常溫固態(tài)發(fā)酵魚粉的工藝優(yōu)化

張飛，張海玲，王春利，王志高，羅紅宇*

1(浙江海洋大學(xué) 食品與醫(yī)藥學(xué)院，浙江 舟山，316022) 2(舟山富晟食品科技有限公司，浙江 舟山，316000)

隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)和捕撈業(yè)的飛速發(fā)展，飼料蛋白的需求量也越來越大。優(yōu)質(zhì)魚粉可以促進魚、蝦等對高營養(yǎng)物質(zhì)的吸收利用，進而促進魚、蝦等的生長和繁殖，在當今的水產(chǎn)飼料中占據(jù)優(yōu)勢地位。近年來，全球魚粉年產(chǎn)量維持在500～600萬t，目前，我國國內(nèi)魚粉產(chǎn)量大約在50萬t，年均進口魚粉為130～150萬t[1]。

魚粉是以魚、蝦、蟹等或水產(chǎn)加工廢棄物為原料，經(jīng)蒸煮、壓榨、脫脂(或不脫脂)、干燥、粉碎而獲得的粉狀或顆粒狀產(chǎn)品[2]。根據(jù)不同的加工原料，魚粉可大致分為白魚粉和紅魚粉：以鰭魚、狹鰭、黑線鰭等白肉魚類為原料生產(chǎn)的魚粉為白魚粉；以金槍魚、鮐魚、沙丁魚等紅肉魚類為原料生產(chǎn)的魚粉為紅魚粉[3-6]。魚粉的主要生產(chǎn)方式是干法和濕法。干法魚粉的生產(chǎn)工藝為原料破碎、干燥、脫脂、粉碎、篩粉、成品包裝[7-8]，其缺點為長時間高溫干燥使魚粉焦化呈褐色，破壞魚粉的營養(yǎng)成分，營養(yǎng)價值降低；濕法魚粉的生產(chǎn)基本實現(xiàn)了蒸煮、壓榨、干燥及油/水分離等過程的自動化流水線控制，減少了油脂氧化帶來的影響，提高了魚粉的質(zhì)量，但在生產(chǎn)過程中容易造成游離氨基酸、水溶性蛋白質(zhì)等營養(yǎng)成分的流失，降低了魚粉的營養(yǎng)價值。因此離心法、萃取法、水解法、發(fā)酵法等新的魚粉生產(chǎn)工藝正在逐漸取代傳統(tǒng)的干法和濕法，其中發(fā)酵法因原料適用性廣、消除抗營養(yǎng)因子、提高蛋白消化率及生物利用率、產(chǎn)品富含多種生物活性因子、工藝環(huán)保等優(yōu)點開發(fā)潛力巨大。

水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)和捕撈業(yè)的發(fā)展帶動了水產(chǎn)加工業(yè)的飛速發(fā)展，在加工過程中產(chǎn)生了大量如魚頭、魚皮、魚骨、魚鰾、蝦殼、蟹殼等下腳料，這些下腳料約占原料魚總重的40%～55%[9]，大部分作為飼料原料被粗放加工，不僅浪費資源，還污染環(huán)境。用這些下腳料作為魚粉生產(chǎn)原料，具有很好的應(yīng)用前景。但發(fā)酵法需針對不同原料選用不同的菌種，發(fā)酵工藝參數(shù)也需相應(yīng)調(diào)整。故本文利用研究室自行篩選出的復(fù)合菌株，發(fā)酵水產(chǎn)下腳料來生產(chǎn)魚粉，以總氮含量為評價指標，對影響發(fā)酵效果的關(guān)鍵工藝參數(shù)進行優(yōu)化，旨在為發(fā)酵魚粉的生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 發(fā)酵菌種

