酶法提取芡實殼多糖的研究

董 基 張 帥 許開聰 梁志成

（肇慶學院食品與制藥工程學院，廣東肇慶 526061）

芡實，又名雞頭米，為睡蓮科植物芡的成熟種子。芡實有收斂、滋養(yǎng)、強壯之功效，還具有抗氧化和修復心肌局部缺血等作用。芡實殼是芡實種仁加工過程中產生的主要副產物，約占種仁質量的40%。芡實殼主要被農民作為薪柴或者丟棄，既造成了資源的巨大浪費，又會產生嚴重的環(huán)境問題。目前，國內外對芡實的研究主要集中在營養(yǎng)成分分析、黃酮類物質和淀粉及蛋白的提取等方面，對芡實殼多糖提取方面的研究卻少有報道。芡實殼多糖的利用價值還需進一步開發(fā)利用，如作芡實殼多糖抑菌方面的研究等。本試驗采用酶法提取芡實殼多糖，并通過單因素和正交試驗優(yōu)化了提取工藝。本研究不僅為芡實殼多糖的提取提供數據參考和工藝示范，而且為芡實殼多糖的應用和開發(fā)打下了堅實基礎。

1 材料與方法

1.1 原料和試劑

芡實殼，由本地農戶提供，去掉表面雜質。

纖維素酶，活力10 000U/g和氏璧生物科技有限公司；鹽酸、碳酸鈉、石油醚、丙酮、濃硫酸、乙醇、苯酚等，均為國產分析純。

1.2 儀器設備

數顯恒溫水浴鍋，江蘇省金壇市環(huán)宇科學儀器廠；數顯電熱恒溫干燥箱，上海圣欣儀器有限公司；D Y F-250A高速粉碎機，上海比朗儀器有限公司；pHS-25（數顯）pH計，上海科學儀器有限公司；752紫外可見分光光度計。

1.3 試驗方法

1.3.1 工藝流程

芡實殼→篩選→清洗→烘干→粉碎→干燥至恒重→樣品→索氏提取法去除脂肪→去離子水浸泡→調節(jié)溶液pH值至4.0→纖維素酶水解→水浴浸提→抽濾→多糖濾液→乙醇沉淀→靜置后抽濾→洗滌沉淀物→干燥→芡實殼多糖

1.3.2 芡實殼多糖提取

1.3.2.1 樣品處理

取一定量的芡實殼，除雜后用水清洗，65℃條件下烘干。將烘干后的芡實殼粉碎，過40目篩，將過篩的粉末置于烘箱中于65℃下干燥至恒重。

1.3.2.2 脫脂

稱取適量芡實殼粉末樣品放入濾包中，以石油醚（60℃～90℃）作為溶劑，用索氏提取法除去芡實殼粉末中的油脂，將處理好的芡實殼粉末樣品放在陰涼干燥的容器中備用。

1.3.2.3 調節(jié)溶液pH值

稱取適量已去除脂肪的芡實殼粉末樣品置于燒杯中，加入一定量去離子水進行攪拌；用膠頭滴管向溶液中加入濃度為0.2mol/L的醋酸鈉緩沖液，定容至50mL，并使用pH計，調節(jié)溶液pH值至4.0。

1.3.2.4 纖維素酶水解

加入質量分數3%的纖維素酶于溶液中，55℃恒溫水浴中靜置3 h；酶解完成后，加熱至沸騰，并保持2min滅酶；抽濾取濾液，用分光光度計測定濾液中多糖的吸光度。

1.3.2.5 多糖聚沉

在酶解的濾液中加入3倍體積95%的乙醇溶液，在室溫下靜置12 h。芡實殼多糖會以土黃色絮狀物沉淀析出。

1.3.2.6 干燥

用抽濾法，將樣品過濾出來，取濾渣，分別用無水乙醇、丙酮、乙醚洗滌3次，洗滌后，收集濾渣靜置于通風櫥通風1 h至有機溶劑完全揮發(fā)，然后將樣品于60℃下恒溫干燥2 h，將濾紙上的物質輕刮取出，即得芡實殼多糖。

1.3.3 芡實殼多糖測定

采用苯酚-硫酸法測定芡實殼多糖的含量。

1.3.3.1 繪制葡萄糖標準曲線

用葡萄糖作標樣（1 mg/mL），依次準確吸取0 mL、0.1mL、0.2mL、0.3mL、0.4mL、0.5mL、0.6 mL、0.7 mL、0.8 mL葡萄糖標準溶液于9支25mL的具塞刻度試管，加去離子水至10mL刻度，各加入5%苯酚1.0mL輕輕搖勻后，緩慢加入濃硫酸5mL，再充分搖勻，靜置30min完全冷卻至室溫，將0號具塞試管作為空白對照，用可見分光光度計測波長490 nm處的吸光度，橫坐標對應葡萄糖質量濃度，縱坐標對應多糖溶液吸光度，得到葡萄糖標準曲線，回歸方程為y=0.75x-0.033 2，R2=0.994 4，葡萄糖標準品濃度的線性范圍為0.107mg/mL ～0.865mg/mL。

