MUC1 基因沉默對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞增殖及侵襲能力的影響

王鳳麗，孫士明，李志

(1大連市中心醫(yī)院，遼寧大連116033；2齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院附屬第三醫(yī)院)

肝細(xì)胞癌的發(fā)生是多種因素協(xié)同作用的結(jié)果，與基因的異常表達(dá)直接或間接相關(guān)。黏蛋白1(MUC1)又名PEM，是黏蛋白家族成員之一。越來越多的研究提示，MUC1作為癌基因與細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化、遷移及侵襲相關(guān)[1]。有研究報(bào)道，在肝癌細(xì)胞及肝癌組織中也發(fā)現(xiàn)MUC1異常表達(dá)，但MUC1與肝癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系尚不明確[2～4]。2015年12月～2017年12月，我們觀察了MUC1基因沉默對(duì)細(xì)胞增殖及侵襲能力的影響，現(xiàn)分析結(jié)果并探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 肝癌HepG2細(xì)胞購(gòu)于上海細(xì)胞庫(kù)；pGCsilencerTMU6.Neo.GFP.NC質(zhì)粒購(gòu)于上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司；WST-1細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒購(gòu)于羅氏公司；細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)試劑購(gòu)于Hyclone公司；TRIzol及細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000購(gòu)于Invitrogen公司；Transwell小室購(gòu)于Corning 公司；小鼠抗人MUC1單克隆抗體購(gòu)于Neomarker公司；兔抗人β-actin/cyclin D1/c-myc/MMP-9單克隆抗體購(gòu)于Epitomics公司。

1.2 siRNA表達(dá)載體構(gòu)建 根據(jù)GenBank登陸的MUC1(J05582)保守序列，依據(jù)siRNA設(shè)計(jì)原則選擇GACTGATGCCAGTAGCACT及GCAGCCTCTCGATATAACC兩個(gè)靶點(diǎn)，設(shè)計(jì)合成了兩對(duì)siRNA的模板DNA序列，并將其連接到pGC silencer U6/Neo/GFP載體上獲得pGC-MUC1-siRNA1、pGC-MUC1-siRNA2質(zhì)粒。選取重組質(zhì)粒pGCsilencerTMU6.Neo.GFP.NC(pGC-NC)作為無關(guān)序列對(duì)照質(zhì)粒。

1.3 HepG2細(xì)胞MUC1基因沉默 采用含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，待細(xì)胞融合>90%時(shí)隨機(jī)分為四組，NC組轉(zhuǎn)染pGC-NC質(zhì)粒，HMR-1組、HMR-2組分別轉(zhuǎn)染pHMR-2pGC-MUC1-siRNA、pHMR-2pGC-MUC1-siRNA2質(zhì)粒，空白對(duì)照組常規(guī)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染方法：采用陽離子脂質(zhì)法，用含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，經(jīng)胰酶消化后接種于24孔板，置于37 ℃ 5% CO2孵箱中培養(yǎng)，次日待細(xì)胞融合>90%，吸棄上清，用無血清培養(yǎng)基洗細(xì)胞兩次；將pGC-NC和pGC-MUC1-siRNA1、pGC-MUC1-siRNA2質(zhì)粒與Lipofectamine2000按1∶3的比例混合，轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，具體操作方法按照說明書。轉(zhuǎn)染細(xì)胞于37 ℃ 5% CO2孵箱中孵育48 h。分別采用RT-PCR法、Western blotting法檢測(cè)各組MUC1 mRNA和蛋白的相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果顯示，HMR-1組及HMR-2組細(xì)胞MUC1 mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量均低于NC組及空白對(duì)照組(P均<0.05)，提示轉(zhuǎn)染質(zhì)粒沉默MUC1成功。見表1。

1.4 相關(guān)指標(biāo)觀察

1.4.1 細(xì)胞增殖活性 將HepG2細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，0.25%胰酶消化，臺(tái)盼藍(lán)計(jì)數(shù)，接種至96孔板，每孔接種5×103個(gè)細(xì)胞。次日，待細(xì)胞匯合大于70%時(shí)隨機(jī)分為四組，分組及處理同1.3。采用WST-1試劑盒分別于轉(zhuǎn)染后24、48 h檢測(cè)各組細(xì)胞450 nm波長(zhǎng)處吸光度(A)值。

