激活授精介質(zhì)時(shí)可提高中華鱘卵受精率。筆者推測(cè)這種差異除了超低溫冷凍給中華鱘精子帶來冷凍損傷的因素外[10]，是否還與試驗(yàn)中的4種激活液均含有Tris-HCl及凍精的抗凍稀釋液成分有關(guān)，有待進(jìn)一步研究。

3.2 干法和濕法授精對(duì)受精率的影響

本試驗(yàn)中干法授精和濕法授精最大的不同是在授精過程中，干法授精是將卵子和凍精先進(jìn)行充分混合，然后進(jìn)行激活授精；而濕法授精是將凍精和卵子用水激活同時(shí)混合授精。試驗(yàn)結(jié)果顯示，同樣條件下，濕法授精效果優(yōu)于干法授精。這可能是因?yàn)楦煞ㄊ诰珪r(shí)，精卵充分混合過程中，凍精含有的抗凍稀釋液影響其與卵子混合接觸，即干法授精混合接觸的時(shí)間和相對(duì)含量比濕法授精時(shí)的要長(zhǎng)要高，不利中華鱘卵子的受精。

3.3 凍精用量對(duì)受精率的影響

凍精的用量是影響受精率的重要因素之一。有研究表明，在活力一定的情況下，隨著用量的增加受精率呈直線上升趨勢(shì)，有的可接近鮮精受精率水平。如肖志忠等[28]研究發(fā)現(xiàn)，大黃魚(Pseudosiaenacrocea)凍精授精時(shí)的精卵比高于0.8×106∶1，受精率均接近鮮精受精率；當(dāng)精卵比低到一定比值時(shí)，受精率會(huì)降至35%。陳松林等[19]研究發(fā)現(xiàn)，草魚(Ctenopharyngodonidellus)和鰱魚(Hypophthalmichthysmolitrix)凍精授精的精卵比一定范圍內(nèi)，受精率隨著密度的增加呈直線上升；當(dāng)精卵比超過1.6×106∶1時(shí)，受精率接近鮮精水平，再增加時(shí)受精率基本不變。西伯利亞鱘(Acipenserbaeri)授精的最佳精卵比也取得了近似的結(jié)果[26]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，凍精用量為0.1～0.6 mL，隨著用量的增加，受精率呈上升趨勢(shì)，超過0.6 mL，受精率則隨之下降。分析認(rèn)為，在最佳精卵比的基礎(chǔ)上，除了魚類精子的生理特性不同外，在加大凍精用量的同時(shí)，也加大了抗凍稀釋液對(duì)卵子受精不利的影響。

根據(jù)凍精生理特性尋找有效的激活授精方法是提高凍精受精率的關(guān)鍵之一[6]。本試驗(yàn)重點(diǎn)研究了授精方式、凍精用量及激活液對(duì)凍精授精效果的影響。在中華鱘凍精授精過程中，采用水激活、濕法授精及適宜授精的精卵比例這3種方法的有效組合，在保證足夠的凍精活力前提下，盡可能減少中華鱘凍精抗凍稀釋液和精子激活液對(duì)精子、卵子受精能力的不利影響，可以提高中華鱘凍精授精的受精率。