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    腹膜間皮細胞轉(zhuǎn)分化小鼠模型差異表達長鏈非編碼RNA的篩選及意義

    2018-07-20 06:02:28王玉潯安雅臣蔣艷茹
    山東醫(yī)藥 2018年24期
    關(guān)鍵詞:間皮細胞轉(zhuǎn)分化腹膜

    王玉潯,安雅臣,蔣艷茹

    (1華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院,河北唐山063000;2唐山市中醫(yī)醫(yī)院)

    腹膜透析是終末期腎臟疾病患者行腎臟替代治療的主要方式之一。腹膜結(jié)構(gòu)、功能的正常是保證腹膜透析有效性的關(guān)鍵因素。腹膜間皮細胞是腹膜組織的主要組成細胞。研究表明,長期暴露在高糖腹膜透析液中,腹膜間皮細胞發(fā)生轉(zhuǎn)分化,導(dǎo)致腹膜纖維化,最終使腹膜功能喪失[1~3]。長鏈非編碼RNA(lncRNA)可通過基因調(diào)控參與多種疾病的發(fā)生發(fā)展過程。2016年10~11月,本研究分析了lncRNA與腹膜間皮細胞轉(zhuǎn)分化的關(guān)系,旨在為進一步闡明腹膜間皮細胞轉(zhuǎn)分化的分子生物學(xué)機制提供理論依據(jù)。

    1 材料

    SPF級C57BL/6雄性小鼠20只,7~8周齡,體質(zhì)量(25±3)g,由北京實驗動物有限責任公司提供。兔抗鼠轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)、E鈣黏蛋白(E-cadherin)、α平滑肌肌動蛋白(α-SMA)一抗 ,均購自Epitomics公司(USA)。

    2 方法與結(jié)果

    2.2 動物分組及處理 小鼠均給予適應(yīng)性喂養(yǎng)7天,隨機分為對照組和模型組,每組10只。對照組正常飼養(yǎng)4周;模型組給予4.5%高糖腹膜透析液腹腔注射,每次注射劑量為1 mL/kg,1次/d,連續(xù)4周。

    2.3 腹膜組織形態(tài)學(xué)觀察 模型組透析4周結(jié)束時處死兩組小鼠,取壁層腹膜組織,進行HE染色,觀察腹膜間皮細胞及其周圍結(jié)締組織形態(tài)學(xué)改變。結(jié)果顯示,對照組腹膜組織呈一層致密、光滑的薄層,覆蓋一層扁平狀間皮細胞,細胞連接良好,間皮下基底膜薄,與結(jié)締組織相連,無膠原纖維組織沉積,未見毛細血管擴張、充血及炎性細胞浸潤;模型組腹膜組織薄厚不均,部分間皮細胞腫脹變形甚至脫落,纖維裸露,炎性細胞增多,膠原沉積增多,間皮下致密層增厚。提示腹膜間皮細胞發(fā)生轉(zhuǎn)分化。

    2.4 腹膜間皮細胞轉(zhuǎn)分化蛋白TGF-β1、E-cadherin、α-SMA表達檢測 采用Western blotting法。取2.3制備的兩組小鼠臟層腹膜組織,利用RIPA蛋白裂解液提取總蛋白,BCA法檢測蛋白濃度。取約150 μg加樣緩沖液100 ℃沸水煮沸5 min,充分變性后進行SDS-PAGE電泳,轉(zhuǎn)膜(240 Ma,120 min),5%脫脂牛奶常溫下封閉1 h;分別加入TGF-β1(1∶3 000)、E-cadherin(1∶500)、α-SMA(1∶300)一抗,4 ℃搖床過夜;洗膜后加入辣根過氧化物酶標記的二抗常溫孵育2 h;再次洗膜,用ECL發(fā)光液在暗室進行壓片、顯影、曝光。以GAPDH為內(nèi)參照,采用圖像分析系統(tǒng)掃描確定膠片上雜交條帶的相對吸光度(A)值,進行相對定量分析。結(jié)果顯示,與對照組比較,模型組腹膜間皮細胞TGF-β1、α-SMA表達升高,E-cadherin蛋白表達下降,見表1;提示轉(zhuǎn)分化模型建立成功。

