關(guān)節(jié)鏡清理聯(lián)合自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療膝骨關(guān)節(jié)炎療效觀察

張鐘元 江和訓(xùn) 趙錦偉 焦明航

【摘 要】目的：觀察關(guān)節(jié)鏡清理聯(lián)合自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植修復(fù)膝骨關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨缺損臨床療效。方法：選取2010年8月至2014年8月行自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療的膝骨關(guān)節(jié)炎患者53例（61膝），男36例（41膝），女17例（20膝）；年齡39～69歲，平均（57.70±1.68）歲；退行性關(guān)節(jié)炎49例（57膝），創(chuàng)傷性關(guān)節(jié)炎4例（4膝）；Kellgren-Lawrence（K-L）分級(jí)Ⅰ級(jí)35例，Ⅱ級(jí)18例。隨訪2～3年，平均2.4年。治療前及治療后3個(gè)月、1年、2年根據(jù)西安大略和麥克馬斯特大學(xué)骨關(guān)節(jié)炎指數(shù)（WOMAC）、視覺(jué)模擬評(píng)分法（VAS）和軟骨損傷評(píng)分系統(tǒng)（CaLs）對(duì)患者的臨床表現(xiàn)、MRI上骨異常信號(hào)和軟骨損傷面積進(jìn)行比較，對(duì)膝關(guān)節(jié)功能及磁共振結(jié)果進(jìn)行評(píng)定。結(jié)果：隨訪期間，3例（5膝）患者行人工全膝關(guān)節(jié)置換術(shù)，終止隨訪，50例（56膝）獲得隨訪。①治療后3個(gè)月、1年，膝關(guān)節(jié)功能較治療前有明顯好轉(zhuǎn)，疼痛減輕，治療后WOMAC評(píng)分及VAS評(píng)分呈下降趨勢(shì)（P < 0.05）；治療后2年，上述指標(biāo)與治療前比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。②治療后磁共振顯示：治療后3個(gè)月可見(jiàn)新生類軟骨生長(zhǎng)，受損關(guān)節(jié)軟骨及軟骨下骨有明顯修復(fù)，軟骨損傷評(píng)分系統(tǒng)（CaLs）評(píng)分降低，與治療前比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）；治療后1年及2年后軟骨修復(fù)不明顯，CaLs評(píng)分較治療前差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。結(jié)論：關(guān)節(jié)鏡清理聯(lián)合自體骨髓間充質(zhì)細(xì)胞移植能有效促進(jìn)早期膝骨關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨的修復(fù)，延緩膝骨關(guān)節(jié)炎病程的進(jìn)展。

【關(guān)鍵詞】 骨關(guān)節(jié)炎，膝；自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；移植；軟骨修復(fù)

膝骨關(guān)節(jié)炎（knee osteoarthfitis，KOA）是一種多因素導(dǎo)致的慢性骨關(guān)節(jié)疾患，以膝關(guān)節(jié)疼痛、腫脹和活動(dòng)受限為主要癥狀，是中老年人常見(jiàn)的關(guān)節(jié)疾病。迄今為止，尚沒(méi)有一種能夠有效治愈KOA的方法。自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）作為一類具有高度自我更新能力和多向分化潛能的成體干細(xì)胞，其在體外不同條件誘導(dǎo)下可分化為不同組織的能力，為修復(fù)受損軟骨提供了可能性。筆者采用自體BMSCs移植治療KOA關(guān)節(jié)軟骨缺損53例（61膝），現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 臨床資料

1.1 一般資料 選取2010年8月至2014年8月在山東省文登整骨醫(yī)院行自體BMSCs移植治療的KOA患者53例（61膝），男36例（41膝），女17例（20膝）；年齡39～69歲，平均（57.70±1.68）歲；退行性關(guān)節(jié)炎49例（57膝），創(chuàng)傷性關(guān)節(jié)炎4例（4膝）。Kellgren-Lawrence（K-L）分級(jí)I級(jí)35例，Ⅱ級(jí)18例。本研究經(jīng)山東省文登整骨醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn) 按照美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)會(huì)（ACR）修訂的《膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎分類標(biāo)準(zhǔn)》中KOA診斷標(biāo)準(zhǔn)[1]。

1.3 納入標(biāo)準(zhǔn) ①符合上述診斷標(biāo)準(zhǔn)；②符合

X線K-L分級(jí)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)[2]Ⅰ～Ⅱ級(jí)；③患者身體狀況良好，無(wú)手術(shù)禁忌，能夠遵醫(yī)囑完成本治療且接受隨訪；④患者簽署知情同意書。

