酶促酰化對錦葵啶葡萄糖苷呈色及熱降解規(guī)律的影響

彭非，鄧潔紅，*，劉永紅

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，湖南長沙410128；2.食品科學(xué)與生物技術(shù)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南長沙410128；3.湖南生物機(jī)電職業(yè)技術(shù)學(xué)院，湖南長沙410127）

刺葡萄（Vitis davidii Fo?x.），植物學(xué)分類上是東亞種群葡萄屬（Vitis）[1]，果皮為紫色，湖南省西北以及湘南地區(qū)分布廣泛。刺葡萄皮中蘊(yùn)含豐富的花色苷，以錦葵色素為主，是制備花色苷單體的理想原料[2]。在自然條件下，花色苷通常由花色苷配基（花色素）與糖通過糖苷鍵相結(jié)合，僅有少部分以有機(jī)酸?；男问酱嬖?。?；磻?yīng)通常發(fā)生在與花色素相連的糖基上的羥基上，如Saito N等[3]從紫羅蘭花中分離出了5種?；ㄉ?，并發(fā)現(xiàn)是咖啡酸與其在3位和5位上的葡萄糖發(fā)生的?；?。植物中部分花色苷含?；?，是由于酰基轉(zhuǎn)移酶的作用，在植物生長過程中累積而成，但天然含?；幕ㄉ諗?shù)量較少。王維茜等[4]在分離純化刺葡萄花色素時(shí)，發(fā)現(xiàn)分離的4種刺葡萄花色苷單體僅有1種具有酰基結(jié)構(gòu)?，F(xiàn)有研究已證明花色苷穩(wěn)定性與其?；Y(jié)構(gòu)存在密切關(guān)系，由于內(nèi)源?；妮o色作用，單個(gè)花色苷依賴自身芳香酰基的存在，加強(qiáng)分子間的鍵合，使花色苷母核免遭水分子的攻擊，進(jìn)而提高其穩(wěn)定性[5]。Cevallos-Casals B A[6]的研究結(jié)果表明，紫甘薯?；ㄉ蘸枯^豐富，因此其穩(wěn)定性要優(yōu)于非酰化的紫玉米花色苷。

花色苷的穩(wěn)定性會(huì)受到溫度的影響，而熱處理是食品加工中的必要步驟，比如濃縮、干燥、滅菌等。因此，提高花色苷自身熱穩(wěn)定性是擴(kuò)大花色苷系列產(chǎn)品應(yīng)用的關(guān)鍵。外源?；囊胧歉纳苹ㄉ辗€(wěn)定性的新思路。利用酶促反應(yīng)實(shí)現(xiàn)花色苷糖苷?；翘岣呋ㄉ战Y(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的新方法。酶法對催化底物具有良好的專一性和選擇性，反應(yīng)條件溫和，催化效率高，彌補(bǔ)了化學(xué)法?；瘏^(qū)域選擇性差、副產(chǎn)物多、產(chǎn)率低、需要基團(tuán)保護(hù)和脫保護(hù)等諸多缺點(diǎn)[7]，而且是不可逆反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物穩(wěn)定，優(yōu)于單純使用有機(jī)酸或酚酸酰化輔色。

花色苷在保存條件下的含量變化可以反映其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，另外，花色苷呈色與含量也是息息相關(guān)[8]。結(jié)合花色苷的含量變化及測色指標(biāo)，可以較為全面地反映花色苷的穩(wěn)定特性。如González等[9]通過色差指標(biāo)探究花色苷自聚反應(yīng)及其輔色素對新鮮紅葡萄酒顏色的改變。

本文以錦葵啶-3，5-O-雙葡萄糖苷（分子式如圖1所示）單體為原料，對其進(jìn)行酶促?；磻?yīng)。研究對比分析酶促?；幚砬昂蠡ㄉ盏臒岱€(wěn)定性及呈色特征，探究外源?；鶎ㄉ战Y(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的影響。研究結(jié)果可為花色苷結(jié)構(gòu)穩(wěn)定化提供借鑒，為刺葡萄花色苷色素的擴(kuò)大應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

圖1 錦葵啶-3，5-O-雙葡萄糖苷分子式Fig.1 The molecular structure of malvidin-3，5-diglucose

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料

刺葡萄：采于湖南省中方縣刺葡萄果園，自來水淋洗、晾干表面水分后手工剝皮，-24℃冷凍貯藏備用。

1.1.2 試劑

鹽酸、無水乙醇、乙酸乙酯、乙醚、甲醇（分析純）、三氟醋酸[trifluoric acetic acid，TFA，（色譜純）]、聚酰胺樹脂（100目～200目）、分子篩4A型（鈉-A型分子篩）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；大孔吸附樹脂HP-20：日本三菱公司；2-甲基四氫呋喃[2-Methyltetrahydrofuran，2-MeTHF，（色譜純）]：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；肉桂酸乙烯酯：梯希愛化成工業(yè)發(fā)展有限公司；南極假絲酵母脂肪酶B（candila antarctica，CAL-B 5萬U/g）：諾維信生物技術(shù)有限公司。

