超微粉碎聯(lián)合超聲輔助法提取薺菜多糖工藝研究

荊云，盧慧娟，薛金濤，李鵬

（新鄉(xiāng)醫(yī)學院藥學院，河南新鄉(xiāng)453003）

薺菜，又名護生草、清明草、薺薺菜、菱角菜等，為十字花科植物薺Capsella bursa-pastoris（Linn.）Medic.的全草，廣泛分布在全國各地，生在田野、路邊，是一種藥食兩用的植物。薺菜入藥，味甘、淡，性涼；具有利尿、止血、清熱、明目、消積功效[1-2]。薺菜含有黃酮類、有機酸、氨基酸、生物堿、糖類、微量元素等多種具有生物活性的化學成分[3]。大量研究表明，植物多糖具有調節(jié)機體免疫功能、抗腫瘤、降血糖、降血脂、抗菌抗病毒等多種生物活性[4]，成為近年來研究熱點。也有研究發(fā)現，薺菜多糖對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌都有一定的抑制作用[5]，同時可清除羥基自由基，具有較強的抗氧化作用[6]；對薺菜多糖（herba capsellae polysaccharide，HCP）的提取工藝研究也有少量報道，但多是單純用超聲波技術對其進行提取制備[5-8]。本試驗采用超微粉碎技術聯(lián)合超聲輔助法對薺菜多糖進行提取工藝研究，并對提取工藝中的顆粒度、超聲功率、料液比、超聲時間等影響因素進行優(yōu)化，得到適宜的提取條件，為薺菜多糖的進一步深入研究提供理論依據。

1 材料與儀器

1.1 材料

試驗用薺菜樣品于2016年3月采自河南省新鄉(xiāng)縣，經鑒定為十字花科植物薺Capsellabursa-pastoris（L.）Medic.的全草。

1.2 試劑

葡萄糖對照品：中國藥品生物制品檢定所；95%乙醇、無水乙醇、丙酮、乙醚、苯酚、濃硫酸（均為分析純）：洛陽市化學試劑廠；蒸餾水：藥學綜合實驗室自制。

1.3 主要儀器

722S型可見分光光度計：上海菁華科技儀器有限公司；NLD-6A型超微粉碎機：濟南納力德超微粉碎技術有限公司；DK-98-1型電熱恒溫水浴鍋：天津市泰斯特儀器有限公司；KQ-500DE超聲波清洗器：昆山舒美超聲儀器有限公司；80-2離心沉淀機：江蘇丹陽市興福五金電器廠；FA2104型電子天平：上海浦春計量儀器有限公司；101-3型電熱鼓風恒溫干燥箱：江蘇金壇市佳美儀器有限公司。

2 試驗方法

2.1 樣品制備

取生鮮薺菜，流水清洗干凈，放入烘箱60℃烘干，將干燥的薺菜放入普通粉碎機粉碎，得到薺菜粗粉；粗粉碎的薺菜經超微粉碎機粉碎后，得到薺菜超微粉。

2.2 薺菜多糖的超聲提取

稱取一定量經過篩分的薺菜粉末，置于500 mL圓底燒瓶中，按預設的料液比、超聲時間、超聲功率和顆粒度，超聲提取兩次，過濾，合并兩次濾液。將濾液加熱濃縮，加入一定量的95%乙醇，于冰箱中靜置24 h，離心，得沉淀，沉淀用蒸餾水溶解，再次加入乙醇，離心沉淀，所得沉淀分別用無水乙醇、丙酮、乙醚洗滌數次，真空干燥后得薺菜多糖粉末。

2.3 不同粉碎工藝對薺菜多糖提取率的影響

以薺菜多糖提取率為指標，分別采用普通粉碎、超微粉碎方法，考察不同粉碎工藝對薺菜多糖提取的影響。

普通粉碎提取工藝：將干燥后的薺菜放入普通粉碎機粉碎，得到薺菜粗粉，過40目篩，按2.2項下工藝提取制備薺菜多糖，計算薺菜多糖的提取率。

超微粉碎提取工藝：粗粉碎的薺菜經過超微粉碎機粉碎后，篩分出其中200目的薺菜微粉，按2.2項下工藝提取制備薺菜多糖，計算薺菜多糖的提取率。

2.4 葡萄糖標準曲線的制作[9-10]

采用硫酸-苯酚法，精密稱取葡萄糖對照品5.4 mg，置于50 mL容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度，搖勻，即得。精密量取對照品溶液 0、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6 mL，分別置具塞試管中，加蒸餾水至2.0 mL，各精密加入新配的5%苯酚溶液1.0 mL，搖勻，迅速精密加入硫酸5.0 mL，搖勻，置沸水浴中加熱20 min，取出后置冰水浴中降至室溫。進行分光光度法試驗，以第1管為空白，在490 nm波長處測定吸收度（Y），以濃度（X）為橫坐標，吸收度（Y）為縱坐標，繪制標準曲線，得回歸方程：Y=3.840 5X+0.084 3（r=0.999 4）。表明葡萄糖濃度在64.6 μg/mL～173.6 μg/mL范圍內線性關系良好。