1.3.3.2 芡實殼中的多糖含量

取粗多糖0.1 g，轉移至10mL容量瓶中，加水至刻度，配得粗多糖溶液。取粗多糖溶液1mL，測定其吸光度。依據標準曲線方程，計算出芡實殼粗多糖的質量濃度，按下式計算多糖提取率：

式中：X——多糖提取率，%；

f——回歸方程中的相關系數；

c——芡實殼多糖的質量濃度，mg/mL；

V——樣品濃度稀釋體積，mL；

M——稱取芡實殼粉末樣品的質量，mg。

1.3.4 芡實殼多糖提取工藝優(yōu)化

首先通過單因素試驗分別考察酶解溫度、酶解時間、加酶量及溶液pH值對多糖提取率的影響，然后利用四因素三水平L9(34)正交試驗優(yōu)化芡實殼多糖的提取工藝。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 酶解溫度對多糖提取率的影響

分別稱取1.0 g已處理過的芡實殼樣品粉末5份，每份加入適量去離子水浸泡搖勻，分別加入質量分數2.0%的纖維素酶，并定容至50mL，酶解時間為2 h，溶液pH為4.0，考察酶解溫度為45℃、50℃、55℃、60℃、65℃時對芡實殼多糖提取率的影響，結果見下頁圖1。

從圖1可看出，隨著酶解溫度的升高，芡實殼多糖的提取率增加，當溫度達到55℃時，提取率達最大值，此后多糖提取率呈現下降趨勢。

2.1.2 酶解時間對多糖提取率的影響

分別稱取1.0 g已處理過的芡實殼樣品粉末5份，每份加入適量去離子水浸泡搖勻，分別加入質量分數2%的纖維素酶，并定容至50mL，酶解溫度為55℃，溶液pH值為4.0，考察酶解時間為1 h、1.5 h、2 h、2.5 h、3 h對芡實殼多糖提取率的影響，結果見圖2。

圖1 酶解溫度對芡實殼多糖提取率的影響

圖2 酶解時間對芡實殼多糖提取率的影響

從圖2可看出，隨著酶解時間的增加，芡實殼多糖的提取率呈上升趨勢，在達到2.5 h時，多糖提取率基本穩(wěn)定。繼續(xù)增加酶解時間，多糖提取率沒有顯著變化。

2.1.3 加酶量對多糖提取率的影響

分別稱取1.0 g已處理過的芡實殼樣品粉末5份，每份加入適量去離子水浸泡搖勻，并定容至50mL，酶解溫度為55℃，酶解時間2.5 h，溶液pH值為4.0，考察纖維素酶加酶量為質量分數1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%時對芡實殼多糖提取率的影響。

從圖3可看出，隨著加入纖維素酶量的增加，芡實殼多糖的提取率也逐漸增加。加酶量為2.5%時，多糖提取率趨于穩(wěn)定，隨著纖維素酶加入量的繼續(xù)增加，酶解的作用效果并不明顯，多糖提取率甚至有降低趨勢。

圖3 加酶量對芡實殼多糖提取率的影響

2.1.4 溶液pH值對多糖提取率的影響

分別稱取1.0 g已處理過的芡實殼樣品粉末5份，每份加入適量去離子水浸泡搖勻，并定容至50 mL，酶解溫度為55℃，酶解時間為2.5 h，加酶量為2.5%，考察溶液 pH值為3.5、4.0、4.5、5.0、5.5時對多糖提取率的影響。

圖4 溶液pH值對芡實殼多糖提取率的影響

從圖4可看出，多糖的提取率隨著溶液pH值的增加呈先增加后減少的趨勢。當溶液pH值達到4.0 h，提取率達到最大值2.41%。當溶液的pH值超過4.0繼續(xù)增加時，多糖提取率反而降低。

2.2 正交試驗結果

在單因素試驗結果的基礎上，設計L9(34)正交試驗優(yōu)化芡實殼多糖提取工藝條件。因素水平見表1，試驗設計及結果見表2。

表1 因素水平表

表2 試驗設計與結果

從表2可看出，各因素對多糖提取率的影響次序為A＞C＞B＞D，即酶解溫度對多糖提取率的影響最大，溶液pH對多糖提取率的影響最??；另外，各因素最優(yōu)水平為A2B3C3D1，即酶解溫度為55℃，酶解時間為3 h，加酶量為3.0%，溶液pH為4.0，在此條件下提取芡實殼多糖，測得多糖提取率為2.45%，高于正交試驗所有結果。

3 結論

本試驗采用酶法提取芡實殼中的多糖。先用索氏提取法去除芡實殼中的脂肪，再用纖維素酶水解芡實殼中的粗纖維，通過恒溫水浴浸提的方法，使芡實殼中的粗纖維沉淀，從而使多糖物質游離出來，再采用苯酚-硫酸法進行芡實殼多糖含量的測定。通過單因素試驗和正交試驗得到酶法提取芡實殼多糖的最優(yōu)的工藝條件為：纖維素酶添加量3%，酶解溫度55℃，溶液pH值4.0，酶解時間3 h，此工藝條件下芡實殼多糖提取率可達2.45%。