肺炎支原體肺炎患兒血清和支氣管肺泡灌洗液中肺表面活性蛋白A、肺表面活性蛋白D和Toll樣受體2水平變化及臨床意義

徐素玲，李 政，張 成

(珠海市人民醫(yī)院兒科，廣東 珠海 519000)

肺炎支原體(mycoplasmapneumoniae，MP)是社區(qū)獲得性肺炎的重要病原體，MP是全球范圍的呼吸道感染的病原體之一[1-2]，肺炎支原體肺炎(mycoplasmapneumoniaepneumonia，MPP)易復(fù)發(fā)或遷延不愈，大環(huán)內(nèi)酯類藥物是治療MP感染的首選抗生素，但隨著MP的耐藥率逐年增長(zhǎng)，臨床上難治性肺炎支原體肺炎(refractorymycoplasmapneumoniaepneumonia，RMPP)逐漸增多[3]，嚴(yán)重危害兒童健康。但到目前為止，MP感染的發(fā)病機(jī)制尚不十分清楚，有研究發(fā)現(xiàn)，肺表面活性蛋白A(pulmonary surfactant protein A，SP-A)、SP-D和Toll樣受體2(Toll-like receptor 2，TLR2)信號(hào)通路在MP所致的炎癥反應(yīng)過程中起相應(yīng)的免疫調(diào)節(jié)作用，其在肺組織中的含量能反應(yīng)肺組織的炎癥狀況[4-6]。目前，主要通過支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluids，BALF)來檢測(cè)肺組織中SP-A、SP-D和TLR含量，而BALF的獲取需行支氣管肺泡灌洗術(shù)，該手術(shù)有嚴(yán)格的適應(yīng)證，且存在創(chuàng)傷、標(biāo)本不易獲取、成本高的缺點(diǎn)，難以在基層醫(yī)院開展，而血清標(biāo)本較BALF獲取容易，在基層醫(yī)院即可采集，基于此，本課題檢測(cè)了MPP患兒血清和BALF中SP-A、SP-D和TLR2的水平并分析其在血清與BALF中水平的相關(guān)性，旨在尋找與肺損傷相關(guān)的敏感血清學(xué)指標(biāo)。

1 資料與方法

1.1一般資料選擇2015年7月至2017年7月珠海市人民醫(yī)院兒科收治的確診為MPP并行支氣肺泡灌洗術(shù)患兒35例為研究對(duì)象，且排除細(xì)菌感染、病毒感染、肺結(jié)核、真菌感染、兒童哮喘及其他肺疾病等。根據(jù)疾病情況將患兒分為MPP組和RMPP組。MPP診斷標(biāo)準(zhǔn)：符合肺炎診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]，肺CT影像顯示肺葉或肺段實(shí)變、不張，血清MP-IgM≥1160或恢復(fù)期抗體滴度呈4倍升高；RMPP診斷標(biāo)準(zhǔn)[8]：臨床確診MPP患兒，應(yīng)用大環(huán)內(nèi)酯類抗生素1周或以上，仍表現(xiàn)發(fā)熱，臨床癥狀和影像學(xué)表現(xiàn)繼續(xù)加重。RMPP組12例，男6例，女6例，年齡1～10(3.2±1.8)歲；MPP組23例，男12例，女11例，年齡1～9(3.9±1.2)歲。另選取同期住院行支氣管鏡異物取出術(shù)且未合并明顯肺部感染患兒10例作為對(duì)照組，其中男5例，女5例，年齡11個(gè)月至9歲，平均(1.2±0.9)歲。3組患兒一般資料比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。全部患者符合支氣管鏡檢查手術(shù)指征，經(jīng)珠海市人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會(huì)批準(zhǔn)并簽署相應(yīng)的知情同意書。