1.1.3 主要儀器與設(shè)備

AEY-220電子分析天平：湘儀天平儀器設(shè)備有限公司；SX-4-10型箱式電阻爐：天津市泰斯特儀器有限公司；TDZ5臺(tái)式低速離心機(jī)：湖南赫西儀器裝備有限公司；UV-2450紫外分光光度計(jì)：日本島津；THZ-92A氣浴恒溫振蕩器：上海浦東物理光學(xué)儀器廠；RE-2000B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；HH-8數(shù)顯恒溫水浴鍋：上海浦東物理光學(xué)儀器廠；PHSJ-3F pH計(jì)：上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；層析柱（φ1.6×30 cm，B224/29）：上海達(dá)豐玻璃儀器廠；SMY-2000測色色差計(jì)：北京天創(chuàng)尚邦儀器設(shè)備有限公司；KQ5200B超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 刺葡萄花色苷單體的制備

以刺葡萄皮為原料，以料液比1∶6（g/mL）加入80%乙醇（含0.03%鹽酸）提取，避光浸提24 h，抽濾。濾液于0.1 MPa真空度下40℃條件下濃縮回收乙醇，取色素濃縮液分別經(jīng)過無水乙醚，無水乙酸乙酯萃取2次，脫除有機(jī)溶劑，真空蒸發(fā)得到花色苷粗提液。

錦葵花色苷的純化：HP-20樹脂預(yù)處理后濕法裝柱，花色苷粗提液進(jìn)樣至吸附飽和（流出液吸光度值為上樣液的1/10時(shí)。）首先用2BV蒸餾水沖洗，再用酸化乙醇（體積分?jǐn)?shù)80%、含0.05%鹽酸，8BV）洗脫，收集洗脫液于40℃真空濃縮，脫除乙醇。

錦葵花色苷的單體分離：Sephadex LH-20凝膠經(jīng)預(yù)處理后濕法裝柱，脫除乙醇后的洗脫液經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾后進(jìn)柱上樣，然后用酸化甲醇（體積分?jǐn)?shù)50%、含0.1%的TFA）洗脫，分別收集得到3種色素，真空凍干，結(jié)構(gòu)鑒定后，選取其一錦葵素-3，5-O-雙葡萄糖苷（malvidin-3，5-O-diglucoside）為試驗(yàn)單體，純度為99.54%。

1.2.2 酶促酰化花色苷樣品制備

1.2.2.1 有機(jī)溶劑分子篩預(yù)處理

在350℃條件下活化4A分子篩8 h。冷卻后置于干燥器中，添加有機(jī)溶劑2-MeTHF過夜脫水12 h，取液體部分備用。

1.2.2.2 脂肪酶活性的測定

參考國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T23535-2009《脂肪酶制劑》測定CAL-B435的活性。測得CAL-B435的酶活為0.25 U/mg。

1.2.2.3 酶促酰化花色苷制備

準(zhǔn)確稱取錦葵素-3，5-O-雙葡萄糖苷單體13.10 mg，吸取肉桂酸乙烯酯36 μL，4 mL脫水后2-MeTHF、0.3 g分子篩，加入10 mL帶塞小瓶中，超聲波助溶。將帶篩小瓶置于45℃恒溫振蕩器中，加入80 U脂肪酶（CAL-B）啟動(dòng)反應(yīng)。避光振蕩反應(yīng)2.5 h后中止反應(yīng)。將濾液抽濾后置于0.1 MPa真空度下懸蒸1 h，回收2-MeTHF以及殘留的肉桂酸乙烯酯，備用。

1.2.3 酶促酰化對錦葵啶葡萄苷熱穩(wěn)定性影響

稱取已制備的酶促錦葵啶花色苷粉末1.25 mg，用pH3.0磷酸鹽緩沖液溶解，稀釋搖勻，定容至25 mL。20℃條件下避光靜置1 h。于波長530 nm處測定初始吸光度值A(chǔ)0，然后將樣品分別置于3個(gè)不同溫度（60、80、100℃）的恒溫水浴鍋中，每隔1小時(shí)取樣，用自來水迅速冷卻至室溫后，在530 nm波長處測定其吸光度值A(chǔ)t。以未?；腻\葵素-3，5-O-雙葡萄糖苷單體進(jìn)行對照。