酵母菌、植物乳桿菌和枯草芽孢桿菌(1∶1∶1)混合菌粉，由本研究室經(jīng)篩選、馴化、強化、量產(chǎn)制備。

1.1.2 試驗原料

小雜魚(梅魚、沙丁魚、鯷魚等)，購自浙江舟山市多加水產(chǎn)加工企業(yè)。

輔料：淀粉、糖蜜、植物蛋白粉，購自舟山本地。

1.1.3 實驗試劑

濃H2SO4、K2SO4、CuSO4、NaOH、HCl、H3BO3、甲基紅、溴甲酚綠、Na2CO3、茚三酮、KH2PO4、Na2HPO4，均為分析純，購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.1.4 實驗儀器與設(shè)備

YXQ-LS-75S 立式壓力蒸汽滅菌器，上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；HZQ-F160 全溫振蕩培養(yǎng)箱，上海今友試驗設(shè)備有限公司；JJ500 電子分析天平，廣州滬瑞明儀器有限公司；KDN-04消化爐，上海佐田精密有限公司；Kjeltec 8400 全自動凱氏定氮儀，上海瑞玢國際貿(mào)易有限公司；722G可見分光光度計，上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 影響發(fā)酵效果的單因素實驗

1.2.1.1 輔料添加量對發(fā)酵效果的影響

稱取絞碎的水產(chǎn)下腳料50 g于250 mL錐形瓶中，封口后于121 ℃滅菌20 min，冷卻后分別加入質(zhì)量分數(shù)為0.5%、1.0%、2.5%、5.0%、7.5%、10%的輔料[m(淀粉)∶m(糖蜜)∶m(植物蛋白粉)=1∶1∶1]，接入經(jīng)活化的混合菌5%，攪拌混勻，置于30 ℃全溫振蕩培養(yǎng)箱中發(fā)酵96 h后測發(fā)酵液總氮含量。發(fā)酵過程中每隔4 h攪拌1次保證溶氧充分。

1.2.1.2 接菌量對發(fā)酵效果的影響

稱取經(jīng)絞碎的水產(chǎn)下腳料50 g于250 mL錐形瓶中，封口后于121 ℃滅菌20 min，冷卻后加入質(zhì)量分數(shù)為1%的輔料[m(淀粉)∶m(糖蜜)∶m(植物蛋白粉)=1∶1∶1]，接菌量分別為1%、2.5%、5%、7.5%、10%，攪拌混勻，置于30 ℃全溫振蕩培養(yǎng)箱中發(fā)酵96 h后測發(fā)酵液總氮含量。發(fā)酵過程中每隔4 h攪拌1次保證溶氧充分。

1.2.1.3 發(fā)酵溫度對發(fā)酵效果的影響

稱取經(jīng)絞碎的水產(chǎn)下腳料50 g于250 mL錐形瓶中，封口后于121 ℃滅菌20 min，冷卻后加入質(zhì)量分數(shù)為1%的輔料[m(淀粉)∶m(糖蜜)∶m(植物蛋白粉)=1∶1∶1]，接菌量5%，攪拌混勻，分別置于20、25、30、35、40 ℃發(fā)酵96 h后測發(fā)酵液總氮含量。發(fā)酵過程中每隔4 h攪拌1次保證溶氧充分。

1.2.1.4 發(fā)酵時間對發(fā)酵效果的影響

稱取經(jīng)絞碎的水產(chǎn)下腳料50 g于250 mL錐形瓶中，封口后于121 ℃滅菌20 min，冷卻后加入質(zhì)量分數(shù)為1%輔料[m(淀粉)∶m(糖蜜)∶m(植物蛋白粉)=1∶1∶1]，接菌量5%，攪拌混勻，置于30 ℃全溫振蕩培養(yǎng)箱中，分別發(fā)酵24、48、72、96、120、144 h，發(fā)酵過程中每隔4 h攪拌1次保證溶氧充分，發(fā)酵結(jié)束后測發(fā)酵液總氮含量。