    表1 兩組腹膜間皮細胞TGF-β1、E-cadherin、α-SMA蛋白表達比較

    注:與對照組比較,*P<0.05。

    2.5 差異表達lncRNA篩選 采用芯片技術(shù)。取2.3獲得的兩組小鼠臟層腹膜組織(每組3只),TRIzol法提取組織總RNA,用Invitrogen SuperScript ds-cDNA synthesis kit合成雙鏈cDNA,進行熒光標記并雜交漂洗,用Agilent芯片掃描儀(G2565CA)進行掃描,使用Agilent Feature Extraction(v10.7)軟件對雜交圖片進行分析并提取數(shù)據(jù)。使用Agilent Gene Spring軟件對數(shù)據(jù)進行歸一化和差異分析。差異篩選標準: fold>1.5 &P<0.05。上述工作均由北京博奧生物有限公司完成。根據(jù)芯片表達數(shù)據(jù)結(jié)果,將對照組與模型組的lncRNA表達譜進行比較,兩組表達量比值在2倍以上且有統(tǒng)計學(xué)意義的lncRNA共757條,2倍以上上調(diào)的共311條,2倍以上下調(diào)的共446條。同時,基因芯片也檢測了在腹膜細胞轉(zhuǎn)分化過程中mRNA的表達譜,差異表達量比值在2倍以上且有統(tǒng)計學(xué)意義的mRNA共1 431條,2倍以上上調(diào)的共489條,2倍以上下調(diào)的共942條。兩組表達量差異最大的前20個lncRNA見表1,表達量差異最大的前20個mRNA見表2。

    表1 兩組表達量差異最大的前20個lncRNA

    表2 兩組表達量差異最大的前20個mRNA

    2.6 差異表達mRNA的GO功能注釋分析 根據(jù)Gene Ontology數(shù)據(jù)庫將差異表達mRNA按分子生物學(xué)功能、生物學(xué)過程和在細胞組件中的作用三個方面進行功能富集,發(fā)現(xiàn)在腹膜間皮細胞轉(zhuǎn)分化中,差異表達的靶基因mRNA主要參與細胞膜的固有組成、細胞周邊組織結(jié)構(gòu)組成、炎癥防御反應(yīng)等。篩選出的前4位GO功能注釋名稱及其基因數(shù)見表3。

    表3 差異表達lncRNA的GO功能注釋

    2.7 KEGG通路分析 利用Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)數(shù)據(jù)庫對差異表達mRNA進行信號通路分析,觀察在腹膜纖維化過程中發(fā)生顯著變化的mRNA可能與哪些信號通路的改變有關(guān),結(jié)果表明差異表達mRNA可能參與了真核生物翻譯過程、膜蛋白合成等途徑。篩選出的前4位生物學(xué)通路名稱及其基因數(shù)見表4。

    2.8 差異lncRNA mRNA表達檢測 采用RT-PCR法對差異表達lncRNA進行驗證。選擇差異表達倍數(shù)較大(>5倍),長度為500~2 000 nt,表達豐度在1 000以上的2個上調(diào)的和2個下調(diào)的lncRNA即ri|4732442J12|PX00051O23|2580、NONMMUT055611、NONMMUT002253、NONMMUT064302進行RT-PCR驗證。采用ABI7500PCR儀以SYBR Green熒光染料摻入法相對定量,同時以GAPDH為內(nèi)參照,采用2-ΔΔCt法計算目的基因的差異表達倍數(shù)。

    表4 差異表達mRNA的KEGG通路及基因數(shù)

