茶酒穩(wěn)定性及抗氧化特性分析

王杰，楊海濱，張瑩，鄔秀宏，李中林，徐澤

(重慶市農(nóng)業(yè)科學(xué)院 茶葉研究所，重慶，402160)

茶酒是以茶葉為主要原料，經(jīng)直接浸提或生物發(fā)酵、過濾、陳釀、勾兌而成的飲料酒，既保留了傳統(tǒng)白酒的風(fēng)格，又皆具茶香[1-2]。茶酒中富含茶多酚、茶多糖、咖啡堿、游離氨基酸、維生素及礦物質(zhì)元素等多種營(yíng)養(yǎng)功能成分，具有良好的營(yíng)養(yǎng)保健效果[1-9]。

我國(guó)茶酒產(chǎn)品包括配制型、發(fā)酵型、汽酒型等，但由于缺乏相關(guān)生產(chǎn)技術(shù)規(guī)范、產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)以及生產(chǎn)技術(shù)設(shè)備，存在市場(chǎng)容量小、品種花色少、品質(zhì)不穩(wěn)定等問題。當(dāng)前對(duì)于茶酒的研究主要集中在工藝優(yōu)化、香氣分析和品類開發(fā)等方面[10-15]。

本研究以自制的烘青綠茶、工夫紅茶為原料分別加工配制成綠茶酒和紅茶酒，分析其貯藏過程中茶多酚、色澤、沉淀量以及抗氧化特性的變化，以期為茶酒的生產(chǎn)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

2016年7月在重慶市農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所科技示范園采摘福鼎大白茶鮮葉，并以此為原料制作烘青綠茶和工夫紅茶；42%、52%、62%(vol)高粱酒均由重慶永松白酒制造有限公司提供。

1.1.2 主要試劑

Na2CO3、沒食子酸、KH2PO4、K2HPO4、甲醇(色譜純)，重慶永捷實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；福林酚試劑，北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；1,1-二苯-2-苦基肼(2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl，DPPH)、偶氮二異丁基脒鹽酸鹽(2,2′-azobis(2-methylpropionamidine)dihydrochloride，AAPH)、水溶性維生素E(6-hydroxy-2,5,7,8-teramethylchroman-2-carboxylic acid，Trolox)、熒光素二鈉，上海泰坦科技股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-2450紫外-可見分光光度計(jì)，日本島津公司；722可見分光光度計(jì)，上海菁華科技儀器有限公司；FA1004 電子天平，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；HWS-26電熱恒溫水浴鍋，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；5810臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf公司；ALPHA1-4LSC真空冷凍干燥機(jī)，德國(guó)Christ公司；酶標(biāo)儀，美國(guó)BIO-RAD公司；UltraScan PRO測(cè)色儀，美國(guó)HunterLab公司。

1.3 方法

1.3.1 茶酒制備

(1)粉碎茶樣：浸提前，先將茶葉粉碎，以提高浸提率，粉碎方法參照GB/T 8303—2013。

(2)浸提：將粉碎茶樣分別用62%(vol)的高粱酒浸提，得到質(zhì)量濃度分別為5、10、15 g/L的母液，并置于4 ℃冰柜保存?zhèn)溆谩?/p>

(3)降度調(diào)配：將母液分別用42%、52%(vol)的高粱酒混合，并添加一定量的調(diào)味劑，混勻后于室溫放置，得到質(zhì)量濃度分別為0.5、1.0、1.5 g/L的茶酒產(chǎn)品。樣品編號(hào)見表1。

表1 茶酒樣品編號(hào)Table 1 Sample number of tea wine

1.3.2 感官審評(píng)

參考并修改邱新平等人的方法[16]，從外觀、香氣、口感和風(fēng)格4個(gè)方面進(jìn)行感官審評(píng)，評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)見表2，由此確定適合生產(chǎn)配制型茶酒的茶酒質(zhì)量濃度及高粱酒酒精度，并開展穩(wěn)定性和抗氧化特性評(píng)價(jià)。

表2 茶酒感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Sensory evaluation standards of tea wine

1.3.3 穩(wěn)定性評(píng)價(jià)