1.2主要試劑與儀器MP抗體試劑盒購(gòu)自珠海麗珠試劑股份有限公司，SP-A、SP-D、TLR2試劑盒購(gòu)自武漢華美生物工程公司；高速離心機(jī)購(gòu)自北京白洋醫(yī)療器械有限公司，酶標(biāo)儀購(gòu)自賽默飛世爾(上海)儀器有限公司，恒溫水浴箱購(gòu)自上海智城分析儀器制造有限公司，超低溫冰箱購(gòu)自合肥中科美菱低溫科技股份有限公司。

1.3血清及BALF標(biāo)本采集MPP組和RMPP組患者在進(jìn)行支氣管肺泡灌洗前30 min內(nèi)，對(duì)照組患者在進(jìn)行支氣管異物取出術(shù)前30 min內(nèi)，抽取外周靜脈血 3 mL，于4 ℃ 下3 000 r·min-1離心 10 min，取上清液置于-80 ℃冰箱待檢。RMPP組和MPP組患者支氣管肺泡灌洗時(shí)間為入院后1～3 d，對(duì)照組患兒在取出異物后給予支氣管肺泡灌洗，留取灌洗液送檢。具體灌洗方法為，患兒采用局部麻醉或全身麻醉，將37 ℃生理鹽水0.5～1.0 mL·kg-1注入病變肺段，用100～150 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)的負(fù)壓立即將灌洗液抽回，共灌洗3～4次，灌洗液于4 ℃下3 000 r·min-1離心10 min，取上清液置于-80 ℃冰箱儲(chǔ)存待檢。

1.4血清及BALF中SP-A、SP-D和TLR2水平檢測(cè)采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)血清及BALF中SP-A、SP-D和TLR2水平。將標(biāo)準(zhǔn)品稀釋后加樣，標(biāo)準(zhǔn)品孔加入標(biāo)準(zhǔn)品100 μL，待測(cè)品孔加入100 μL樣品，振蕩混勻，37 ℃水浴 2 h，棄去液體，甩干，不洗滌。每孔加生物素標(biāo)記抗體100 μL，覆上新的板貼，37 ℃溫育1 h，棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板3次，每次浸泡2 min，甩干，每孔加辣根過氧化酶標(biāo)記親和素工作液 100 μL，覆上新的板貼，37 ℃溫育1 h，棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板5次，每次浸泡2 min，甩干，依序每孔加底物溶液 90 μL，37 ℃避光顯色 15～30 min，依序每孔加終止液50 μL，終止反應(yīng)，在反應(yīng)終止后 5 min內(nèi)用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)測(cè)量各孔的吸光度值。

2 結(jié)果

2.13組患兒血清和BALF中SP-A、SP-D及TLR2水平比較結(jié)果見表1。RMPP組和MPP組患者BALF和血清SP-A、SP-D、TLR2水平均高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；RMPP組患者BALF中TLR2水平高于MPP組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，2組患者血清和BALF中SP-A、SP-D水平比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表13組受試者血清和BALF中SP-A、SP-D及TLR2水平比較

組別n血清SP-A/(g·L-1)SP-D/(g·L-1)TLR2/(g·L-1)BALFSP-A/(g·L-1)SP-D/(g·L-1)TLR2/(g·L-1)對(duì)照組100.4±0.16.5±5.510.2±3.50.2±0.24.9±2.910.6±4.6MPP組230.7±0.2a20.6±21.5a16.0±6.9a0.6±0.1a20.9±14.8a18.5±6.2aRMPP組120.7±0.2a21.4±4.6a18.3±8.9a0.7±0.1a23.3±29.2a38.8±43.9ab

注：與對(duì)照組比較aP<0.05；與MPP組比較bP<0.05。

2.2血清和BALF中各指標(biāo)相關(guān)性血清與BALF中的TRL2水平呈中等相關(guān)(r=0.459，P<0.05)，而血清與BALF中的SP-A、SP-D水平無顯著相關(guān)性(r=0.223、0.175，P>0.05)。

3 討論

MPP特別是RMPP的發(fā)病機(jī)制尚不完全明確，目前認(rèn)為與MP的直接損害和其導(dǎo)致的間接免疫反應(yīng)有關(guān)[9]。臨床上這些患兒常存在明顯的炎性因子過度釋放，應(yīng)用免疫調(diào)節(jié)治療效果較好，提示炎癥反應(yīng)在發(fā)病過程中起重要作用。