1.2.1.5 有氧和無氧發(fā)酵效果的比較

分別稱取經(jīng)絞碎的水產(chǎn)下腳料50 g于4個250 mL錐形瓶中，封口后于121 ℃滅菌20 min，冷卻后加入質(zhì)量分數(shù)為1%的輔料[m(淀粉)∶m(糖蜜)∶m(植物蛋白粉)=1∶1∶1]，接菌量為5%，攪拌混勻，置于30 ℃全溫振蕩培養(yǎng)箱中發(fā)酵96 h后測發(fā)酵液總氮含量。發(fā)酵過程中，其中一個樣品每隔4 h攪拌1次;一個樣品前48 h每隔4 h攪拌1次；后48 h密封發(fā)酵，一個樣品前48 h密封發(fā)酵，后48 h每隔4 h攪拌1次；一個樣品96 h都密封發(fā)酵。

1.2.2 發(fā)酵工藝優(yōu)化的正交試驗

在單因素試驗結(jié)果基礎(chǔ)上，結(jié)合實際生產(chǎn)情況，以徐修志[10]發(fā)酵優(yōu)化實驗設(shè)計方法為基礎(chǔ)，采用有氧發(fā)酵，選取接菌量、發(fā)酵溫度和發(fā)酵時間3個因素進行正交優(yōu)化，每個因素取3個水平，試驗設(shè)計如表1所示。

表1 正交試驗因素水平表Table 1 Factor level table of orthogonal test

1.2.3 發(fā)酵產(chǎn)物中總氮含量的測定

在楊亞麗[11]的方法基礎(chǔ)上改進：稱取發(fā)酵產(chǎn)物1.0 g左右(精準至0.000 1 g)于消化管中，加入0.3 g CuSO4，0.9 g K2SO4，12 ml濃H2SO4，經(jīng)240 ℃碳化，400 ℃消化，消化液澄清(淡藍色或淺綠色)為消化終點，冷卻后得到待測樣品，采用全自動凱氏定氮儀測總氮含量。

1.2.4 游離氨基酸總量的測定

1.2.4.1 氨基酸標準曲線的制作[12]

準確吸取0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL的0.2 mg/mL的谷氨酸標準溶液，分別置于25 mL的具塞比色管中，然后加入體積分數(shù)為2%茚三酮溶液和磷酸鹽緩沖溶液(pH 6.7)各1 mL，混合均勻，水浴加熱15 min取出，迅速冷卻至室溫，加水至標線，搖勻，靜置15 min后，在570 nm波長下，以試劑空白為參比測定各溶液吸光值(A)。以氨基酸質(zhì)量(mg)為橫坐標，吸光值(A)為縱坐標，繪制標準曲線。

1.2.4.2 原料和發(fā)酵液中游離氨基酸總量的測定

準確稱取樣品1.0 g，加水稀釋100倍，混勻備用。吸取樣品溶液1.0 mL，按照標準曲線制作步驟，在相同條件下測定吸光值(A)，用測得A值在標準曲線上即可查得對應(yīng)的氨基酸質(zhì)量(mg)。

1.2.4.3 結(jié)果計算

式中：C為從標準曲線上查得的氨基酸質(zhì)量(mg)；m為測定的樣品溶液相當于樣品的質(zhì)量(g)。

1.2.5 魚粉主要成分的測定

發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)真空冷凍干燥制得魚粉，測定主要指標：粗蛋白， GB/T 6432—1994，凱氏定氮法；粗脂肪，GB/T 6432—1994，索氏抽提法；灰分，GB/T 6432—1994，高溫灼燒法；水分， GB/T 6432—1994，恒重法。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵工藝優(yōu)化

2.1.1 輔料添加量對發(fā)酵產(chǎn)物總氮含量的影響

當輔料的添加量不同時，水產(chǎn)下腳料的發(fā)酵產(chǎn)物中總氮含量的結(jié)果見圖1。

圖1 輔料添加量對發(fā)酵產(chǎn)物中總氮含量的影響Fig.1 Effect of addition amount of excipients on total nitrogen content in fermentation products

