環(huán)糊精水提法提取積雪草中的三萜類化合物

常 春，趙亞南，曾愛國(guó)

(1.西安交通大學(xué)藥學(xué)院，西安 710061；2.陜西省食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，西安 710065)

積雪草為傘形科植物Centellaasiatica(L.)Urb.的干燥全草，性苦、寒，味辛，歸肝、脾、腎經(jīng)，具有清熱利濕、解毒消腫的功效，臨床上用于濕熱黃疸、中暑腹瀉、石淋血淋、癰腫瘡毒和跌撲損傷[1]?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，積雪草具有抗抑郁[2]、抗腫瘤[3]、修復(fù)皮膚系統(tǒng)[4]、抗胃潰瘍[5]和保護(hù)心血管系統(tǒng)[6]等作用。積雪草的化學(xué)成分主要有三萜類、多炔烯烴類、黃酮類和揮發(fā)油類，還含有綠原酸、內(nèi)消旋肌醇、黃酮醇、脂肪酸、天胡姜堿、葉綠素、烴類、木脂素類、糖、鞣質(zhì)和多元酚類等成分[7-8]。三萜類化合物是積雪草發(fā)揮藥理作用的主要活性成分，主要包括積雪草苷、羥基積雪草苷、積雪草苷-B、積雪草酸和羥基積雪草酸5種化合物[8-9]。目前，積雪草三萜類化合物主要采用乙醇提取，但會(huì)污染環(huán)境、成本較高，且具有一定的危險(xiǎn)性[10-11]。

環(huán)糊精(cyclodextrin，CD)作為一種環(huán)狀低聚糖，具有內(nèi)疏水、外親水的空腔，可與多數(shù)化合物結(jié)合成主客體包合物，從而增加化合物的溶解度和生物利用度[12-13]。近年來，采用環(huán)糊精提取中藥活性成分的研究逐漸增多，取得了較理想的結(jié)果[14-15]。與有機(jī)溶劑提取相比，環(huán)糊精提取法以水為溶劑，具有安全、經(jīng)濟(jì)和環(huán)保的特點(diǎn)。本文以環(huán)糊精水溶液作為提取溶劑，采取回流法提取積雪草中三萜類化合物，并研究環(huán)糊精種類、環(huán)糊精濃度、料液比、藥材粒度及提取時(shí)間對(duì)提取的影響。

1 儀器與試藥

1.1儀器 高效液相色譜儀，包括LC-20A泵、SPD-20A檢測(cè)器和LC solution色譜工作站，AUY220型電子天平(日本島津公司)；AT-330型柱溫箱(天津奧特賽恩斯儀器有限公司)；KQ3200DB型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；SHB-3型循環(huán)水多用真空泵(鄭州杜甫儀器廠)；DF-101S型恒溫水浴鍋(河南省予華儀器有限公司)。

1.2試藥 羥基積雪草苷(質(zhì)量分?jǐn)?shù)>99%)，積雪草苷(質(zhì)量分?jǐn)?shù)>99%)，積雪草苷-B(質(zhì)量分?jǐn)?shù)>99%)，積雪草酸(質(zhì)量分?jǐn)?shù)>95%)和羥基積雪草酸(質(zhì)量分?jǐn)?shù)>98%)，均購(gòu)自西安開來生物工程有限公司；α-CD、β-CD、γ-CD、HP-β-CD和Glu-β-CD，均購(gòu)自南京森貝伽生物技術(shù)有限公司；甲醇、乙腈(色譜純，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司)；磷酸(分析純，天津市天力化學(xué)試劑有限公司)；三蒸水(自制)；積雪草藥材，購(gòu)自西安市南郊藥材市場(chǎng)，經(jīng)西安交通大學(xué)藥學(xué)院郭增軍教授鑒定為傘形科植物積雪草Centellaasiatica(L.)Urb.的干燥全草。

2 方法

2.1環(huán)糊精水提法 精密稱取積雪草粉末2 g，置于圓底燒瓶中，再加入適量環(huán)糊精水溶液，加熱回流提取。

2.2索氏提取法 精密稱取積雪草粉末(過6號(hào)篩)2 g，加適量石油醚，索氏提取6 h，棄去石油醚；再加入適量乙醇提取5 h，至溶液顏色不再加深，移至蒸發(fā)皿中，蒸干；加適量水制成混懸液，再加入水飽和的正丁醇萃取3次；正丁醇液蒸干，用適量甲醇溶解。

2.3含量測(cè)定方法

2.3.1對(duì)照溶液的配制 分別精密稱取積雪草苷對(duì)照品、積雪草苷-B對(duì)照品、羥基積雪草苷對(duì)照品、羥基積雪草酸對(duì)照品和積雪草酸對(duì)照品分別10，10，10，4和2 mg，置于同一20 mL量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，將上述混合對(duì)照溶液逐級(jí)稀釋，得到積雪草苷、積雪草苷-B、羥基積雪草苷、羥基積雪草酸和積雪草酸質(zhì)量濃度分別為5～500，5～500，5～500，2～200和1～100 μg·mL-1的系列溶液。

