18β-甘草次酸的結(jié)構(gòu)修飾及生物活性研究進(jìn)展

馬 媛，石明輝，戴均貴，趙 軍，徐 芳，顧政一

(1.新疆維吾爾自治區(qū)藥物研究所，烏魯木齊 830004；2.新疆維吾爾自治區(qū)中藥民族藥研究所，烏魯木齊 830002；3.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥物研究所,天然藥物活性物質(zhì)與功能國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100050)

甘草次酸(glycyrrhetinic acid，GA，C30H46O4)是甘草的主要活性成分之一，屬五環(huán)三萜類化合物，由于三萜皂苷母核18位手性碳原子(C-18)構(gòu)型不同，有α和β2種差向異構(gòu)體，見(jiàn)圖1。甘草次酸具有廣泛的藥理活性[1-2]，尤其是其衍生物具有抗炎[3-5]、抗腫瘤[6-9]、抗氧化[10]、抗病毒[11-12]和抑菌[13-14]等活性，已被廣泛應(yīng)用于食品、煙草、醫(yī)藥和化妝品等行業(yè)[1]。但長(zhǎng)期服用該藥可引起類醛固酮增多癥(pseudo aldosteronism)等不良反應(yīng)(表現(xiàn)為患者長(zhǎng)期用藥后出現(xiàn)水腫、濕疹、低血鉀和鈉潴留等現(xiàn)象)，且其水溶性差，高濃度時(shí)對(duì)正常細(xì)胞有毒性，限制了其在臨床上的廣泛應(yīng)用。為了改善甘草次酸的溶解性、增強(qiáng)藥理活性并降低和克服上述不良反應(yīng)，國(guó)內(nèi)外專家對(duì)其進(jìn)行了大量的化學(xué)合成[1-2]，此外，近年來(lái)開(kāi)展的采用植物細(xì)胞、微生物和酶對(duì)甘草三萜類化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾的研究，已經(jīng)成為國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究的熱點(diǎn)，并取得顯著進(jìn)展[15]。本文綜述了近年國(guó)內(nèi)外有關(guān)18β-甘草次酸的結(jié)構(gòu)修飾及生物活性的研究進(jìn)展。

18α-glycyrrhetinic acid

18β-glycyrrhetinic acid

圖1甘草次酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)類型

Fig.1 Chemical structure types of glycyrrhetinic acid

1 化學(xué)合成

國(guó)內(nèi)外學(xué)者利用化學(xué)合成方法對(duì)18β-甘草次酸從不同的角度進(jìn)行了結(jié)構(gòu)修飾和改造，合成了大量結(jié)構(gòu)各異的衍生物，研究其不同的藥理活性，取得了顯著的研究成果。

1.1A環(huán)部位修飾的甘草次酸衍生物及活性

1.1.1A環(huán)具有不同官能團(tuán)衍生物的化學(xué)合成 高振北等[16]采用化學(xué)合成方法對(duì)18β-甘草次酸A環(huán)進(jìn)行改造，合成了一系列新型18β-甘草次酸A環(huán)官能團(tuán)化衍生物。構(gòu)效關(guān)系分析表明，A環(huán)內(nèi)烯鍵的形成對(duì)抑制人類腫瘤細(xì)胞增殖有重要影響。

1.1.22位羥基部位修飾的甘草次酸衍生物及活性 Chadalapaka G等[17]通過(guò)分析構(gòu)效關(guān)系，在18β-甘草次酸A環(huán)C-2位引入一系列吸電子基團(tuán)合成1-烯-3-氧-甘草次酸衍生物，這些衍生物對(duì)人膀胱癌細(xì)胞KU7、253JB-V和人胰腺癌細(xì)胞Panc-1、Panc-28均有不同程度的抑制活性，尤其是1，2-烯-2-三氟甲基-3-羰基-18β-甘草次酸和1，2-烯-2-氰基-3-羰基-18β-甘草次酸的抗癌效果更優(yōu)。

1.1.33位羥基部位修飾的甘草次酸衍生物及活性 Csuk R等[18]研究發(fā)現(xiàn)，在甘草次酸C-3位引入酰氯等活潑基團(tuán)，可合成一系列不同碳鏈的C-3位烷胺基取代18β-甘草次酸甲酯衍生物，其中7個(gè)碳原子的烷胺基取代的生物活性表現(xiàn)更為出色。