1.4 排除標(biāo)準(zhǔn) ①合并有肝、腎、心腦血管，以及造血系統(tǒng)嚴(yán)重疾病及精神病，不能耐受手術(shù)者；②手術(shù)部位有嚴(yán)重皮膚疾病者；③對(duì)多種藥物過(guò)敏或過(guò)敏體質(zhì)者；④治療過(guò)程中因各種因素未完成治療及隨訪者。

2 方 法

2.1 治療方法

2.1.1 關(guān)節(jié)鏡清理術(shù)前準(zhǔn)備 所有患者常規(guī)完善血常規(guī)、血生化類和凝血功能等排除感染、凝血障礙等情況評(píng)估手術(shù)可行性，完善膝關(guān)節(jié)站立位X線片及膝關(guān)節(jié)MRI，評(píng)估患膝軟骨及軟骨下骨的情況，完成軟骨損傷評(píng)分系統(tǒng)（CaLs）評(píng)分[3]。術(shù)前進(jìn)行膝關(guān)節(jié)西安大略和麥克馬斯特大學(xué)骨關(guān)節(jié)炎指數(shù)（WOMAC）評(píng)分和視覺(jué)模擬評(píng)分法（VAS）評(píng)分，以了解患膝的功能狀況。

2.1.2 關(guān)節(jié)鏡清理 所有患者在硬膜外麻醉下行常規(guī)膝關(guān)節(jié)清理手術(shù)，對(duì)受損膝關(guān)節(jié)進(jìn)行全面探查，評(píng)價(jià)關(guān)節(jié)軟骨磨損情況，刨削修整受損軟骨面，清理炎性滑膜組織，沖洗關(guān)節(jié)腔，然后使用微骨折椎磨損剝脫的軟骨面進(jìn)行垂直鉆孔至創(chuàng)面有新鮮滲血[4-7]。

2.1.3 血小板裂解液、BMSCs的制備及培養(yǎng) 行關(guān)節(jié)鏡手術(shù)前，抽取自體靜脈血300 mL用于制備血小板裂解液。離心機(jī)以1048 r·min-1離心20 min

（離心半徑9 cm），吸取上層血清液，-20 ℃冰箱過(guò)夜后保存于-80 ℃冰箱中。從-80 ℃冰箱中取出置于37 ℃水浴鍋中融化5 min，將融化后的血清置于離心機(jī)以3054 r·min-1離心6 min（離心半徑9 cm），所獲得的上清液即為血小板裂解液。在血小板裂解液中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.86 mg·mL-1的氯化鈣和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為28.56 IU·mL-1的凝血酶，混勻，37 ℃培養(yǎng)6 d后，將樣本置于離心機(jī)以3054 r·min-1離心6 min（離心半徑9 cm）激活，將激活的血小板裂解液在-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

行關(guān)節(jié)鏡手術(shù)同時(shí)，消毒患者髂后上棘處，用30 000 IU低分子量肝素鈉預(yù)處理的注射器穿刺抽取骨髓血60 mL，用于制備、培養(yǎng)BMSCs。利用密度梯度離心法將有核細(xì)胞從骨髓血中分離出來(lái)，在培養(yǎng)液（DMEM + 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%血小板裂解液 + 8 μg·mL-1強(qiáng)力霉素 + 6 μg·mL-1低分子量肝素鈉）中培養(yǎng)，2～3 d換液1次。第8天用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.25%的胰蛋白酶消化后進(jìn)行傳代培養(yǎng)、純化，取第2代細(xì)胞分裝超低溫冷凍儲(chǔ)藏備用。

2.1.4 BMSCs移植 BMSCs移植術(shù)于關(guān)節(jié)鏡術(shù)后1個(gè)月進(jìn)行。術(shù)前3 d復(fù)蘇凍存的第2代BMSCs，培養(yǎng)后于移植當(dāng)天用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.25%胰蛋白酶收集BMSCs，離心機(jī)以2340 r·min-1離心6 min（離心半徑9 cm），棄上清后以3 mL激活的血小板裂解液重懸。患者仰臥位，膝關(guān)節(jié)常規(guī)關(guān)節(jié)腔穿刺，抽取關(guān)節(jié)積液，拔下注射器針管，留置針頭接入裝有細(xì)胞生長(zhǎng)因子或混合均勻的BMSCs懸液的無(wú)菌針管，緩慢注入關(guān)節(jié)腔。施術(shù)第1天植入血小板裂解液3 mL，第4天植入BMSCs懸液3 mL，第7天植入細(xì)胞生長(zhǎng)因子3 mL。拔出穿刺針頭，無(wú)菌紗布按壓針眼處5 min，患者俯臥30 min，每5 min屈伸活動(dòng)膝關(guān)節(jié)10次。上述注射3次為1個(gè)療程，間隔1個(gè)月1次，共治療3個(gè)療程。