2.3.2樣品溶液的配制 取2.1或2.2項(xiàng)下方法制備的提取液過濾，取續(xù)濾液，用0.22 μm微孔濾膜過濾，進(jìn)樣分析。

2.3.3色譜條件 色譜柱：TIANHE Kromasil C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：乙腈-水溶液(含2 mL·L-1磷酸)(25∶75)；柱溫：30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：205 nm；流速：1.0 mL·min-1；進(jìn)樣量：10 μL。混合對(duì)照品與積雪草樣品色譜圖見圖1。

圖1HPLC圖

a.積雪草樣品；b.混合對(duì)照品；1.積雪草苷；2.積雪草苷-B；3.羥基積雪草苷；4.羥基積雪草酸；5.積雪草酸。

Fig.1 HPLC chromatograms

a.Centellaasiaticasample；b.mixed standard solution；1.asiaticoside；2.asiaticoside B；3.madecassoside；4.madecassic acid；5.asiatic acid.

3 結(jié)果

3.1環(huán)糊精種類 稱取適量α-CD、β-CD、γ-CD、HP-β-CD和Glu-β-CD，分別用三蒸水溶解，制得含α-CD、β-CD、γ-CD、HP-β-CD和Glu-β-CD濃度均為20 mmol·L-1的環(huán)糊精水溶液。稱取積雪草粉末(過3號(hào)篩)2 g，置于圓底燒瓶中，按照料液比1∶10(g·mL-1)加入環(huán)糊精水溶液，加熱回流提取1 h。比較α-CD、β-CD、γ-CD、HP-β-CD和Glu-β-CD對(duì)積雪草三萜類化合物提取率的影響，見圖2。

圖2不同環(huán)糊精對(duì)積雪草三萜類化合物提取的影響

Fig.2 Effects of different cyclodextrins on the extraction of terpenoids fromCentellaasiatica

由圖2可知，當(dāng)采用α-CD、β-CD、HP-β-CD和Glu-β-CD提取時(shí)，羥基積雪草酸和積雪草酸的提取率極低；而采用γ-CD提取時(shí)，羥基積雪草酸和積雪草酸的提取率較高。采用β-CD、HP-β-CD、γ-CD和Glu-β-CD提取時(shí)，積雪草苷、積雪草苷-B和羥基積雪草苷的提取率較高，且相差較??；而采用α-CD提取時(shí)，積雪草苷、積雪草苷-B和羥基積雪草苷的提取率較低。相對(duì)于α-CD、β-CD、Glu-β-CD和HP-β-CD 4種環(huán)糊精，γ-CD對(duì)積雪草中5種三萜類化合物的提取率均較高，因此選擇γ-CD提取積雪草三萜類化合物。

3.2γ-CD的濃度 稱取適量γ-CD，配制成濃度分別為10，15，20，25和30 mmol·L-1的γ-CD水溶液。稱取積雪草粉末(過3號(hào)篩)2 g，置于圓底燒瓶中，按照料液比1∶10(g·mL-1)加入環(huán)糊精水溶液，加熱回流提取1 h?？疾歃?CD濃度對(duì)積雪草三萜類化合物提取效率的影響，見圖3。

圖3γ-CD濃度對(duì)積雪草三萜類化合物提取的影響

Fig.3 Effects ofγ-CD concentration on the extraction of terpenoids fromCentellaasiatica

由圖3可知，積雪草苷、積雪草苷-B和羥基積雪草苷在10～30 mmol·L-1γ-CD水溶液中的提取率保持在穩(wěn)定的水平；而羥基積雪草酸和積雪草酸的提取率隨著γ-CD濃度的增加先增大后減小，在γ-CD濃度為15 mmol·L-1時(shí)最大。因此，選擇γ-CD的濃度為15 mmol·L-1。

3.3料液比 稱取積雪草粉末(過3號(hào)篩)2 g，置于圓底燒瓶中，按照料液比1∶10，1∶15，1∶20，1∶25和1∶30(g·mL-1)加入15 mmol·L-1γ-CD水溶液，加熱回流提取1 h?？疾炝弦罕葘?duì)積雪草三萜類化合物提取率的影響，見圖4。

圖4料液比對(duì)積雪草三萜類化合物提取的影響

Fig.4 Effects of solid-liquid ratio on the extraction of terpenoids fromCentellaasiatica

由圖4可知，積雪草酸和羥基積雪草酸的提取率隨著料液比的增加而增加，羥基積雪草苷的提取率呈降低趨勢(shì)，積雪草苷和積雪草苷-B的提取率在料液比為1∶20～1∶30之間差別不大。在料液比為1∶20時(shí)，5種三萜類化合物的提取率均較高，因此料液比選擇1∶20(g·mL-1)。