1.1.42位和3位羥基部位同時(shí)修飾的甘草次酸衍生物及活性 Gao C等[19]在C-2和C-3位引入各種五元稠合雜環(huán)，得到18個(gè)新的GA衍生物，評(píng)估了它們對(duì)8種不同腫瘤細(xì)胞系細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制活性，其中活性最強(qiáng)化合物的半抑制濃度(IC50)為5.19～11.72μmol·L-1，比GA強(qiáng)11倍。研究表明，GA及其衍生物對(duì)受試腫瘤細(xì)胞的遷移具有抑制作用，尤其是衍生物的抗轉(zhuǎn)移活性比GA強(qiáng)20倍。

1.2C環(huán)11位羰基部位修飾的甘草次酸衍生物及活性 18β-甘草次酸C環(huán)的結(jié)構(gòu)修飾一般主要集中在C-11位羰基上。羰基通?？梢杂肸n或Zn-Hg齊還原成亞甲基，或硼氫化鈉選擇性還原成羥基，而保留C-30位羧基。

Lin D等[20]將11-羰基還原為11-羥基得到了11-deoxy glycyrrhetinic acid(11-DOGA)，研究發(fā)現(xiàn)，GA和11-DOGA以劑量和時(shí)間依賴方式顯著抑制胃癌細(xì)胞的生存能力，兩者均可有效抑制裸鼠胃癌細(xì)胞腫瘤形成，GA對(duì)胃癌細(xì)胞的體內(nèi)和體外毒性均比11-DOGA高。結(jié)果表明，對(duì)甘草次酸C環(huán)11位羰基的結(jié)構(gòu)修飾能夠有效降低其毒性和不良反應(yīng)。

1.3E環(huán)30位羧基部位修飾的甘草次酸衍生物及活性 陳湊喜等[21]合成了5個(gè)含吡啶雜環(huán)多酰胺結(jié)構(gòu)的18β-甘草次酸衍生物，對(duì)其抑制人宮頸癌HeLa細(xì)胞活性進(jìn)行了體外評(píng)價(jià)，初步發(fā)現(xiàn)目標(biāo)化合物對(duì)人宮頸癌HeLa細(xì)胞具有細(xì)胞毒活性，能夠有效抑制HeLa細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)其凋亡，IC50最小值僅為0.02μmol·L-1，均優(yōu)于臨床常用抗腫瘤藥物阿糖胞苷。

Yan T L等[22]合成了一系列新的甘草次酸衍生物，評(píng)價(jià)了它們對(duì)4種癌細(xì)胞系(MCF-7、HeLa、HepG2和A-549)的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體2(VEGFR2)的抑制活性及其抗增殖性能。其中化合物3a(3β-羥基-30-(4-苯基-1-哌嗪基)-齊墩果烷型-12-烯-11，30-二酮)對(duì)MCF-7細(xì)胞具有最好的抑制活性，也顯示出對(duì)VEGFR2酪氨酸激酶最有效的抑制活性。對(duì)化合物3a進(jìn)行了結(jié)合模式的對(duì)接模擬，結(jié)果表明，其能在VEGFR2活性位點(diǎn)處結(jié)合。

1.4多環(huán)同時(shí)結(jié)構(gòu)修飾的甘草次酸衍生物及活性

1.4.13位羥基部位和(或)30位羧基部位修飾的甘草次酸衍生物及活性 馬紅艷等[23]以18β-甘草次酸為先導(dǎo)化合物，分別通過(guò)高溫堿催化構(gòu)型轉(zhuǎn)化反應(yīng)及硫酸催化酯化反應(yīng)，合成了5個(gè)甘草次酸衍生物：18α-甘草次酸(產(chǎn)率63%)、3-乙酰-18β-甘草次酸(產(chǎn)率96%)、3-乙酰-18α-甘草次酸(產(chǎn)率90%)、18β-甘草次酸甲酯(產(chǎn)率79%)和18α-甘草次酸甲酯(產(chǎn)率67%)。2013年木合布力·阿布力孜等[24]和高苗苗等[25]對(duì)C-3位和C-30位酯化或酰胺化、C-11位脫氧及C-18βH的構(gòu)型轉(zhuǎn)化等進(jìn)行化學(xué)修飾，合成了14個(gè)甘草次酸衍生物(包括甘草次酸酯類、酰胺類和11-脫氧衍生物)。