將1.3.2中感官評(píng)價(jià)得分最高的茶酒于室溫下放置0、2、4、6、8、10、12、15、30 d，通過測(cè)定茶多酚含量、色澤和沉淀量的變化來評(píng)價(jià)茶酒的穩(wěn)定性。

1.3.3.1 茶多酚

采用福林酚法，參照GB/T 8313—2008。

1.3.3.2 色澤

室溫條件下，用UltraScan PRO測(cè)色儀測(cè)定每個(gè)樣品的色差L*、a*、b*值。其中L*值代表亮度；a*值代表紅綠色度(正值表示紅色程度，負(fù)值表示綠色程度)；b*值代表黃藍(lán)色度(正值表示黃色程度，負(fù)值表示藍(lán)色程度)。

1.3.3.3 沉淀量[17]

取已搖勻的一定質(zhì)量的茶酒，加入到已稱重的50 mL離心管中。4 ℃下，10 000 r/min離心20 min，棄掉上清液，將沉淀真空冷凍干燥至恒重，稱量離心管和凍干沉淀的總質(zhì)量。沉淀量(mg/kg)按式(1)計(jì)算：

(1)

式中：m1,離心管和凍干沉淀的總質(zhì)量，g；m0，離心管的質(zhì)量，g；M，茶酒質(zhì)量，g。

1.3.4 抗氧化能力評(píng)價(jià)

選取1.3.2中感官評(píng)價(jià)得分最高的茶酒，通過ORAC法和DPPH法來評(píng)價(jià)茶酒成品酒的抗氧化能力，以高粱酒作對(duì)照。

1.3.4.1 ORAC法

參考并改進(jìn)GRAJEDA-IGLESIAS等[18]人的方法。該反應(yīng)在pH 7.2的磷酸鹽緩沖液體系中(75 mmol/L)進(jìn)行。在96孔黑色熒光酶標(biāo)板各微孔中加入空白液、Trolox標(biāo)準(zhǔn)液及待測(cè)樣品溶液50 μL，37 ℃黑暗孵育10 min，然后向各微孔中添加熒光素二鈉溶液(0.126 μmol/L)150 μL，中速振搖2 min，37 ℃黑暗孵育10 min，然后加入AAPH溶液(153 mmol/L)25 μL，迅速啟動(dòng)反應(yīng)，以激發(fā)波長(zhǎng)490 nm，發(fā)射波長(zhǎng)530 nm連續(xù)測(cè)定熒光強(qiáng)度。每次測(cè)定前振蕩5 s，連續(xù)測(cè)定40次，時(shí)間間隔為4 min，直至熒光衰減至基線。ORAC值用式(2)、(3)計(jì)算，以μmol Trolox/g茶酒樣品表示。

AUC=(0.5×f1/f1+f2/f1+f3/f1…+fn/f1+…+f39/f1+0.5×f40/f1)×ΔT

(2)

ORAC值/〔(μmol Trolox)·g-1〕=〔(AUCs-AUCb)/(AUCt-AUCb)〕/(Ct/Cs)

(3)

式(2)、(3)中：AUC表示熒光熄滅曲線下面積；f1為第1次熒光讀數(shù)；fn為第n次熒光讀數(shù)；ΔT為間隔測(cè)定時(shí)間4 min；AUCs為樣品液熒光衰減曲線下面積；AUCt為Trolox標(biāo)準(zhǔn)液熒光衰減曲線下面積；AUCb為空白試劑熒光衰減曲線下面積；Ct為Trolox標(biāo)準(zhǔn)液的摩爾濃度；Cs為樣品液的摩爾濃度。

1.3.4.2 DPPH法

參考并適當(dāng)修改CARMONAJIMéNEZ等[19]人的方法。將茶酒稀釋成40 mg/mL的樣品液，在12 000 r/min、4 ℃離心5 min，取上清液待測(cè)。稱取0.1 g DPPH溶于200 mL無水乙醇中，取10 mL稀釋至100 mL，得到0.05 mg/mL的DPPH自由基溶液。