SP-A與SP-D均屬于C型凝集素家族，為糖蛋白多聚體結(jié)構(gòu)，主要由肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞(alveolar epithelial type Ⅱ，ATⅡ)分泌[10]。PIBOONPOCANUN等[11]研究發(fā)現(xiàn)，SP-A可明顯延緩MP生長(zhǎng)，可能在機(jī)體發(fā)揮非抗體依賴的早期免疫反應(yīng)中起重要作用。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，SP-A可通過干擾表皮生長(zhǎng)因子受體的表達(dá)抑制黏液的分泌[2]。SP-D能與巨噬細(xì)胞、許多革蘭陽性細(xì)菌、某些革蘭陰性細(xì)菌及MP等結(jié)合，發(fā)揮天然的免疫效應(yīng)，同時(shí)具有調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的作用，介導(dǎo)細(xì)菌的凝集及增加病毒的吞噬與清除作用等[3]。SP-A可通過干擾由嗜酸性粒細(xì)胞介導(dǎo)針對(duì)MP的生物清除效應(yīng)而減輕呼吸道的炎癥和損害。舒林華等[12]研究發(fā)現(xiàn)，MPP肺部病變部位患側(cè)BALF中的SP-A與SP-D水平明顯高于健側(cè)，認(rèn)為可能與MP感染AT Ⅱ，導(dǎo)致SP-A與SP-D合成增加，代償性分泌增高有關(guān)?？紤]到醫(yī)學(xué)倫理問題，本研究對(duì)RMPP和MPP患兒健側(cè)肺不做灌洗術(shù)，所以選擇氣管異物取出術(shù)患兒作為對(duì)照，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，RMPP和MPP患兒無論是血清還是BALF中SP-A與SP-D水平均明顯高于對(duì)照組，表明MP感染肺部可導(dǎo)致ATⅡ細(xì)胞分泌大量的SP-A與SP-D，從而起到相應(yīng)的免疫調(diào)節(jié)作用，提示SP-A和SP-D可作為肺部感染損傷標(biāo)志物來監(jiān)測(cè)。

TLR是一類跨膜受體，主要功能為激活天然免疫和參與特異性免疫應(yīng)答的啟動(dòng)，TLR2信號(hào)通路在肺組織對(duì)抗MP感染而產(chǎn)生的天然應(yīng)答中起關(guān)鍵作用[4]，MP膜脂蛋白通過TLR2上調(diào)單核巨噬細(xì)胞中膜結(jié)合型細(xì)胞間黏附分子-1的表達(dá)，在一定程度上影響著MP感染所致炎性反應(yīng)的強(qiáng)弱[5]。有研究發(fā)現(xiàn)，MPP特別是伴有喘息的患兒血清中TLR2和TLR4的表達(dá)明顯增高，與其MP抗體滴度呈正相關(guān)[13]。這些研究表明，TLR2信號(hào)通路在MP誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)中起重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)，RMPP組和MPP組患兒BALF及血清TLR2水平均高于對(duì)照組，且RMPP組患兒BALF中TLR2水平更高，提示肺組織局部TLR2水平升高與炎癥反應(yīng)程度密切相關(guān)，但條件所限，本次研究獲取的只是這些指標(biāo)在MPP病程中1個(gè)時(shí)間點(diǎn)的數(shù)據(jù)，而不是動(dòng)態(tài)觀察其變化，能否對(duì)MPP及RMPP有臨床指導(dǎo)意義尚有待進(jìn)一步研究。本研究還發(fā)現(xiàn)，血清與BALF中SP-A、SP-D水平無顯著相關(guān)性，血清與BALF中TRL2水平呈中等相關(guān)，血清標(biāo)本獲取較BALF容易，因此，動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)MPP特別是RMPP患兒血清TLR2水平變化可為臨床診斷肺部炎癥提供一定依據(jù)。