    結(jié)果顯示,模型組NONMMUT002253、NONMMUT064302相對表達量低于對照組,ri|4732442J12|PX00051O23|2580、NONMMUT055611相對表達量高于對照組(P均<0.01)。結(jié)果與芯片檢測結(jié)果基本一致,表明芯片結(jié)果的可靠性。見表5。

    表5 兩組差異表達lncRNA mRNA相對表達量比較

    注:與對照組比較,*P<0.01。

    3 討論

    上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)是指上皮來源的細胞在特定的生理和病理條件下向間質(zhì)性細胞發(fā)生轉(zhuǎn)化的一種現(xiàn)象[4,5]。研究表明,EMT的過程包括細胞形態(tài)學(xué)和基因型改變,細胞黏附分子(如E-鈣黏蛋白)表達減少,使立方上皮細胞下調(diào)或失去細胞間相互作用;上皮細胞外形演變?yōu)樗笮卫w維細胞形態(tài),細胞角蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生改變;獲得了某些間質(zhì)細胞或纖維原細胞的特性,如α-SMA、Vimtin蛋白、骨橋蛋白、Snail、slug及其他間質(zhì)特性蛋白表達上調(diào)等[6~9]。

    腹膜間皮細胞是腹膜的主要組成細胞,是維持腹膜結(jié)構(gòu)完整、功能穩(wěn)定和保證腹膜透析有效性的重要因素。腹膜間皮細胞發(fā)生EMT被認為是腹膜纖維化的始動環(huán)節(jié)[10,11],其發(fā)生的初期是一個可逆的過程。早期干預(yù)腹膜間皮細胞轉(zhuǎn)分化、防止腹膜纖維化及保護腹膜透析患者的腹膜功能是目前研究的重點。lncRNA是一類長度超過200個核苷酸的非編碼RNA分子,隨著全基因組分析技術(shù)的快速發(fā)展及廣泛應(yīng)用,研究人員發(fā)現(xiàn)lncRNA可作為人類基因組中一類重要的表觀遺傳調(diào)控因子,以RNA形式通過表觀遺傳調(diào)控、轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后調(diào)控等多層面調(diào)控DNA甲基化、組蛋白修飾和染色質(zhì)重構(gòu),最終調(diào)節(jié)靶基因的表達及翻譯[12~16],廣泛參與細胞分化、增殖和代謝,參與多種疾病的發(fā)生及發(fā)展[17~19]。目前關(guān)于lncRNA與EMT的關(guān)系及其在腫瘤領(lǐng)域的重要性備受關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn),lncRNA的調(diào)控作用具有組織特異性,在不同腫瘤調(diào)控中發(fā)揮不同的作用。lncRNA可通過調(diào)控 EMT過程對細胞間連接和黏附進行調(diào)節(jié),通過抑制EMT或促進間質(zhì)-上皮轉(zhuǎn)分化(MET)過程抑制或促進腫瘤發(fā)生[20~23]。

    本研究借助芯片技術(shù)篩選出了與腹膜間皮細胞轉(zhuǎn)分化相關(guān)的lncRNA及其下游靶基因mRNA的差異表達譜,并利用RT-PCR技術(shù),對表達差異最為顯著的4個lncRNA進行驗證,其結(jié)果與芯片技術(shù)結(jié)果相一致,證明芯片結(jié)果的可靠性。

    本研究首次在轉(zhuǎn)錄組學(xué)層面提出了lncRNA參與了腹膜透析相關(guān)性腹膜纖維化的病理生理過程。通過高通量微陣列芯片技術(shù)證實lncRNA參與了腹膜間皮細胞轉(zhuǎn)分化,從而導(dǎo)致腹膜纖維化的發(fā)生與發(fā)展。在后續(xù)的研究中,我們將進一步分析驗證差異表達lncRNA的分子生物功能及其靶基因,進一步闡明lncRNA在腹膜間皮細胞轉(zhuǎn)分化中的作用,從而為臨床防治腹膜透析相關(guān)性腹膜纖維化提供理論依據(jù)。

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