1.4.2其他同時(shí)修飾的甘草次酸衍生物及活性

1.4.2.1A環(huán)和E環(huán)同時(shí)修飾的甘草次酸衍生物及活性 Gao Y等[26]設(shè)計(jì)并合成了15個(gè)含C-30氮雜環(huán)和不同A環(huán)取代基的新型甘草次酸衍生物，這些衍生物均具有抑制人白血病HL-60細(xì)胞的增殖作用。研究發(fā)現(xiàn)，與具有2-羥基亞甲基-3-酮基，異唑或2-氰基-3-酮基的化合物相比，在A-環(huán)上具有氰基-烯酮官能團(tuán)的化合物表現(xiàn)出更好的生長(zhǎng)抑制效果。

孟艷秋等[27]設(shè)計(jì)并合成了12個(gè)甘草次酸C-3和C-30衍生物，并對(duì)其體外抗腫瘤活性進(jìn)行研究。結(jié)果表明，上述衍生物對(duì)腫瘤細(xì)胞MCF-7和A549的抑制活性均明顯強(qiáng)于GA，其中2，3-環(huán)氧-11-氧代-齊墩果烷型-30-羧酸乙酯(GA-I1)、2，3-環(huán)氧-11-氧代-齊墩果烷型-30-羧酸芐酯(GA-I2)和N-[3，11-氧代-齊墩果烷型-12-烯-30-酰]-環(huán)己胺(GA-II1)對(duì)MCF-7和A549 2種細(xì)胞表現(xiàn)出很好的抑制活性，明顯高于對(duì)照藥吉非替尼。

1.4.2.2A環(huán)、C環(huán)和E環(huán)同時(shí)修飾的甘草次酸衍生物及活性 Salomatina O V等[8]在A環(huán)引入2-氰基-3-氧代-1-烯部分，在E環(huán)C-30位形成甲酯，同時(shí)改變C環(huán)和E環(huán)中的雙鍵和羰基的形成位置，合成了4個(gè)甘草次酸的新半合成衍生物，使用鼠類巨噬細(xì)胞樣和腫瘤細(xì)胞的生物測(cè)定顯示，2-氰基-3，12-氧代-齊墩果烷型-30-羧酸甲酯與甲基查爾酮不同，因其C環(huán)中不具有9(11)-雙鍵而表現(xiàn)出對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制活性和抗炎的高選擇性。

Li X等[28]合成了14個(gè)具有C環(huán)不同結(jié)構(gòu)的2-氰基-3，12-二氧代-18β-齊墩果烷型-1，9(11)-二烯-30-酸(CDODO-Me-12)類似物，以確定抑制人白血病HL-60細(xì)胞生長(zhǎng)和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的活性基團(tuán)。C環(huán)中的不飽和基團(tuán)需要維持抑制細(xì)胞生長(zhǎng)和誘導(dǎo)凋亡的能力。化合物2-氰基-3-氧代-9(11)，12-二烯-齊墩果烷型-30-羧酸甲酯C環(huán)中具有9(11)，12-二烯，與c-FLIP水平降低相關(guān)的CDODO-Me-12相比，表現(xiàn)出顯著的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)能力，但與Mcl-1和XIAP無(wú)關(guān)。它具有降低GSH消耗的能力，能代表通過(guò)與CDODO-Me-12不同的機(jī)制起作用的新活性化合物。

孟艷秋等[29]對(duì)甘草次酸C-3、C-11和C-30進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，設(shè)計(jì)并合成了7個(gè)目標(biāo)產(chǎn)物，抗腫瘤活性篩選結(jié)果表明，3β-疊氮基-齊墩果烷型-12-烯-30-羧酸乙酯對(duì)腫瘤細(xì)胞MCF-7的抑制率比母體顯著提高，3β-疊氮基-齊墩果烷型-12-烯-30-羧酸乙酯、3β-疊氮基-齊墩果烷型-12-烯-30-羧酸正丙酯和3β-疊氮基-齊墩果烷型-12-烯-30-羧酸正丁酯對(duì)腫瘤細(xì)胞A549的抑制率均比母體有所提高。陳蘭等[30]對(duì)甘草次酸C-3、C-11和C-30進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，合成了6個(gè)目標(biāo)產(chǎn)物，經(jīng)過(guò)鑒定確認(rèn)了其化學(xué)結(jié)構(gòu)。

