液質(zhì)法測定嬰幼兒米粉中壬基酚和丙烯酰胺

王浩，趙麗，于曉瑾，張杉，孫龍，潘紅艷

（國家食品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗中心，北京市食品安全監(jiān)控和風(fēng)險評估中心，北京100094）

嬰幼兒營養(yǎng)米粉是以一種或多種谷物（如：小麥、大米、大麥、燕麥、黑麥、玉米等）為主要原料，且谷物占干物質(zhì)組成的25%以上，添加適量的營養(yǎng)強化劑和（或）其他輔料，經(jīng)加工制成的適于6月齡以上嬰兒和幼兒食用的輔助食品。近年來，國家對嬰兒配方食品質(zhì)量監(jiān)管日趨嚴(yán)苛，除了定期對日常營養(yǎng)指標(biāo)檢測外，一些嬰兒配方食品中可能存在的有毒及環(huán)境污染物物質(zhì)也列入風(fēng)險監(jiān)測，其中就包括近年人們越來越重視和關(guān)注的壬基酚[1]（環(huán)境污染物）和丙烯酰胺[2]（高溫加工淀粉類食品中常見的一種有毒物質(zhì)）。壬基酚已被證明具有內(nèi)分泌干擾效應(yīng)，主要用于生產(chǎn)表面活性劑、也用于抗氧劑、紡織印染助劑、潤滑油添加劑、農(nóng)藥乳化劑、樹脂改性劑、樹脂及橡膠穩(wěn)定劑等領(lǐng)域。壬基酚屬有機污染物，有“精子殺手”之稱。淀粉類食品在高溫（＞120℃）烹調(diào)下容易產(chǎn)生丙烯酰胺。研究表明，人體可通過消化道、呼吸道、皮膚黏膜等多種途徑接觸丙烯酰胺，飲水是其中的一條重要接觸途徑。2002年4月瑞典國家食品管理局和斯德哥爾摩大學(xué)研究人員率先報道，在一些油炸和燒烤的淀粉類食品，如炸薯條、炸土豆片等中檢出丙烯酰胺，而且含量超過飲水中允許最大限量的500多倍。之后挪威、英國、瑞士和美國等國家也相繼報道了類似結(jié)果。丙烯酰胺被國家癌癥研究機構(gòu)列為2A類致癌物質(zhì)。目前，測定壬基酚和丙烯酰胺殘留的文獻比較多，方法主要是氣相-氣質(zhì)聯(lián)用法[3-5]和液相-質(zhì)譜聯(lián)用法[6-10]等。目前還未見液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法用于同時檢測壬基酚和丙烯酰胺的報道。建立一種靈敏、簡便、準(zhǔn)確、精密的LC-MS/MS法同時測定嬰兒營養(yǎng)米粉中壬基酚和丙烯酰胺的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

甲醇（色譜純）：德國Fisher公司；壬基酚、壬基酚-13C6同位素、丙烯酰胺和丙烯酰胺-d3同位素（含量≥99%）：德國Dr.Ehrenstorfer公司；試驗所選用樣品為超市購買；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。Agilent 6410型串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜儀（配Agilent1200型液相色譜儀）：美國Agilent公司；B-300型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：瑞士步琦有限公司；KH-5200型超聲波清洗儀：昆山市超聲儀器有限公司；Vortex-Genie 2渦旋儀：德國Scientific Industries公司；Milli-Q去離子水發(fā)生器：美國Milli-Q公司。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

標(biāo)準(zhǔn)儲備液：分別準(zhǔn)確稱取10.0 mg的壬基酚和丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)品于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，制成1mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，-18℃以下保存。

內(nèi)標(biāo)儲備液：準(zhǔn)確稱取10.0 mg的壬基酚和丙烯酰胺同位素內(nèi)標(biāo)于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，制成1mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，-18℃以下保存。

中間濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液：用甲醇分別將壬基酚和丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)儲備液配制成濃度為2.5 μg/mL的中間濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液，4℃以下保存。

中間濃度內(nèi)標(biāo)溶液：用甲醇分別將壬基酚和丙烯酰胺內(nèi)標(biāo)儲備液配制成濃度為1 μg/L的中間濃度內(nèi)標(biāo)溶液，4℃以下保存，在3個月內(nèi)穩(wěn)定。

混合基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)校準(zhǔn)溶液的制備：稱取陰性樣品，分別加入適量的中間濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液，使壬基酚添加濃度分別為 1.5、5、25、100、250 ng/mL；丙烯酰胺最終添加濃度分別為 10、25、50、100、200 ng/mL。配得不同濃度的混合基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)校準(zhǔn)溶液后，按照樣品測定前處理方法，同檢測樣品一起前處理并上機檢測。