1.2.4 花色苷保存率值計(jì)算

式中：A0為熱處理前溶液的吸光度；At為熱處理t h后溶液的吸光度。

1.2.5 色差值的測定

色澤以亮度L*值、紅綠a*值、黃藍(lán)b*值表示。取熱處理后的酶促?；ㄉ杖芤?mL，用測色色差計(jì)測定其色澤。記錄L*、a*、b*數(shù)值。以未?；幕ㄉ諛悠窞閷φ铡?/p>

1.2.6 刺葡萄花色苷的測定

參照鄧潔紅[2]的方法，采用pH示差法測定花色苷含量。

1.2.7 酶促花色苷熱降解動(dòng)力學(xué)參數(shù)

花色苷的降解動(dòng)力學(xué)反應(yīng)基本上符合零級(jí)或一級(jí)動(dòng)力學(xué)模型[10]?；ㄉ杖芤旱奈舛扰c濃度成正比例關(guān)系，，得到花色苷含量的變化與處理時(shí)間的關(guān)系為：

1.2.7.1 花色苷半衰期

花色苷半衰期公式如下：

式中：t為熱處理時(shí)間，h；A0為熱處理前溶液的吸光度；At為熱處理t h后溶液的吸光度；k為反應(yīng)速率常數(shù)；Ct為花色苷初始濃度；C0為花色苷最終濃度。

1.2.7.2 活化能Ea

Arrhenius證明熱降解反應(yīng)速率常數(shù)與反應(yīng)溫度T之間存在聯(lián)系?；罨蹺a計(jì)算公式如下：

建立得到花色苷熱降解動(dòng)力學(xué)模型：

式中：K0為頻率常數(shù)，對于指定的反應(yīng)，A與反應(yīng)物的濃度和溫度無關(guān)；R為氣體常數(shù)，8.314×10-3kJ/（mol·K）；Ea為活化能，kJ/mol；T 為絕對溫度，K；k 為反應(yīng)速率常數(shù)。

1.2.7.3 溫度系數(shù)Q10

溫度系數(shù)Q10，表示溫度每升高10℃，反應(yīng)速率變化的量比，見公式：

式中：Q10為溫度系數(shù)；k1、k2為分別為當(dāng)溫度為T1、T2時(shí)的反應(yīng)速率；T1、T2為熱處理前、后的溫度，℃。

1.2.8 數(shù)據(jù)處理分析

試驗(yàn)設(shè)置2次重復(fù)，結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行分析（差異顯著性水平設(shè)置為 p＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶促?；瘜﹀\葵啶葡萄糖苷溶液熱穩(wěn)定性的影響

酶促?；幚韺﹀\葵啶葡萄糖苷保存率的影響如圖2所示。

圖2 酶促酰化對錦葵啶葡萄糖苷熱穩(wěn)定性的影響Fig.2 Effects of enzymatic acylation on the thermal stability of malvidin glucoside

由圖2可見，無論是?；€是未?；臉悠罚ㄉ毡４媛孰S著加熱溫度的升高和加熱時(shí)間的延長均呈下降趨勢，但酶促?；瘶悠废陆递^為遲緩。經(jīng)過CAL-B酶促?；蟮腻\葵啶葡萄糖苷溶液，在加熱條件為60、80、100℃的處理過程中，花色苷保存率顯著高于酶處理前（p＜0.05）。100℃熱處理5 h，其花色苷保留率為37%，而未?；瘶悠穬H為20%，這表明在加熱條件下，酶促酰化使錦葵花色苷單體的熱穩(wěn)定顯著提高，提高了花色苷單體的熱穩(wěn)定性。

表1 酶促?；瘜﹀\葵啶葡萄糖苷熱降解動(dòng)力學(xué)參數(shù)的影響Table1 Effects of enzymatic acylation on the thermal degradation kinetics parameters of malvidin glucoside

2.2 酶促酰化對刺葡萄花色苷單體熱降解動(dòng)力學(xué)參數(shù)的影響

2.2.1 酶促?；\葵啶葡萄糖苷單體熱降解動(dòng)力學(xué)特征及熱降解動(dòng)力學(xué)參數(shù)