表1 四組細(xì)胞MUC1 mRNA和MUC1蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

注：與NC組比較，*P<0.05；與空白對(duì)照組比較，△P<0.05。

1.4.2 細(xì)胞侵襲情況 采用Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)。用無血清培養(yǎng)液將Matrige膠進(jìn)行1∶10稀釋，取100 μL加入到Transwell小室包被小室底部上室面，置于37 ℃、5% CO2孵箱中濕化3 h，取轉(zhuǎn)染48 h的四組細(xì)胞(細(xì)胞分組及處理同1.3)，用含1%血清的IMDM調(diào)整細(xì)胞密度為5×105個(gè)/mL。Transwell小室上室加入200 μL單細(xì)胞懸液，下室加入600 μL含10% NCS的IMDM培養(yǎng)液，每組3個(gè)復(fù)孔，將培養(yǎng)板置于37 ℃、5% CO2孵箱中培養(yǎng)48 h，用棉簽輕輕擦掉上室中膜上的細(xì)胞。于倒置顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)不同視野計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)，并計(jì)算各組細(xì)胞相對(duì)侵襲率(與NC組比較)，每組重復(fù)3次取平均值。

1.4.3 細(xì)胞cyclinD1、c-myc、MMP-9 mRNA表達(dá) 采用RT-PCR法檢測(cè)。收集轉(zhuǎn)染48 h的四組細(xì)胞(細(xì)胞分組及處理同1.3)。采用TRIzol試劑裂解細(xì)胞，提取細(xì)胞總RNA；采用半定量RT-PCR法檢測(cè)各組細(xì)胞cyclinD1、c-myc、MMP-9 mRNA表達(dá)，以β-actin為內(nèi)參照。引物由上海生物工程科技有限公司合成，引物信息及反應(yīng)條件見表2。PCR產(chǎn)物采用1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離，于凝膠成像儀中采集圖像，并通過ImageJ軟件分析電泳條帶灰度值。

1.4.4 細(xì)胞cyclinD1、c-myc、MMP-9蛋白表達(dá) 采用Western blotting法。收集轉(zhuǎn)染48 h的四組細(xì)胞(細(xì)胞分組及處理同1.3)，采用RIPA蛋白裂解液(1%Triton X-100、1% deoxycholate、0.1% SDS)裂解細(xì)胞，收集細(xì)胞裂解上清，采用BCA試劑盒檢測(cè)細(xì)胞裂解液蛋白濃度，取等量的蛋白于100 ℃沸水中變性5 min，在10% SDS-PAGE中電泳分離，并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，加入一抗(兔抗人β-actin、cyclin D1、c-myc、MMP-9單克隆抗體)雜交4 ℃孵育過夜；次日HRP標(biāo)記的二抗(山羊抗小鼠/兔IgG)雜交，室溫孵育1 h；ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒顯色，利用化學(xué)發(fā)光儀采集圖像，計(jì)算各組細(xì)胞中各蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

表2 各基因的引物序列及反應(yīng)條件

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞增殖能力比較 見表3。

表3 四組細(xì)胞增殖能力比較

注：與NC組比較，*P<0.05；與空白對(duì)照組比較，△P<0.05。

2.2 各組細(xì)胞侵襲能力比較 空白對(duì)照組、NC組、HMR-1組、HMR-2組細(xì)胞相對(duì)侵襲率分別為1.09±0.13、1.00±0.15、0.26±0.07、0.36±0.09，HMR-1組、HMR-2組均低于NC組、空白對(duì)照組(P均<0.05)。

2.3 各組細(xì)胞cyclinD1、c-myc、MMP-9 mRNA及蛋白表達(dá)比較 見表4。

表4 四組細(xì)胞cyclinD1、c-myc、MMP-9 mRNA及蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