唐百達(dá)等[31]對(duì)18β-甘草次酸A環(huán)、11位羰基及30位羧基進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，設(shè)計(jì)并合成了20個(gè)2-取代-3-氧代-齊墩果烷型-12-烯-30-酰胺類化合物。這些衍生物對(duì)PC-3細(xì)胞顯示了不同程度的生長(zhǎng)抑制活性，明顯好于其母體化合物，其中N-(2-氰基-18β-齊墩果烷型-1，12-二烯-30-酰基)哌啶的活性最強(qiáng)。構(gòu)效關(guān)系表明，A環(huán)引入2-氰基-3-氧代-1-烯的化合物活性最好，2位引入羥亞甲基與2，3位駢合異惡唑環(huán)類化合物活性相當(dāng)，2位引入氰基的化合物活性較弱；30位羧基與哌啶及哌啶基哌啶成酰胺活性較好，與 4-甲基哌嗪、嗎啉和哌嗪成酰胺活性較弱。

黃敏等[32]為了探討18β-甘草次酸C環(huán)雙鍵位置對(duì)其抗腫瘤活性的影響，設(shè)計(jì)并合成了新型C環(huán)上具有9(11)-烯基結(jié)構(gòu)的化合物，以此C環(huán)骨架對(duì)A環(huán)及30位羧基進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，共24個(gè)GA衍生物，并測(cè)定了它們對(duì)人前列腺癌PC-3和白血病HL-60細(xì)胞的體外抑制活性。結(jié)果表明，大多數(shù)衍生物對(duì)上述細(xì)胞顯示出比GA更強(qiáng)的生長(zhǎng)抑制活性，尤以2-氰基-3-氧代-齊墩果烷型-1，9-雙烯-30-羧酸甲酯的活性最強(qiáng)。

Zou L W等[33]將GA的11-氧代-12-烯轉(zhuǎn)化為12-二烯部分，將C-3羥基和C-30羧基分別轉(zhuǎn)化成3-O-β-羧基丙?；鸵一?，得到了一系列GA衍生物，致使先導(dǎo)化合物18β-GA對(duì)人羧酸酯酶2(hCE2)和hCE1的選擇性抑制作用顯著增強(qiáng)。

2 生物轉(zhuǎn)化

生物轉(zhuǎn)化(biotransformation)是利用微生物、動(dòng)植物的培養(yǎng)體系或其產(chǎn)生的酶制劑對(duì)外源性化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾而獲得有價(jià)值產(chǎn)物的生物化學(xué)反應(yīng)過(guò)程，亦稱為生物催化(biocatalysis)，其本質(zhì)是利用生物體系本身所產(chǎn)生的酶對(duì)外源性化合物進(jìn)行酶催化反應(yīng)，反應(yīng)類型有水解、羥基化和糖基化等，具有高度的立體和位置選擇性、反應(yīng)條件溫和、催化效率高、反應(yīng)類型多和不污染環(huán)境等特點(diǎn)。采用生物轉(zhuǎn)化方法可進(jìn)行化學(xué)法相對(duì)較難進(jìn)行的反應(yīng)，從中尋找并獲得新的高活性或低毒性的天然活性先導(dǎo)化合物，是創(chuàng)制藥物新分子的重要手段之一[15]。

2.1植物組織細(xì)胞培養(yǎng)

2.1.1以植物組織細(xì)胞作為生物轉(zhuǎn)化體系 將植物組織細(xì)胞培養(yǎng)應(yīng)用于甘草中有效成分的生物轉(zhuǎn)化，具有重復(fù)性好、材料充足和周期短等優(yōu)點(diǎn)。Orihara Y等[34]用桉樹(shù)的細(xì)胞懸浮培養(yǎng)液轉(zhuǎn)化18β-GA，得到2個(gè)產(chǎn)物，即28-羥基-18β-甘草次酸-30β-吡喃葡萄糖酯和23，28-二羥基-18β-甘草次酸-30β-吡喃葡萄糖酯。這種游離懸浮細(xì)胞的生物轉(zhuǎn)化系統(tǒng)具有直接使用前體、細(xì)胞轉(zhuǎn)移限制少、不存在影響細(xì)胞活力和生理狀態(tài)等優(yōu)點(diǎn)，是目前使用最多的一個(gè)轉(zhuǎn)化系統(tǒng)。

