H3K27三甲基化蛋白可作為MPNST的重要診斷標(biāo)記物

宋紫暄，李光明，張 靜，張衛(wèi)民，楊吉龍，朱 澤

（1.天津醫(yī)科大學(xué)病原生物學(xué)系,天津300070；2.天津市第三中心醫(yī)院輸血科，天津300170；3.天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院骨與軟組織腫瘤科，國家腫瘤臨床醫(yī)學(xué)研究中心，天津市“腫瘤防治”重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津市惡性腫瘤臨床醫(yī)學(xué)研究中心，天津300060）

惡性周圍神經(jīng)鞘瘤（malignant peripheral nerve sheath tumor，MPNST）是一種罕見的高度惡性神經(jīng)源性軟組織肉瘤，約占所有肉瘤的4%[1]；50%的MPNST繼發(fā)于1型神經(jīng)纖維瘤（NF1），約10%與患者先前的放射治療相關(guān)[2-3]；截止到目前為止，其余的40%尚沒有明確的易感因素。MPNST具有高度惡性，復(fù)發(fā)率高，轉(zhuǎn)移能力強(qiáng)的特點(diǎn)，5年生存率為50%左右，而5年無病生存率僅為27%[4-6]。MPNST的診斷仍然是一項(xiàng)具有挑戰(zhàn)性的工作，并且由于其非特異性的形態(tài)學(xué)特征并缺乏特異性的IHC分子診斷標(biāo)記，使得其診斷標(biāo)記并不成系統(tǒng)。在臨床上，當(dāng)遇到已知易感因素（NF1，RT）以外的MPNST時(shí)，其診斷結(jié)果則與臨床醫(yī)生個(gè)體觀察差異密切相關(guān)[7]，據(jù)以往復(fù)雜核型的研究報(bào)道，NF1相關(guān)的MPNST中S100在50%～90%的病例中表達(dá)陽性，或者存在頻發(fā)的等位基因缺失，但這并不是這些腫瘤的特異性標(biāo)記[8-9]。MPNST的確切診斷是需要在特定的臨床背景下進(jìn)行的，比如受NF1影響的個(gè)體或者之前接受過放射治療而發(fā)生的腫瘤，但當(dāng)遇到臨床背景并不能輔助判斷（即散發(fā)病例）的情況下，MPNST的診斷則需要依賴其形態(tài)學(xué)特征進(jìn)行判斷。因此，MPNST特異性標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)對(duì)早期診斷以及預(yù)后關(guān)系重大?，F(xiàn)如今，表觀遺傳調(diào)控神經(jīng)纖維瘤中組蛋白甲基化修飾的研究日益受到重視[10]。組蛋白H3在體內(nèi)存在單甲基化（me1）、二甲基化（me2）及三甲基化（me3）3種形式，其N-末端賴氨酸殘基K27是主要的甲基化修飾位點(diǎn)之一，其甲基化的程度可影響相應(yīng)區(qū)域DNA的轉(zhuǎn)錄活性，從而發(fā)揮抑制轉(zhuǎn)錄的作用[11]。在美國人群[12]與日本人群[13]中的研究發(fā)現(xiàn)，H3K27me3在非NF1相關(guān)的MPNST中頻繁發(fā)生表達(dá)缺失，很有希望作為診斷MPNST的重要生物標(biāo)志物。本研究通過應(yīng)用組織芯片技術(shù)制備中國人群MPNST組織芯片，通過免疫組化的方法來研究H3K27me3在MPNST中的表達(dá)情況與疾病病理特征之間的關(guān)系，并驗(yàn)證H3K27me3的表達(dá)缺失在中國人群中是否具有輔助診斷MPNST的價(jià)值。

1 材料和方法

1.1 臨床資料 收集天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院病理科自1991年1月-2011年11月惡性周圍神經(jīng)鞘瘤住院病理組織標(biāo)本43例，經(jīng)福爾馬林固定，石蠟包埋后，利用TMA技術(shù)制成組織芯片，其中NF1型的惡性周圍神經(jīng)鞘瘤，是根據(jù)美國國立衛(wèi)生研究院標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行確診的，臨床資料的收集包括性別、年齡、MPNST的亞型、腫瘤的部位、大小、AJCC分期、放療、化療、復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移等。其中男性23例，女性20例，最大年齡86歲，最小年齡15歲，平均年齡45.86歲。組織學(xué)分型：39例為散發(fā)型惡性周圍神經(jīng)鞘瘤，4例為NF1型的惡性周圍神經(jīng)鞘瘤。患者無病生存率和總生存率的時(shí)間分布為0～176個(gè)月和0～182個(gè)月，中位生存時(shí)間分別為16個(gè)月和64個(gè)月。