3.4提取時(shí)間 稱取積雪草粉末(過3號(hào)篩)2 g，置于圓底燒瓶中，按照料液比1∶20 (g·mL-1)加入15 mmol·L-1γ-CD水溶液，加熱回流提取0.5，1.0，1.5，2.0，3.0和5.0 h。考察提取時(shí)間對(duì)積雪草三萜類化合物提取率的影響，見圖5。

圖5提取時(shí)間對(duì)積雪草三萜類化合物提取的影響

Fig.5 Effects of extracting time on the extraction of terpenoids fromCentellaasiatica

由圖5可知，提取時(shí)間對(duì)積雪草苷、積雪草苷-B和羥基積雪草苷的提取率影響不明顯，但羥基積雪草酸和積雪草酸的提取率隨提取時(shí)間的增加而減小。提取時(shí)間為1.0 h時(shí)，5種三萜類化合物的提取率均較高，因此提取時(shí)間選擇1.0 h。

3.5粒度 稱取一定粒度的積雪草粉末2 g，置于圓底燒瓶中，按照料液比1∶20 (g·mL-1)加入15 mmol·L-1γ-CD水溶液，加熱回流提取1 h?？疾焖幉牧６葘?duì)積雪草三萜類化合物提取率的影響，見圖6。

圖6藥材粒度對(duì)積雪草三萜類化合物提取的影響

Fig.6 Effects of particle size on the extraction of terpenoids fromCentellaasiatica

由圖6可知，積雪草三萜類化合物的提取率隨著藥材粒度的減小而增加，因此本實(shí)驗(yàn)選擇過6號(hào)篩的積雪草粉末。

3.6環(huán)糊精水提法與索氏提取法比較 分別采用優(yōu)化的環(huán)糊精水提工藝和索氏提取法對(duì)積雪草進(jìn)行提取，比較積雪草苷、積雪草苷-B、羥基積雪草苷、羥基積雪草酸和積雪草酸的提取率。在索氏提取法中，積雪草苷、積雪草苷-B、羥基積雪草苷、羥基積雪草酸和積雪草酸的提取率分別為3.76，1.44，1.71，2.60和2.47 mg·g-1；在環(huán)糊精水提法中，5種三萜類化合物的提取率分別為1.58，1.36，1.87，3.61和1.49 mg·g-1。由此可見，環(huán)糊精水提法中羥基積雪草苷和羥基積雪草酸的提取率高于索氏提取法，而積雪草苷、積雪草苷-B和積雪草酸的提取率低于索氏提取法。

4 結(jié)論與討論

以環(huán)糊精水溶液作為提取溶劑，采取回流法提取積雪草中的三萜類化合物，研究環(huán)糊精種類、環(huán)糊精濃度、料液比、藥材粒度及提取時(shí)間等因素對(duì)提取率的影響。結(jié)果表明，積雪草三萜類化合物的最佳提取條件為γ-CD 15 mmol·L-1，藥材粒度為過6號(hào)篩，料液比選擇1∶20(g·mL-1)，提取時(shí)間為1.0 h。

環(huán)糊精是經(jīng)葡萄糖糖基轉(zhuǎn)移酶發(fā)酵后得到的由α-1，4-葡萄糖苷鍵連接若干個(gè)D-吡喃葡萄糖單元形成的環(huán)狀低聚物，其具內(nèi)疏水、外親水的空腔，可與許多物質(zhì)(客分子)結(jié)合成主客體包合物，在制劑開發(fā)、藥物分析、生物傳感器、合成人造酶、化妝品和食品科技等方面的應(yīng)用越來越廣泛。環(huán)糊精與客分子形成主客體包合物時(shí)，客體分子的大小、形狀應(yīng)與環(huán)糊精的內(nèi)腔相匹配。積雪草三萜類成分主要是五環(huán)三萜骨架的化合物，分子體積和相對(duì)分子質(zhì)量較大，與內(nèi)腔較大的γ-CD匹配性較好。因此，相對(duì)于α-CD、β-CD、Glu-β-CD和HP-β-CD 4種環(huán)糊精，γ-CD對(duì)積雪草中5種三萜類化合物的提取率較高。此外，環(huán)糊精的內(nèi)腔疏水，因此客分子的極性也影響主客體包合物的形成和穩(wěn)定。一般情況下，客分子的極性越小，越易形成主客體包合物，主客體包合物越穩(wěn)定。因此，環(huán)糊精水提法中，極性較小的羥基積雪草酸和積雪草酸的提取率相對(duì)較高；而極性較大的積雪草苷和積雪草苷-B的提取率相對(duì)較小。

環(huán)糊精水提法可將積雪草三萜類化合物的提取和包合過程一步完成，簡(jiǎn)化工藝，對(duì)開拓積雪草三萜類化合物在藥學(xué)方面的應(yīng)用是有意義的嘗試；且本方法以水作為溶劑，具有安全、經(jīng)濟(jì)和環(huán)保的優(yōu)點(diǎn)。