1.3 液相色譜分析條件

色譜柱：資生堂 MGⅢ-C18柱，（4.6 mm×150 mm，5 μm）。

液相色譜條件：流速0.20 mL/min，柱溫25℃，進樣量 3 μL，流動相：甲醇（A）+水（B）；梯度洗脫：0～5 min，A保持5%。5 min～7 min，A由5%線性遞增至100%。7 min～20 min，A 保持 100%。20 min～20.1 min，A 由100%線性遞減至5%。20.1 min～25 min，A保持5%。

1.4 質(zhì)譜分析條件

離子源：電噴霧離子源（ESI）；掃描方式：壬基酚為負(fù)離子模式，丙烯酰胺為正離子模式；檢測方式：多反應(yīng)檢測；干燥氣：N2；霧化氣壓力：413.8 kpa；干燥氣溫度：300℃；干燥氣流速：8 L/min。

1.5 樣品處理

稱取2.5 g樣品，精確至0.01 g，置于100 mL比色管中，分別加入20 μL濃度為2.5 μg/L壬基酚中間濃度內(nèi)標(biāo)溶液和50 μL濃度為2.5 μg/L丙烯酰胺中間濃度內(nèi)標(biāo)溶液，加入10 mL水，渦旋1 min，再加入50 mL無水乙醇充分搖勻后經(jīng)超聲波提取30 min，上清液經(jīng)濾紙過濾，濾液至100 mL蒸發(fā)瓶內(nèi)，并將其接至旋轉(zhuǎn)器上，于50℃水浴中減壓蒸餾至近干，加入5 mL 10%甲醇水溶液充分溶解后，過0.22 μm濾膜待測。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品前處理條件選擇

考慮到壬基酚在環(huán)境中普遍存在，使用固相萃取小柱來凈化樣品，也會帶來一定的背景污染，故在試驗設(shè)計時考慮采用有機溶液直接提取，然后旋蒸富集的方式進行樣品前處理。

壬基酚和丙烯酰胺的化學(xué)性質(zhì)差異較大，其中，壬基酚不溶于水，溶于乙醇；丙烯酰胺則既溶于水，又溶于乙醇。同時，米粉基質(zhì)需要先加水糊化，才能將基質(zhì)內(nèi)部的目標(biāo)化合物釋放出來，所以本方法在樣品中加入10 mL水，渦旋1min，再加入50 mL無水乙醇超聲提取，為了提高檢出限，對濾液進行旋蒸富集，試驗表明：壬基酚和丙烯酰胺的平均回收率在90.2%～103.1%。

2.2 色譜條件選擇

色譜柱的選擇：為了有利于目標(biāo)化合物的分離及色譜峰形的改善，本方法分別采用資生堂MGⅢ-C18色譜柱（150 mm × 4.6 mm，5 μm）、Wates Atlantis-C18色譜柱（150 mm×2.1 mm，5 μm）和ZORBAX SB-C18色譜柱（50 mm ×2.1 mm，1.8 μm）進行分離試驗，發(fā)現(xiàn)資生堂 MGⅢ-C18色譜柱（150 mm ×4.6 mm，5 μm）效果較好，能夠滿足檢測要求。

流動相的選擇：因為丙烯酰胺為強極性化合物，而壬基酚為弱極性化合物，因此本方法采用水-甲醇為流動相，利用梯度洗脫的方法提高分離及檢測效果，測試開始時，流動相中水-甲醇的體積比為95∶5，0～5 min保持此比例，這一部分主要是分離出丙烯酰胺，然后在5 min～7 min內(nèi)將改變二者的比例為0∶100，7 min～19 min保持此比例，這一部分主要是洗脫測定液中壬基酚。通過上述三步梯度，在20 min內(nèi)，可以較好的分離測定液中壬基酚和丙烯酰胺（結(jié)果見圖1），丙烯酰胺出峰時間為2.968 min，壬基酚出峰時間為16.559 min，峰型對稱性良好，附近無干擾峰出現(xiàn)。

圖1 壬基酚和丙烯酰胺及其同位素內(nèi)標(biāo)的MRM色譜圖Fig.1 MRM chromatograms of target compounds

表1 壬基酚、壬基酚-13C6同位素、丙烯酰胺和丙烯酰胺-d3同位素的質(zhì)譜參數(shù)Table1 Instrumental parameters for mass spectrometric analysis

2.3 質(zhì)譜條件優(yōu)化

采用流動注射的方式在正、負(fù)離子模式下分別對濃度為200 ng/mL的壬基酚、壬基酚-13C6同位素、丙烯酰胺和丙烯酰胺-d3同位素進行母離子全掃描，得到目標(biāo)化合物的分子離子峰。選取相應(yīng)的母離子峰，對其子離子進行二級質(zhì)譜分析，得到碎片離子信息，然后再對得到的二級質(zhì)譜參數(shù)如破碎電壓、碰撞能量等進行優(yōu)化，選取豐度較強、干擾較小的兩個子離子作為定性與定量離子。最終得到基酚、壬基酚-13C6同位素、丙烯酰胺和丙烯酰胺-d3同位素的最佳質(zhì)譜參數(shù)，結(jié)果見表1。