1.2 主要試劑和儀器 鼠抗人單克隆抗體H3K27me3（ab6002）購自美國abcam公司，工作濃度為1∶100。二抗試劑盒及DAB顯色劑均購自北京中杉金橋公司。

1.3 構(gòu)建MPNST組織芯片 光學(xué)顯微鏡下標(biāo)記原始病理標(biāo)本無壞死退變、具代表性的腫瘤區(qū)域，每例標(biāo)本標(biāo)記2點(diǎn)。用直徑1.5mm的打孔針在Quick-Ray預(yù)鑄受體蠟塊上打孔，并在每個(gè)供體蠟塊標(biāo)本上按標(biāo)記取出2份直徑為1.5 mm的圓柱體組織塊，分別將上述腫瘤組織塊移入受體蠟塊，構(gòu)建TMA模塊。52℃恒溫烤箱中加熱組織陣列塊1 h，室溫條件下冷卻30 min后放入-20℃冰箱冷卻6 min。切片輔助系統(tǒng)連續(xù)切片，每張切片厚4 μm。組織切片移入45℃溫水中，待舒展充分后用組織芯片專用載玻片撈片，室溫晾干，95℃病理組織漂烘儀烤干，60℃烤片16 h，取出冷卻后置于-20℃冰箱貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 免疫組化染色 60℃溫箱孵育組織切片30min，二甲苯脫蠟，各級(jí)濃度乙醇水化，高壓蒸汽加熱抗原修復(fù)，0.3%甲醛/雙氧水封閉內(nèi)源性過氧化物酶。常溫下與胎牛血清孵育1 h，滴加抗體H3K27me3（1：100），4℃冰箱過夜。將切片與HRP標(biāo)記的山羊抗鼠IgG抗體孵育1 h，4℃冰箱30～40 min。將切片浸入DAB溶液10min，各級(jí)濃度乙醇快速脫水，二甲苯透明，加蓋蓋玻片，中性樹脂封片。待晾干后觀察。

1.5 結(jié)果判讀 在無背景染色情況下，以細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核染成黃色至棕褐色細(xì)顆粒狀為陽性反應(yīng)。在高倍鏡下（×400）對(duì)陽性細(xì)胞進(jìn)行評(píng)分，隨機(jī)選擇5個(gè)視野，總共計(jì)數(shù)500個(gè)細(xì)胞。將陽性細(xì)胞按所占百分比分為5級(jí)：＜5%為0分，5%～25%為1分，25%～50%為2分，50%～75%為3分，＞75%為4分。同時(shí)對(duì)細(xì)胞著色強(qiáng)度進(jìn)行分級(jí)：0分為無色，1分為淡黃色，2分為棕黃色，3分為棕黑色。以兩者相加為所得分?jǐn)?shù)：≤1分為陰性（-），2～3分為弱陽性（+），4～5分為中等陽性（++），6～7分為強(qiáng)陽性（+++）。陰性（-）和弱陽性（+）為低表達(dá)組，而中等陽性（++）和強(qiáng)陽性（+++）為高表達(dá)組。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。H3K27me3的表達(dá)與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系用χ2檢驗(yàn)或Fisher精確概率法檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 非NF1相關(guān)性MPNST表現(xiàn)出H3K27me3的表達(dá)缺失 運(yùn)用H3K27me3單克隆抗體進(jìn)行IHC研究評(píng)估，結(jié)果顯示65.11%（n=28）的MPNST病例顯示完全（n=17，39.53%，圖1A）或部分（n=11，25.58%，圖 1B）染色缺失，而 35%（n=15，圖 1C）的病例保留染色，即以H3K27me3表達(dá)缺失為診斷依據(jù)則MPNST的檢出率可達(dá)65.11%，且與原診斷一致。然而，在不同的MPNST組中，免疫染色狀態(tài)有很大差異。當(dāng)僅考慮與NF1相關(guān)的MPNST（n=4）時(shí)，4例（100%）顯示H3K27me3染色正常，而非NF1相關(guān)的MPNST（n=39）中，H3K27me3表達(dá)缺失達(dá)71.78%（n=28），其中完全缺失病例 43.58%（n=17），部分缺失病例28.20%（n=11），保留表達(dá)組病例占28%（n=11），即在非NF1相關(guān)的MPNST中檢出率可達(dá)71.78%。H3K27me3的表達(dá)缺失不僅可以診斷MPNST，特別是對(duì)于非NF1相關(guān)的MPNST可顯現(xiàn)出更好的敏感性和特異性。

圖1 IHC顯示H3K27me3在臨床組織樣本中的表達(dá)情況Fig 1 IHCshowstheexpressionofH3K27me3inclinicaltissuesamples