分別用錦葵啶刺葡萄花色苷單體以及酶促酰化錦葵啶刺葡萄花色苷單體樣品，以-ln（Ct/C0）為縱坐標(biāo)，熱處理時(shí)間t為橫坐標(biāo)作圖線性回歸得到相關(guān)系數(shù)R2，兩者一級(jí)反應(yīng)模型下的相關(guān)系數(shù)均R2＞0.97，錦葵啶葡萄糖苷及其酶促?；a(chǎn)物熱降解規(guī)律線性關(guān)系良好，符合熱降解動(dòng)力學(xué)特征。酶促?；瘜﹀\葵啶葡萄糖苷熱降解動(dòng)力學(xué)參數(shù)的影響見表1。

由表1可知，酶促酰化處理錦葵啶刺葡萄花色苷單體前后兩者一級(jí)降解常數(shù)k數(shù)值均隨著溫度的升高均增大；半衰期t1/2隨著熱處理溫度升高急劇下降，符合花色苷一般熱降解規(guī)律。其次，酶促酰化能減少溫度對花色苷自聚合穩(wěn)定作用的干擾，提高分子內(nèi)輔色效應(yīng)和提高溶液體系的耐熱性。在不同加熱溫度條件下，經(jīng)酶促?；幚淼腻\葵啶刺葡萄花色苷單體k值均小于未經(jīng)處理的花色苷單體；同樣，經(jīng)酶促處理的花色苷單體溶液半衰期時(shí)間也均大于未經(jīng)處理的。當(dāng)處理溫度為60℃時(shí)尤為明顯，經(jīng)過酶促處理花色苷單體半衰期為8.10 h遠(yuǎn)大于未經(jīng)酶促處理花色苷單體溶液的4.43 h。

3個(gè)溫度（60，80，100℃）熱處理下酶促?；\葵啶葡萄糖苷半衰期比未?；臉悠贩謩e延長3.67、1.3、0.3 h。最后，在發(fā)生自聚合的花色苷溶液中，Ea（酶促?；\葵啶葡萄苷單體溶液）＞Ea（錦葵啶葡萄苷單體溶液），Ea值分別為 70.167 7、68.658 7 kJ/mol。

Q10值反映了樣品熱反應(yīng)速率常數(shù)k值對溫度升高的敏感程度。當(dāng)加熱溫度從60℃提高至80℃、80℃提高至100℃時(shí)，花色苷的降解速度總體加快。酶促?；箦\葵啶葡萄糖苷的Q10值相比未酰化樣品稍大，說明酶促酰化處理能提高花色苷在特定加熱溫度下的熱穩(wěn)定性，但對鈍化其對加熱溫度變化的敏感性沒有明顯作用。

2.2.2 錦葵啶葡萄糖苷熱降解動(dòng)力學(xué)方程的建立

根據(jù)表1的參數(shù)建立酶促前后錦葵啶葡萄糖苷自聚合熱降解動(dòng)力學(xué)方程，即錦葵啶葡萄糖苷及酶促?；a(chǎn)物熱降解動(dòng)力學(xué)預(yù)測模型見表2。

表2 錦葵啶葡萄糖苷熱降解動(dòng)力學(xué)方程式Table2 Thermal degradation kinetic equations of malvidin glucoside

2.3 酶促?；瘜﹀\葵啶葡萄糖苷加熱條件下色差的影響

多數(shù)研究只對分子修飾后的花色苷的最大吸光度值進(jìn)行檢測。要全面了解花色苷的熱穩(wěn)定特性，對其呈色變化進(jìn)行分析非常必要。研究選取80℃熱處理的樣品，進(jìn)行色差指標(biāo)的檢測，對比分析酶促?；瘜﹀\葵啶葡萄糖苷呈色的影響。

2.3.1 酶促?；瘜﹀\葵啶葡萄糖苷加熱條件下亮度L*的影響

80℃熱處理5 h內(nèi)，錦葵啶葡萄糖苷樣品的亮度L*值如圖3所示。

圖3 酶促?；瘜﹀\葵啶葡萄糖苷樣品亮度L*的影響Fig.3 Effects of enzymatic acylation on L*of malvidin glucoside samples

由圖3可知，在熱處理?xiàng)l件下，酶促酰化前后的錦葵啶葡萄糖苷L*變化略有不同，但基本呈現(xiàn)相同規(guī)律。即隨著熱處理時(shí)間延長，亮度增加，花色苷顏色變淡。這與熱處理花色苷單體變化的規(guī)律結(jié)果相同，花色苷含量與L*值呈負(fù)相關(guān)性。其中，酶促酰化提高花色苷單體穩(wěn)定性，錦葵啶刺葡萄花色苷單體亮度L*變化率（29.3%）遠(yuǎn)大于酶促?；幚淼幕ㄉ諉误w（22.3%）。