2.5 薺菜多糖含量測定及多糖提取率的計算

精密稱取干燥至恒重的薺菜多糖粉末樣品，用蒸餾水稀釋一定倍數定容，作為待測溶液，取待測溶液1.0 mL，置于10 mL的具塞試管中，加蒸餾水至2.0 mL，再加入新配的5%苯酚溶液1.0 mL，搖勻，迅速精密加入硫酸5.0 mL，搖勻，置沸水浴中加熱20 min，取出后置冰水浴中降至室溫。以葡萄糖為標樣，于波長490 nm處測定吸光度值，用標準曲線計算出紅花多糖的含量，再按照公式：多糖提取率/%=（多糖質量/原料質量）×100，計算薺菜多糖提取率。

3 結果與分析

3.1 不同粉碎工藝制備薺菜多糖提取率比較

分別采用普通粉碎、超微粉碎兩種粉碎提取工藝，以薺菜多糖的提取率為指標，考察不同粉碎度對薺菜多糖提取的影響，試驗結果見表1。

由表1可知，在兩種粉碎粒度中，超微粉碎提取工藝比普通粉碎提取工藝薺菜多糖提取率提高較多，說明超微粉碎有利于薺菜中的多糖提取。因此，可聯(lián)合超聲輔助提取法開展薺菜多糖的提取研究。

表1 2種粉碎工藝提取薺菜多糖提取率比較Table1 Comparison of two kinds of method for extraction ratio of HCP

3.2 單因素試驗

分別以料液比、超聲時間、顆粒度、超聲功率為4個單因素，考察其對薺菜多糖提取率的影響。

3.2.1 料液比對薺菜多糖提取率的影響

取過150目篩的薺菜干粉、在超聲時間40 min、超聲功率300 W條件下，考察不同料液比1∶10、1∶15、1 ∶20、1∶25、1∶30（g/mL）對薺菜多糖提取率的影響。以多糖提取率為縱坐標、料液比為橫坐標制圖，見圖1。

圖1 料液比對薺菜多糖提取率的影響Fig.1 Effect of solid-liquid ratio on the extration ratio of HCP

結果表明，在料液比低于 1∶25（g/mL）時，隨料液比的增加，多糖提取率迅速增加；當料液比大于1∶25（g/mL）后，多糖提取率增加緩慢。由于提取液在后續(xù)工藝中須經加熱濃縮，加水量過大會造成后續(xù)濃縮耗能、耗時、效率降低。故選擇料液比1∶25（g/mL）較為合適。

3.2.2 超聲時間對薺菜多糖提取率的影響

取過150目篩的薺菜干粉、在料液比1∶25（g/mL）、超聲功率300 W條件下，考察不同的超聲時間30、35、40、45、50 min對多糖提取率的影響，以多糖提取率為縱坐標、超聲時間為橫坐標制圖，見圖2。

圖2 超聲時間對薺菜多糖提取率的影響Fig.2 Effect of ultrasonic time on the extration ratio of HCP

結果表明，隨著超聲時間的延長多糖提取率有逐漸增加的趨勢，但超過45min后多糖提取率不再增加反而有降低的趨勢，可見延長超聲時間并不能提高多糖的提取率，因此初步確定超聲時間應控制在45min合適。

3.2.3 顆粒度對薺菜多糖提取率的影響

在料液比 1 ∶25（g/mL）、超聲時間 45 min、超聲功率300 W條件下，薺菜干粉顆粒度分別為80、150、200、300、400目，測定多糖提取率，以多糖提取率為縱坐標、顆粒度為橫坐標制圖，見圖3。

圖3 不同顆粒度對薺菜多糖提取率的影響Fig.3 Effect of granularity on the extration ratio of HCP

結果表明，隨著顆粒度目數的增加，薺菜干粉越來越細，多糖提取率也逐步上升，這是由于，經過超微粉碎后，植物細胞壁大部分被破壞，而且，超微粉體粒徑小，比表面積增大，物料和提取液能夠充分接觸，有利于多糖的溶出。

3.2.4 超聲功率對薺菜多糖提取率的影響

在料液比 1 ∶25（g/mL）、超聲時間 45 min、顆粒度300目條件下，考察不同超聲功率 100、200、300、400、500 W對多糖提取率的影響，以多糖提取率為縱坐標、超聲功率為橫坐標制圖，見圖4。