2.1.5 術(shù)后處理 術(shù)后注意穿刺點(diǎn)的護(hù)理，治療過(guò)程中，不負(fù)重情況下行膝關(guān)節(jié)屈伸功能鍛煉及患肢肌肉舒縮功能鍛煉，避免劇烈活動(dòng)。定期復(fù)查血常規(guī)及肝腎功能，評(píng)估患者移植后的反應(yīng)。若出現(xiàn)不良反應(yīng)，立即停止治療并評(píng)估繼續(xù)治療的可行性。

2.2 評(píng)價(jià)指標(biāo) CaLs評(píng)分：深度低于50%的淺表缺損評(píng)分為1分（A），超過(guò)50%為2分（B），全層的軟骨缺損為3分（C），深度最大的缺損部分不超過(guò)整個(gè)缺損直徑的50%評(píng)分為0.5分（D），超過(guò)50%評(píng)分為1分（E）。

WOMAC評(píng)分即通過(guò)患者回答48 h內(nèi)的關(guān)節(jié)情況，包括疼痛、僵直、進(jìn)行日?；顒?dòng)的難度等。沒(méi)有困難為0分，輕微困難1分，中等困難2分，非常困難3分，極端困難4分。總分最小分值0，最大分值96。VAS可作為評(píng)分尺評(píng)價(jià)患者主觀疼痛，0為沒(méi)有疼痛，10為極端疼痛。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以表示，采用配對(duì)t檢驗(yàn)。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié) 果

隨訪期間3例（5膝）患者行人工全膝關(guān)節(jié)置換術(shù)，終止隨訪；50例（56膝）獲得隨訪，隨訪時(shí)間2～3年，平均2.4年。治療后3個(gè)月、1年，WOMAC評(píng)分、VAS評(píng)分較治療前均有明顯改善（P < 0.05）；治療后2年，WOMAC評(píng)分、VAS評(píng)分與治療前比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。治療后3個(gè)月，磁共振顯示可見(jiàn)新生類軟骨生長(zhǎng)，受損關(guān)節(jié)軟骨及軟骨下骨有明顯修復(fù)，CaLs評(píng)分較治療前均有明顯改善（P < 0.05）；治療后1年及2年后軟骨修復(fù)不明顯，CaLs評(píng)分與治療前比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。見(jiàn)表1。

4 討 論

KOA是一種多因素導(dǎo)致的慢性關(guān)節(jié)退行性病變，癥狀以膝關(guān)節(jié)疼痛、腫脹和活動(dòng)受限為主，臨床上以骨質(zhì)增生、關(guān)節(jié)軟骨損傷等為特點(diǎn)，是臨床治療的一個(gè)難題。關(guān)節(jié)軟骨屬于透明軟骨，其內(nèi)部無(wú)神經(jīng)、血管及淋巴管的分布，未分化細(xì)胞無(wú)法進(jìn)入損傷部位進(jìn)行修復(fù)，而且軟骨細(xì)胞包埋于致密的膠原-蛋白多糖基質(zhì)中，限制了細(xì)胞的增殖和遷移能力，軟骨細(xì)胞基質(zhì)的合成能力有限，無(wú)法提供軟骨修復(fù)所需要的營(yíng)養(yǎng)。所以軟骨一旦損傷無(wú)法生成透明軟骨，只能夠由纖維軟骨修復(fù)；但纖維軟骨的生物學(xué)、生物化學(xué)和生物力學(xué)特性與透明軟骨有較大差別，在關(guān)節(jié)活動(dòng)過(guò)程中很容易發(fā)生退變，進(jìn)一步加速骨關(guān)節(jié)炎的進(jìn)程。隨著病程的進(jìn)展，癥狀會(huì)逐漸加重，影響患者的工作和生活質(zhì)量[1-2，8-9]。