從表1中可知，壬基酚母離子為219.2，選擇兩個靈敏度相對較高的穩(wěn)定子離子，組成定性離子對，132.9和147.0，其中靈敏度較高的子離子132.9為定量離子，丙烯酰胺的母離子為72.1，定性離子對為55.1和44.1，其中55.1為定量離子，根據(jù)品牌和型號的不同，儀器參數(shù)略有差別。

2.4 基質(zhì)效應(yīng)的影響

化學(xué)分析中，基質(zhì)指的是樣品中被分析物以外的組分。嬰幼兒營養(yǎng)米粉樣品富含蛋白質(zhì)、淀粉和各種營養(yǎng)添加劑，這些基質(zhì)常常對分析物的分析過程有顯著的干擾，并影響分析結(jié)果的準(zhǔn)確性。目前最常用的去除基質(zhì)效應(yīng)的方法是，通過添加已知分析物濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣品，同時盡可能保持樣品中基質(zhì)不變，建立一個校正曲線，因此，為了準(zhǔn)確定量，本方法在加入同位素的空白樣品中進行標(biāo)準(zhǔn)添加，配成了系列濃度的混合基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)校準(zhǔn)溶液，較大程度消除了基質(zhì)效應(yīng)的影響。

2.5 線性關(guān)系、檢出限及定量限

用系列濃度的混合基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)校準(zhǔn)溶液，分別進樣3 μL，測定結(jié)果經(jīng)線性回歸（y為峰面積，Counts；x為濃度，μg/L），同時用空白樣品進行加標(biāo)試驗，在信噪比均大于3的條件下能檢出，將此添加量定為檢出限；在信噪比均大于10的條件下能檢出，將此添加量定為定量限。結(jié)果見表2。

表2 壬基酚和丙烯酰胺的線性方程、線性關(guān)系、相關(guān)系數(shù)檢出限及定量限Table2 Linear equations with correlation coefficients，limits of detection and quantification of the method

壬基酚在 1.5 μg/kg～250 μg/kg范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好，檢出限和定量限分別為0.5 μg/kg和1.5 μg/kg，丙烯酰胺在 10 μg/kg～20 μg/kg范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好，檢出限和定量限分別為3.0 μg/kg和10.0 μg/kg。

2.6 方法回收率和精密度

每組準(zhǔn)確稱取空白樣品6份，每份2.5 g共3組，分別定量加入目標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，第一組添加水平：壬基酚為50 μg/kg，丙烯酰胺為20 μg/kg；第二組添加水平：壬基酚為 100 μg/kg，丙烯酰胺為 50 μg/kg；第三組添加水平：壬基酚為 200 μg/kg，丙烯酰胺為 100 μg/kg。

按供試品溶液制備方法制備后進行測定，結(jié)果見表3。

表3 加標(biāo)樣品回收率與相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）Table3 Recovery and relative standard deviation（RSD）in spiked sample（n=6） %

圖2 壬基酚和丙烯酰胺陽性樣品的MRM色譜Fig.2 MRM chromatogram of a positive sample containing nonyl phenol and Acrylamide

從表3中可看出，不同濃度平均加標(biāo)回收率90.2%～103.1%，平均相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.80%～4.87%（n=6）。

2.7 實際樣品檢測

利用本方法對市場銷售的30種嬰幼兒營養(yǎng)米粉進行檢測，其中24個樣品檢出壬基酚（濃度為11.8 μg/kg～101.4 μg/kg），6 個樣品檢出丙烯酰胺（濃度為10.4 μg/kg～31.5 μg/kg）其余未檢出。圖 2 為壬基酚和丙烯酰胺陽性樣品質(zhì)譜圖。結(jié)果表明，壬基酚和丙烯酰胺廣泛存在于嬰幼兒營養(yǎng)米粉中，其對嬰幼兒健康存在的風(fēng)險應(yīng)當(dāng)引起重視。

3 結(jié)論

建立了嬰幼兒營養(yǎng)米粉中壬基酚和丙烯酰胺殘留的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定方法。該法樣品加標(biāo)回收率方法回收率為90.2%～103.1%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為3.80%～4.87%。方法的靈敏度和準(zhǔn)確度均滿足實際樣品檢測的需要，完全適于嬰幼兒營養(yǎng)米粉中壬基酚和丙烯酰胺殘留的監(jiān)控檢測。