樣品準(zhǔn)備：Ⅰ：2 mL待測(cè)液+2 mL DPPH自由基溶液；Ⅱ：2 mL待測(cè)液+2 mL無水乙醇；Ⅲ：2 mL無水乙醇+2 mL DPPH自由基溶液，搖勻后避光反應(yīng)40 min，在517 nm條件下測(cè)定吸光度。按照式(4)計(jì)算DPPH自由基清除率。

DPPH自由基清除率/%=(1-(AⅠ-AⅡ)/AⅢ)×100

(4)

式中：AⅠ,樣品液加入DPPH后的吸光度;AⅡ,樣品液自身的吸光度;AⅢ,空白加入DPPH后的吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用SPSS 22.0進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)和Origin 9.0作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 茶酒的感官評(píng)價(jià)

不同茶湯濃度及高粱酒酒精度對(duì)茶酒品質(zhì)影響的結(jié)果見表3。

表3 茶酒感官評(píng)價(jià)得分Table 3 Scores of sensory evaluation for tea wine

2.2 茶酒的穩(wěn)定性評(píng)價(jià)

以42%(vol)、52%(vol)酒精度的高粱酒調(diào)配的綠茶酒中，質(zhì)量濃度為1.0 g/L時(shí)的感官審評(píng)得分最高，且G52的總分高于G42?？梢园l(fā)現(xiàn)，隨著茶湯質(zhì)量濃度的增加，茶酒的綠色程度也隨之加深，當(dāng)高粱酒的酒精度為42%(vol)時(shí)，出現(xiàn)了少量絮狀物沉淀。研究表明[20]，當(dāng)白酒酒精度超過50%(vol)時(shí)具有較好的溶解性，但降度后，棕櫚酸、油酸、亞油酸及其乙酯類會(huì)由于溶解性降低而析出白色沉淀，并且茶多酚等易溶于乙醇的化合物也會(huì)因溶解性降低而導(dǎo)致茶酒出現(xiàn)渾濁沉淀。此外，隨著茶湯質(zhì)量濃度的增加，茶酒的香氣評(píng)分逐漸增高，但口感評(píng)分則先增加后降低，這可能與茶酒中的茶多酚、咖啡堿等一類具有苦澀味物質(zhì)的含量及其相互作用有關(guān)。

以42%(vol)高粱酒配制的紅茶酒中，質(zhì)量濃度為1.0 g/L時(shí)的感官審評(píng)得分最高；52%(vol)高粱酒配制的紅茶酒中，質(zhì)量濃度為1.5 g/L時(shí)的感官審評(píng)得分最高，且B53的總分高于B42。同樣地，隨著茶湯濃度的增加，茶酒的紅色程度逐漸加深，尤以B53最為紅艷，這可能也與酒精度的高低和茶紅素等色素類物質(zhì)在酒中的溶解性有關(guān)。此外，當(dāng)茶湯質(zhì)量濃度較高時(shí)，紅茶酒的香氣、口感評(píng)分也都較高，但茶湯濃度較低時(shí)，茶酒的茶味相對(duì)淡，典型性不夠。因此，選定G52和B53開展茶酒的穩(wěn)定性和抗氧化特性評(píng)價(jià)。

2.2.1 茶多酚含量的變化

綠茶酒和紅茶酒中的茶多酚含量及其在茶酒貯藏過程中的變化趨勢(shì)，見圖1。

圖1 茶多酚含量在茶酒貯藏過程中的變化Fig.1 Change in tea polyphenols contents of tea wine during storage注：同一樣品中不同字母表示差異顯著(p<0.05)，相同字母表示差異不顯著，圖2、圖3同