及早的臨床干預(yù)能延緩病情發(fā)展，改善膝關(guān)節(jié)功能，提高患者的生活質(zhì)量。目前，治療KOA的原則是緩解關(guān)節(jié)疼痛，保持并改善膝關(guān)節(jié)及下肢功能，臨床治療有藥物保守治療、物理治療、膝關(guān)節(jié)置換手術(shù)等方法，但療效差、療程長(zhǎng)、不良反應(yīng)多、手術(shù)創(chuàng)傷大等一直困擾著醫(yī)患。隨著細(xì)胞生物理論的進(jìn)展和對(duì)KOA病因病理研究的不斷深入，許多臨床醫(yī)生采用細(xì)胞技術(shù)進(jìn)行KOA的基礎(chǔ)和臨床研究，并取得了一定的效果[1-2，8，10]。

自體BMSCs生物技術(shù)廣泛應(yīng)用于KOA關(guān)節(jié)軟骨缺損治療領(lǐng)域，具有取材方便、無(wú)免疫排異反應(yīng)、能夠快速增殖、多次傳代不會(huì)喪失其干細(xì)胞的特性、多向分化潛能、不涉及社會(huì)倫理和法律問(wèn)題等優(yōu)勢(shì)[11-12]。國(guó)內(nèi)外學(xué)者已做了大量研究，提示BMSCs在骨與軟組織損傷修復(fù)方面有效。ZHOU等[13]用羥基磷灰石與自體BMSCs在體外培養(yǎng)72 h，植入兔關(guān)節(jié)軟骨缺損處，術(shù)后16，32周處死，行病理形態(tài)學(xué)檢查和Ⅱ型膠原免疫組化染色，發(fā)現(xiàn)形成完整的透明軟骨及軟骨下骨。ABBAS等[14]運(yùn)用人BMSCs與軟骨細(xì)胞在體外共同培養(yǎng)形成成熟關(guān)節(jié)軟骨，且與周圍正常關(guān)節(jié)軟骨結(jié)合良好。

本次研究首先行關(guān)節(jié)鏡清理清除損傷軟骨面及炎性滑膜組織，可減輕關(guān)節(jié)炎性癥狀，阻止關(guān)節(jié)軟骨面進(jìn)一步磨損；磨損區(qū)軟骨面鉆孔提供良好的著床，同時(shí)刺激自體BMSCs聚集。注射的血小板裂解液中含有血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子，可促進(jìn)局部血管形成，增加局部血液供應(yīng)，促進(jìn)BMSCs向軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化。適當(dāng)?shù)年P(guān)節(jié)輕柔不負(fù)重活動(dòng)不僅不增加關(guān)節(jié)面的磨損，還有助于改善關(guān)節(jié)軟骨的營(yíng)養(yǎng)，舒展攣縮的關(guān)節(jié)周圍軟組織，促進(jìn)修復(fù)。治療后3個(gè)月與1年，WOMAC評(píng)分及VAS評(píng)分均有明顯改善，提示自體BMSCs促進(jìn)了軟骨缺損面的修復(fù)，緩解了癥狀。但治療后2年上述評(píng)分較治療前改善不大，可能與骨關(guān)節(jié)炎持續(xù)發(fā)展，修復(fù)層進(jìn)一步磨損有關(guān)，所以遠(yuǎn)期觀察效果未確定，但BMSCs的使用明顯延緩了軟骨缺損的發(fā)展進(jìn)程。治療后3個(gè)月，磁共振顯示可見(jiàn)新生類軟骨生長(zhǎng)，受損關(guān)節(jié)軟骨及軟骨下骨有明顯修復(fù)，CaLs評(píng)分較治療前均有明顯改善；治療后1年及2年后軟骨修復(fù)不明顯，CaLs評(píng)分與治療前比較無(wú)改善。雖然患者癥狀改善明顯，但是并無(wú)確切證據(jù)顯示新生透明軟骨能完全修復(fù)缺損，需要病理學(xué)進(jìn)一步確認(rèn)。

本研究表明，關(guān)節(jié)鏡清理聯(lián)合自體BMSCs移植能有效地促進(jìn)早期KOA關(guān)節(jié)軟骨的修復(fù)，從而改善膝關(guān)節(jié)功能，延緩KOA病程的發(fā)展；但后期治療效果不明顯，無(wú)法改變KOA的結(jié)局。本次研究為回顧性研究，樣本量少，評(píng)價(jià)指標(biāo)缺乏組織病理學(xué)評(píng)價(jià)，結(jié)果可能會(huì)存在偏倚，需要多中心大樣本隨機(jī)對(duì)照研究進(jìn)一步驗(yàn)證。

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