2.2 MPNST中H3K27me3的表達(dá)情況與臨床病理參數(shù)的關(guān)系 本研究共納入43例MPNST樣本。大多數(shù)樣本（84%）起源于原發(fā)性或復(fù)發(fā)性病變，而16%的樣本來自轉(zhuǎn)移性病變。原發(fā)腫瘤位于雙側(cè)肢體 16例（37%），軀干 20例（47%），頭頸部 7例（16%）。6個(gè)樣本（14%）是放化療前的狀態(tài)。此外，包括4個(gè)NF1相關(guān)樣本。按照臨床病例數(shù)據(jù)的不同組別，我們進(jìn)行了H3K27me3 IHC的統(tǒng)計(jì)分析（表1）。研究結(jié)果表明，H3K27me3的表達(dá)水平與性別、年齡、腫瘤大小、AJCC分級(jí)、放化療及復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移并無關(guān)聯(lián)，而與MPNST是否為NF1型密切相關(guān)（P=0.014）。

表1 不同臨床病例數(shù)據(jù)組別的H3K27me3 IHC統(tǒng)計(jì)情況（n）Tab 1 H3K27me3IHCstatisticsfordifferentclinicalcasedatasets（n）

3 討論

最近有研究表明，在MPNST中EED和SUZ12的基因表達(dá)異常，均可編碼PRC2重要組成部分，這種基因表達(dá)異常在諸多臨床情況下均有發(fā)生[14]。EED和SUZ12的基因表達(dá)產(chǎn)物與EZH1/EZH2可構(gòu)成PRC2復(fù)合物的核心，其主要負(fù)責(zé)組蛋白3的賴氨酸27位點(diǎn)的二甲基化（H3K27me2）和三甲基化（H3K27me3），PRC2參與染色質(zhì)的壓縮，異染色質(zhì)的形成，X染色體的失活以及多梳介導(dǎo)的基因沉默[15-17]。有研究表明[14]，EED和SUZ12的突變可以使得PRC2失活，從而促使H3K27me3 IHC表達(dá)的缺失。我們的結(jié)果顯示，在所有的MPNST中，65%的病例中H3K27me3表達(dá)缺失。此結(jié)果相對(duì)于前人報(bào)道的S100蛋白染色具有相同的價(jià)值[8-9]。但是，當(dāng)考慮到MPNST的各類臨床亞型時(shí)，在大多數(shù)散發(fā)的病例中，H3K27me3表達(dá)的喪失則具有更高的敏感度，更有趣的是在我們的研究發(fā)現(xiàn)4例NF1相關(guān)的MPNST樣本，IHC染色顯示H3K27me3陽性，曾有文獻(xiàn)報(bào)道稱PRC2表達(dá)異常在NF1相關(guān)的MPNST中發(fā)生率較低，僅有60%的病例表現(xiàn)出H3K27me3的表達(dá)缺失，40%的病例仍保留了H3K27me3的表達(dá)[12]。但是無論NF1相關(guān)的MPNST中H3K27me3的表達(dá)水平如何，只要我們從實(shí)際診斷的角度出發(fā)，大多數(shù)NF1相關(guān)的患者檢測為梭形細(xì)胞肉瘤基本都可認(rèn)定為MPNST，而很少再需要其他的輔助因子來進(jìn)行診斷。

通過研究中國人MPNST組織樣本證實(shí)了H3K27me3的IHC分析對(duì)于MPNST的診斷具有很強(qiáng)的實(shí)用性。在某些特定臨床情況下，如RT相關(guān)性或散發(fā)性MPNST，H3K27me3表達(dá)的缺失可作為一種十分有意義的輔助標(biāo)記物，具有很好的敏感性與特異性。該標(biāo)記對(duì)于NF1相關(guān)的MPNST敏感性較低，這與NF1相關(guān)的MPNST中較低的PRC2失活發(fā)生率相關(guān)。在我們的H3K27me3的IHC分析結(jié)果中，發(fā)現(xiàn)在NF1相關(guān)的MPNST中H3K27me3的水平明顯高于散發(fā)MPNST，我們?cè)谥袊巳褐械难芯拷Y(jié)果與美國Prieto-Granada等[12]和日本Asano等[13]學(xué)者的研究結(jié)果基本一致，并且若以H3K27me3的表達(dá)缺失為診斷MPNST的標(biāo)準(zhǔn)，則其MPNST的整體檢出率可達(dá)65.11%，在除外NF1相關(guān)的MPNST的檢測中的其檢出率可高達(dá)71.78%，顯現(xiàn)出十分優(yōu)異的敏感性和特異性。目前在診斷MPNST的過程中由于非特異性的形態(tài)學(xué)特征并缺乏特異性的IHC分子標(biāo)記物，使得診斷工作仍然困難重重，而H3K27me3在MPNST早期診斷中具有靈敏、高效等優(yōu)勢(shì)。綜上所述，我們認(rèn)為在中國MPNST發(fā)病人群中，H3K27me3亦可作為該疾病早期診斷的輔助工具。