2.3.2 酶促?；瘜﹀\葵啶葡萄糖苷酶熱處理?xiàng)l件下紅綠色調(diào)a*的影響

80℃熱處理5 h內(nèi)，錦葵啶葡萄糖苷樣品的紅-綠色調(diào)a*值如圖4所示。

圖4 酶促?；幚韺﹀\葵啶葡萄糖苷樣品a*的影響Fig.4 Effects of enzymatic acylation on a*of malvidin glucoside samples

由圖4可知，隨著熱處理時(shí)間延長，錦葵啶花色苷a*變化規(guī)律與L*相反，即隨著熱處理時(shí)間延長，a*值降低，花色苷紅色色調(diào)變淡。但經(jīng)酶促?；胪庠歹；鶊F(tuán)后，?；\葵啶花色苷a*值增加到19.02（未?；\葵啶花色苷a*值為17.21），與糖苷化與酰化能增強(qiáng)花色苷紅色色調(diào)研究結(jié)論相符[11]。并且，經(jīng)酶促?；蟮腻\葵啶葡萄糖苷熱穩(wěn)定性更好。雖然a*值均隨著時(shí)間增長而減少，與未經(jīng)酶促?；腻\葵啶葡萄糖苷相比，變化幅度較小，下降速率更慢。

2.3.3 酶促酰化對錦葵啶葡萄糖苷熱處理?xiàng)l件下黃藍(lán)色調(diào)b*的影響

80℃熱處理5 h內(nèi)，錦葵啶葡萄糖苷樣品的黃-藍(lán)色調(diào)b*值如圖5所示。

圖5 酶促?；幚韺﹀\葵啶葡萄糖苷樣品b*的影響Fig.5 Effect of enzymatic acylation on b*of malvidin glucoside samples

由圖5可知，隨著熱處理時(shí)間延長，錦葵啶葡萄糖苷以及經(jīng)過酶促?；咸烟擒杖芤篵*值變化均呈上升趨勢，藍(lán)色色調(diào)減弱，黃色色調(diào)增加，總體變化量酶促酰化后試樣整體變化量b*（3.22）小于酰化前試樣變化量b*（4.80）；其次，經(jīng)酶促?；箦\葵啶葡萄糖苷b*值由（-2.57）變化到（-1.89），藍(lán)色色調(diào)增加。

3 討論

?；昂箦\葵啶葡萄糖苷熱降解反應(yīng)仍符合一級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)模型，與文獻(xiàn)報(bào)道的黑莓汁、桑葚等中的花色苷熱降解規(guī)律相一致[12-13]。無論是?；€是未酰化的花色苷，隨著加熱溫度升高，花色苷溶液的穩(wěn)定性呈下降趨勢，降解速率加快。有研究解釋說明花色苷發(fā)生熱降解失色，是由于花色苷母核結(jié)構(gòu)受溫度影響，水解變成甲醇假堿形式，花色苷結(jié)構(gòu)平衡被打破轉(zhuǎn)化成無色查爾酮結(jié)構(gòu)[14-15]。研究表明，花色苷含量與a*值呈正相關(guān)性，與L*值呈負(fù)相關(guān)性，所以加熱條件下花色苷樣品的呈色指標(biāo)發(fā)生相應(yīng)變化，本文研究與相關(guān)文獻(xiàn)結(jié)論相符[16]。研究還發(fā)現(xiàn)，酶促酰化提高了錦葵啶葡萄糖苷的熱穩(wěn)定性，可能是引入的外源?；鶊F(tuán)能降低花色苷分子的極性，而且由自身立體構(gòu)型產(chǎn)生阻礙作用，降低花色苷對親核攻擊的敏感度。

4 結(jié)論

錦葵啶葡萄糖苷以及酶促?；a(chǎn)物在熱處理?xiàng)l件下，降解規(guī)律均符合一級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)模型，但酶促?；磻?yīng)提高了錦葵啶葡萄糖苷的熱穩(wěn)定性。在中等溫度條件下，?；\葵啶葡萄糖苷自聚合效應(yīng)使其耐熱性提高，但長時(shí)間處于高溫條件下，花色苷仍易分解。但酶促?；幚硌娱L花色苷的半衰期，且?；瘶悠坊罨蹺a（70.167 7 kJ/mol）大于未酰化樣品Ea（68.658 7 kJ/mol）；但高溫處理?xiàng)l件下，酶促?；档突ㄉ諏囟茸兓舾卸容^未酰化錦葵啶葡萄糖苷不明顯。熱處理后錦葵啶葡萄糖苷受熱分解，花色苷含量降低，亮度L*值升高，a*值降低，b*值上升，經(jīng)酶促?；幚砗蟮幕ㄉ諉误w總體色差變化幅度較小。