由圖1可知，G52的茶多酚含量高于B53，由于紅茶屬于全發(fā)酵茶，加工過程中茶多酚在多種氧化酶的作用下生成茶黃素、茶紅素等物質(zhì)，因而茶多酚的含量低于綠茶[21]。此外，G52和B53的茶多酚含量在貯藏過程中均呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢(shì)，且G52的降低幅度高于B53，0～15 d的降低幅度高于15～30 d。由于茶酒中富含茶多酚、咖啡堿、蛋白質(zhì)等多種生化成分，在一定條件下，這些生化成分在貯藏過程中會(huì)發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)形成團(tuán)聚物，導(dǎo)致茶酒中的茶多酚含量逐漸降低；綠茶酒中的茶多酚在光照、有氧的條件下會(huì)發(fā)生氧化聚合反應(yīng)，形成茶色素類物質(zhì)，因而綠茶酒中茶多酚含量的降低幅度高于紅茶酒[22]；此外，貯藏0～15 d時(shí)，茶酒體系中的氧氣相對(duì)充足，發(fā)生各種氧化聚合反應(yīng)的速率相對(duì)較快，當(dāng)超過15 d后，氧氣較為缺乏，各種生化反應(yīng)的速率相對(duì)較慢，整個(gè)茶酒體系處于相對(duì)平衡穩(wěn)定的狀態(tài)，因而茶多酚含量在貯藏0～15 d時(shí)的降低幅度高于15～30 d。

2.2.2 茶酒色澤的變化

茶酒的色澤可通過L*、a*、b*值的大小來表征，G52和B53的色差L*、a*、b*值大小及其在貯藏過程中的變化趨勢(shì)，見圖2。

圖2 色差L*、a*、b*值在茶酒貯藏過程中的變化Fig.2 Change in color parameters L*, a* and b* values of tea wine during storage

由圖2可知，L*值在貯藏過程中逐漸降低，且G52的L*值高于B53，即茶酒的亮度隨貯藏時(shí)間的增加而逐漸降低，且綠茶酒的亮度高于紅茶酒；a*值在貯藏過程中逐漸增加，即綠茶酒的綠色程度逐漸降低、紅茶酒的紅色程度逐漸增高；G52的b*值在貯藏過程中逐漸增加，B53的b*值基本無變化，且B53的b*值始終高于G53，即綠茶酒的黃色程度隨貯藏時(shí)間的增加而逐漸增高，紅茶酒的黃色程度較為穩(wěn)定，且紅茶酒的黃色程度始終高于綠茶酒。可以發(fā)現(xiàn)，茶酒在貯藏過程中會(huì)發(fā)生褐變現(xiàn)象，而茶酒褐變的原因主要是酶促褐變，即茶多酚在多酚氧化酶等多種酶的作用下被氧化成茶黃素、茶紅素和茶褐素等物質(zhì)，導(dǎo)致茶酒色澤褐變；其次，美拉德反應(yīng)、焦糖化反應(yīng)、抗壞血酸的氧化分解等一系列非酶促褐變反應(yīng)也會(huì)使茶酒色澤加深、變暗；此外，對(duì)綠茶酒而言，在酸性條件下，葉綠素中的Mg2+會(huì)被H+取代而形成褐色的脫鎂葉綠素，從而加深綠茶酒的褐變程度[23]。

2.2.3 茶酒沉淀量的變化

綠茶酒和紅茶酒中的沉淀量及其在茶酒貯藏過程中的變化趨勢(shì)，見表4。

表4 沉淀量在茶酒貯藏過程中的變化Table 4 Change in precipitation capacity of tea wine during storage

注：同一列不同字母表示差異顯著(p<0.05)，相同字母表示差異不顯著。

由表4可知，隨著貯藏時(shí)間增加，G52和B53的沉淀量也呈現(xiàn)逐漸增加的變化趨勢(shì)。貯藏30 d后，G52和B53的沉淀量分別由(0.377±0.056)、(0.368±0.066) mg/kg增加至(0.512±0.052)、(0.507±0.039) mg/kg，增加幅度分別為35.81%、37.78%，可以發(fā)現(xiàn)，綠茶酒和紅茶酒的沉淀量大小及其在貯藏過程中的變化趨勢(shì)較為接近。由于茶酒中含有茶多酚、茶黃素、咖啡堿、蛋白質(zhì)、金屬離子等生化成分，當(dāng)溫度較低時(shí)，這些化合物通過氫鍵、疏水作用、離子鍵等作用力結(jié)合成團(tuán)聚物[17,22]，進(jìn)而導(dǎo)致茶酒的沉淀量增加。茶酒中沉淀的產(chǎn)生容易使茶酒品質(zhì)下降，為解決該問題，可采取向茶酒中添加包埋劑(β-環(huán)糊精等)、抗氧化劑(抗壞血酸等)、澄清劑(殼聚糖、硅藻土、明膠等)、酶(單寧酶、果膠酶、纖維素酶等)等多種方式來澄清茶酒，進(jìn)而提升茶酒品質(zhì)。