注：與NC組比較，*P<0.05；與空白對(duì)照組比較，△P<0.05。

3 討論

MUC1蛋白是一個(gè)高分子量的跨膜糖蛋白，由胞外區(qū)域(MUC1-N)、跨膜區(qū)域(MUC1-TM)及胞漿尾段(MUC1-CT)三部分組成，最先由Shimizu等[5]于1982年從人的乳汁中分離得到，編碼基因位于lq21。MUC1蛋白正常表達(dá)于腺上皮細(xì)胞近管腔面，呈極性分布。在部分腫瘤細(xì)胞及腫瘤組織中MUC1高表達(dá)，異常糖基化，失去極性，分布于整個(gè)細(xì)胞表面。MUC1蛋白胞外段可作為受體與其配體結(jié)合，或作為配體與其受體結(jié)合發(fā)揮生物學(xué)作用，其胞內(nèi)段與細(xì)胞內(nèi)多條信號(hào)傳導(dǎo)通路相關(guān)聯(lián)，在細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化、遷移及侵襲中起重要作用。Tsutsumida等[6]將攜帶人全長(zhǎng)MUC1基因的重組載體轉(zhuǎn)染人胰腺癌S2-013細(xì)胞，使之過表達(dá)MUC1蛋白，該細(xì)胞增殖能力明顯增強(qiáng)。反之，利用RNAi技術(shù)沉默S2-013 細(xì)胞株MUC1 mRNA 及蛋白表達(dá)，則可抑制胰腺癌細(xì)胞體外增殖及體內(nèi)成瘤能力。Xu等[7]采用MUC1 siRNA 轉(zhuǎn)染人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株NCI-H1650 下調(diào)MUC1基因表達(dá)，也得到了類似的結(jié)果。本研究采用RNAi技術(shù)，通過干擾沉默MUC1基因表達(dá)，結(jié)果顯示，HMR-1、HMR-2組較NC組、空白對(duì)照組細(xì)胞增殖活性明顯減低，證實(shí)MUC1可抑制肝癌細(xì)胞的增殖。

有研究報(bào)道，MUC1-CT與細(xì)胞內(nèi)多條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[8～10]。作為Wnt/β-catenin信號(hào)通路的靶基因，細(xì)胞周期蛋白cyclinD1及癌基因c-myc上調(diào)能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖及惡性轉(zhuǎn)化。Li等[10]研究發(fā)現(xiàn)，MUC1過表達(dá)參與Wnt/β-catenin信號(hào)通路的活化，MUC1-CT通過與β-catenin相互作用形成復(fù)合物，調(diào)節(jié)β-catenin的定位，活化轉(zhuǎn)錄因子LEF/TCF，上調(diào)cyclinD1及c-myc基因表達(dá)，促進(jìn)乳腺腫瘤的發(fā)生與進(jìn)展。本研究結(jié)果顯示，HMR-1組及HMR-2組細(xì)胞cyclinD1和c-myc表達(dá)水平顯著降低，可能為MUC1基因沉默抑制肝癌細(xì)胞增殖的可能機(jī)制。

研究證實(shí)，MUC1與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān)，在乳腺癌患者的轉(zhuǎn)移灶及循環(huán)系統(tǒng)腫瘤細(xì)胞中均發(fā)現(xiàn)MUC1蛋白高表達(dá)[11]。Horm等[11]發(fā)現(xiàn)，小鼠乳腺腫瘤DA3細(xì)胞過表達(dá)MUC1后，細(xì)胞通過基質(zhì)膠的能力明顯增強(qiáng)。本研究結(jié)果顯示，HMR-1組、HMR-2組細(xì)胞侵襲能力顯著減低，表明MUC1在調(diào)節(jié)肝癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。MMPs是一組含鋅離子的肽鏈內(nèi)切酶家族，在腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移中扮演重要角色[12]。研究發(fā)現(xiàn)，活化JNK/Smad2L/Smad2L/C信號(hào)通路能夠上調(diào)MMP-1、MMP-2 及 MMP-9表達(dá)，從而促進(jìn)肝癌細(xì)胞的侵襲及轉(zhuǎn)移能力[13,14]。Nart等[15]報(bào)道，MMP-9表達(dá)上調(diào)與肝癌進(jìn)展及侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)。本研究HMR-1組及HMR-2組細(xì)胞MMP-9表達(dá)顯著下調(diào)，提示MUC1能夠調(diào)節(jié)MMP表達(dá)，在肝癌的侵襲及轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。

綜上所述，沉默HepG2細(xì)胞MUC1基因表達(dá)能夠抑制肝癌HepG2細(xì)胞增殖及侵襲，其機(jī)制可能與下調(diào)cyclinD1、c-myc及MMP-9表達(dá)有關(guān)。