圖4 超聲功率對薺菜多糖提取率的影響Fig.4 Effect of ultrasonic power on the extration ratio of HCP

結果表明，超聲功率在100 W～300 W之間，多糖提取率上升較快，在300 W之后上升不明顯，曲線趨于平緩并有所下降，可能是高功率的超聲波破壞了多糖的結構，導致提取率下降。因此，選擇超聲功率300 W較為合適。

3.3 薺菜多糖提取工藝的優(yōu)化

在單因素試驗的基礎上，選擇顆粒度、超聲時間、料液比、超聲功率4項作為考察因素，各取3個水平，進行L9（34）正交試驗設計，以多糖提取率為評價指標，考察各因素對提取工藝的影響，以確定超微粉碎聯(lián)合超聲法提取薺菜多糖的最優(yōu)工藝條件。

因素水平見表2，試驗結果見表3，方差分析見表4。

表2 正交試驗因素水平表Table2 Factors and levels of orthogonal test

表3 L9（34）正交試驗設計及結果Table3Design and results of L9（34）orthogonal test

表4 方差分析Table4 Analysis of variance

由直觀分析可以看出，影響提取效果的因素順序為：超聲功率＞顆粒度＞料液比＞超聲時間，以因素D影響最大，并且 D3＞D2＞D1，B 因素影響最小，故將其定為誤差項進行方差分析。方差分析見表3，方差分析表明，顆粒度、超聲功率對提取效果有顯著性影響（P＜0.05），料液比、超聲時間對提取效果無顯著性影響。結合生產實際，考慮到節(jié)省工時、降低成本等因素，將最佳提取工藝確定為A2B1C1D3，即顆粒度為300目，料液比 1 ∶20（g/mL），提取時間 40 min，超聲功率 500 W。

3.4 工藝驗證

按正交試驗所得最佳工藝條件（顆粒度300目，料液比 1 ∶20（g/mL），提取時間 40 min，超聲功率 500 W）驗證3次，結果見表5。

表5 正交試驗驗證Table5 Validation of orthogonal test

結果表明，驗證試驗結果與正交試驗結果一致，多糖提取率可達到10.98%，該提取工藝條件基本穩(wěn)定。

4 討論

植物多糖廣泛地存在于植物體內，是植物體內極其重要的生物大分子，并且沒有細胞毒性，植物多糖的提取方法較多，主要有溶劑浸漬提取、生物酶溶解提取、超聲輔助提取、微波輔助提取、超臨界流體萃取等方法[4]。薺菜作為藥食兩用植物，在民間有著悠久的使用歷史；而且，我國薺菜資源豐富，把其作為藥用或保健品進行深入研究開發(fā)有著極大優(yōu)勢。

超微粉碎技術是近幾十年來迅速發(fā)展起來的一項高新技術，主要是利用機械設備對物料進行研磨和撞擊，克服物料內部凝聚力，將其粉碎至微米級[11]。與普通粉碎技術相比，超微粉碎技術具有細胞破壁率高、粉體粒徑細、粒徑分布均勻、對物料的活性和營養(yǎng)成分破壞小、能提高原料的利用率等優(yōu)點[12]；因此，超微粉碎技術在食品以及中醫(yī)藥行業(yè)的應用非常廣泛。超聲提取技術是利用超聲波產生的強烈振動、高的加速度、強烈的空化效應、攪拌作用等，從而使藥物的有效成分較快進入溶劑的一種提取方法[13]。

薺菜的傳統(tǒng)應用多以水煎為主，本文采用水為提取溶劑，用超微粉碎技術聯(lián)合超聲輔助法對薺菜多糖進行提取工藝研究。通過使用不同粉碎工藝提取制備薺菜多糖，得出超微粉碎提取工藝比普通粉碎提取工藝薺菜多糖提取率提高較多；可能是薺菜經過超微粉碎后，細胞壁破碎，粒度變得更細小均勻，增加了藥材的比表面積，有利于多糖的溶出，增加了提取率。然后采用單因素試驗和正交試驗相結合，考察影響薺菜多糖提取的各因素，確定了影響薺菜多糖提取率的因素順序：提取超聲功率＞顆粒度＞料液比＞提取時間，確定超微粉碎聯(lián)合超聲輔助提取薺菜多糖的最佳工藝為：顆粒度為 300目，料液比 1∶20（g/mL），提取時間40 min，超聲功率500 W。并做了工藝驗證，在此工藝條件下，薺菜多糖的提取率為10.98%，且能保持穩(wěn)定的提取率。

本試驗表明，超微粉碎技術聯(lián)合超聲輔助提取方法在植物多糖提取方面有一定的優(yōu)勢，為薺菜多糖的提取及進一步開發(fā)利用提供一定的理論依據；同時對全草類藥材的多糖提取有較大的借鑒意義。