2.3 茶酒的抗氧化特性評(píng)價(jià)

茶酒的ORAC值和DPPH自由基清除率大小及其在貯藏過程中的變化趨勢(shì)，見圖3。

一般來說，茶酒的ORAC值和DPPH自由基清除率越高，表示其抗氧化特性越好。由圖3可知，隨著貯藏時(shí)間的增加，G52、B53的ORAC值及DPPH自由基清除率逐漸減小，貯藏30 d后，G52的ORAC值及DPPH自由基清除率分別由(859.63±65.71) μmol Trolox/g和(84.26±1.94)%降低至(684.21±39.54) μmol Trolox/g和(75.19±0.84)%，B53的ORAC值及DPPH自由基清除率分別由(728.48±59.48) μmol Trolox/g和(82.45±2.26)%降低至(600.45±36.79) μmol Trolox/g和(72.48±0.88)%，且0～15 d時(shí)的降低幅度相對(duì)較大，15～30 d時(shí)抗氧化特性的變化不顯著，說明茶酒的抗氧化效果在貯藏初期會(huì)隨著時(shí)間的增加而顯著減弱，而貯藏后期時(shí)的抗氧化效果較為穩(wěn)定，這可能與茶多酚等生化成分含量的減少，以及貯藏后期時(shí)的整個(gè)體系處于相對(duì)平衡的狀態(tài)有關(guān)。此外，G52、B53的ORAC值及DPPH自由基清除率顯著高于普通高粱酒，這主要是由于茶酒富含多種具有抗氧化效果的生化成分?？梢?，適當(dāng)?shù)仫嬘貌杈凭哂休^好的保健功效，且保健功效優(yōu)于普通高粱酒。

圖3 ORAC值和DPPH自由基清除率在茶酒貯藏過程中的變化Fig.3 Change in ORAC values and DPPH free radical scavenging capacity of tea wine during storage

3 討論

綠茶酒和紅茶酒均采用62%(vol)高粱酒浸提和52%vol高粱酒調(diào)配，質(zhì)量濃度分別為1.0、1.5 g/L時(shí)的感官評(píng)分最高。貯藏30 d后，綠茶酒的茶多酚含量、亮度、綠色度、ORAC值和DPPH自由基清除率逐漸降低，黃色度及沉淀量逐漸增加；紅茶酒的茶多酚含量、亮度、ORAC值和DPPH自由基清除率逐漸降低，黃色度保持穩(wěn)定，紅色度及沉淀量逐漸增加，表明茶酒在貯藏過程中因發(fā)生各種氧化、聚合反應(yīng)，茶多酚含量、澄清度和抗氧化能力均有所降低，其色澤則會(huì)逐漸褐變。

通過對(duì)穩(wěn)定性及抗氧化特性進(jìn)行探究，對(duì)于茶酒的生產(chǎn)利用具有一定借鑒意義?？舍槍?duì)茶酒貯藏過程中出現(xiàn)的生化成分含量和澄清度降低、色澤褐變、抗氧化功效減弱等問題，進(jìn)行品質(zhì)改進(jìn)的相關(guān)研究，如添加合適的包埋劑、抗氧化劑、澄清劑，篩選合適的茶樹品種，加工工藝的進(jìn)一步優(yōu)化等。此外，茶酒的品質(zhì)包括外觀、口感、香氣、風(fēng)格，其中香氣是茶酒品質(zhì)的重要組成部分，而目前對(duì)于茶酒香氣的研究主要采用定性分析，后期可結(jié)合精確定量分析和統(tǒng)計(jì)學(xué)方法對(duì)茶酒的特征性香氣組分進(jìn)行探究。