2.1.2以毛狀根作為生物轉(zhuǎn)化體系 相對(duì)于懸浮細(xì)胞，毛狀根具有生長(zhǎng)快速、加倍時(shí)間短、遺傳和生化穩(wěn)定的特點(diǎn)。Asada Y等[35]利用人參毛狀根具有糖基化和丙二酰基化的生物轉(zhuǎn)化能力，對(duì)18β-GA進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化，由于18β-GA的C-3位羥基、C-30位連有羧基，利用人參毛狀根培養(yǎng)能使其糖基化和丙二?；?，得到6個(gè)轉(zhuǎn)化產(chǎn)物。

2.2微生物轉(zhuǎn)化 Qin Y J等[36]用短刺小克銀漢霉(Cunninghamellablakesleeana)轉(zhuǎn)化GA，得到2個(gè)主產(chǎn)物和4個(gè)次主產(chǎn)物。2個(gè)主產(chǎn)物鑒定為3-酮基-7β-羥基甘草次酸和7β-羥基甘草次酸，并篩選了底物及2個(gè)主產(chǎn)物的抑菌活性。結(jié)果表明，短刺小克銀漢霉AS 3.970對(duì)GA具有羥基化作用，GA和2個(gè)主產(chǎn)物對(duì)耐藥菌糞腸球菌具有良好的抑菌活性。

馬媛等[37-38]和Ma Y等[39]利用52種微生物進(jìn)行18β-GA的微生物轉(zhuǎn)化研究，經(jīng)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)10種真菌對(duì)GA有不同程度的轉(zhuǎn)化，選擇短刺小克銀漢霉CGMCC 3.970對(duì)GA進(jìn)行微生物轉(zhuǎn)化的放大實(shí)驗(yàn)，經(jīng)純化和制備最終獲得 18 個(gè)甘草次酸衍生物，其中 12 個(gè)為新化合物。結(jié)果提示短刺小克銀漢霉CGMCC 3.970對(duì)GA具有選擇性酮基化、羥基化及酰基化作用，藥理活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，所得衍生物中7β，15α-二羥基-18β-甘草次酸的體外神經(jīng)保護(hù)活性最強(qiáng)，其IC50值為0.000 45μmol·L-1，甚至比甘草酸的活性更強(qiáng)。

2.3酶水解轉(zhuǎn)化 吳少杰等[40]分別利用酶水解法及液體發(fā)酵轉(zhuǎn)化法制備單葡萄糖醛酸基甘草次酸，酶水解法產(chǎn)物的產(chǎn)率為23.7%，液體發(fā)酵法的產(chǎn)率為10%。由此可知，利用酶水解法轉(zhuǎn)化甘草次酸，可顯著提高目標(biāo)化合物的轉(zhuǎn)化率。直接以酶為反應(yīng)體系的生物轉(zhuǎn)化，是獲得單一目標(biāo)產(chǎn)物的有效途徑，具有方便、快捷、產(chǎn)率高的優(yōu)勢(shì)，在工業(yè)化生產(chǎn)中具有應(yīng)用價(jià)值。

3 結(jié)語(yǔ)

甘草次酸的生物轉(zhuǎn)化一直是國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)，然而目前基本上處于實(shí)驗(yàn)室研究階段，未能實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化，國(guó)內(nèi)對(duì)其研究剛剛起步，但其作用不可忽視，今后需要加大研究力度，逐步了解其生物轉(zhuǎn)化的途徑、反應(yīng)的特點(diǎn)和條件，尋找新的、藥理活性更強(qiáng)的化合物，進(jìn)而研制新藥。大量研究表明，用微生物轉(zhuǎn)化18β-甘草次酸具有廣闊的應(yīng)用前景，獲得的目標(biāo)組分多，但要獲得專一性強(qiáng)的微生物轉(zhuǎn)化菌株和適宜的轉(zhuǎn)化條件較為困難。加強(qiáng)菌株篩選及簡(jiǎn)便、快捷的轉(zhuǎn)化條件研究，對(duì)利用微生物轉(zhuǎn)化甘草次酸的工業(yè)化生產(chǎn)具有重要意義。