如圖1所示，魚粉中輔料質(zhì)量分數(shù)在0.5%～1.0%區(qū)間，發(fā)酵產(chǎn)物中總氮含量逐漸增加直至添加質(zhì)量分數(shù)為1%的輔料時，總氮含量達到最大值，之后，總氮含量隨輔料添加量的增加呈下降趨勢。原因可能是輔料的添加在一定程度上彌補了發(fā)酵底物中碳氮源的不足，促進經(jīng)了微生物的生長，但隨著輔料量的增加，碳源、氮源的含量增大，導(dǎo)致發(fā)酵體系的滲透壓增加，從而影響微生物的生長和代謝，甚至導(dǎo)致微生物死亡。因此，取質(zhì)量分數(shù)為1%的輔料為較佳發(fā)酵工藝參數(shù)。

2.1.2 接菌量對發(fā)酵產(chǎn)物中總氮含量的影響

接菌量會對最終的發(fā)酵效果產(chǎn)生影響。林俊宏等[13]的研究表明，接菌量過少會導(dǎo)致發(fā)酵過程緩慢，發(fā)酵底物不能充分酵解，發(fā)酵效果不佳；接菌量過高時菌體過度生長，因菌株之間的營養(yǎng)競爭，影響菌株的生長代謝，造成原料中有機質(zhì)的降解率下降。在不同接菌量條件下，發(fā)酵產(chǎn)物的總氮含量見圖2。

圖2 接菌量對發(fā)酵產(chǎn)物中總氮含量的影響Fig.2 Effect of inoculum size on total nitrogen content in fermentation products

由圖2可知，發(fā)酵產(chǎn)物的總氮含量隨著接菌量的增加呈先升后降的趨勢，當接菌量為5%時，總氮含量達到最高值3 338.86 mgN/100 g。原因可能是隨著接菌量的增加，菌體生長迅速，降解原料中有機質(zhì)的速率增加，產(chǎn)生蛋白酶的量也增多，所以總氮含量逐漸升高；但當接菌量持續(xù)增加時，菌體的生長消耗了過量的底物營養(yǎng)，以致造成營養(yǎng)不足、生長受限、降解有機質(zhì)的效率下降，總氮含量下降。

2.1.3 溫度對發(fā)酵產(chǎn)物中總氮含量的影響

溫度對微生物的生長代謝有著重要影響，溫度較低時，微生物體內(nèi)的酶活力低，不利于原料中有機質(zhì)的降解；溫度過高時，會使酶失活，加速菌體的衰老，影響發(fā)酵效果。在不同溫度條件下，發(fā)酵產(chǎn)物的總氮含量見圖3。

圖3 溫度對發(fā)酵產(chǎn)物中總氮含量的影響Fig.3 Effect of temperature on total nitrogen content in fermentation products

如圖3所示，發(fā)酵產(chǎn)物的總氮含量隨著溫度的升高呈先升后降的趨勢，與35～40 ℃發(fā)酵溫度相比，當溫度為25～35 ℃時，發(fā)酵產(chǎn)物的總氮含量較高。原因是微生物體內(nèi)的酶促反應(yīng)都有一定的溫度范圍，本試驗所用的3種混合菌中，枯草芽孢桿菌的適宜生長溫度為28～36 ℃[14]、植物乳桿菌的適宜生長溫度為28～37 ℃[15]、酵母菌的適宜生長溫度為20～30 ℃[16]。當混合發(fā)酵時，3種菌都適宜的生長溫度為30 ℃左右。

2.1.4 發(fā)酵時間對發(fā)酵產(chǎn)物中總氮含量的影響

發(fā)酵時間的研究長短會對發(fā)酵效果產(chǎn)生影響。談佳玉等[17]表明，發(fā)酵時間太短，微生物的生長繁殖就會受到影響，從而對有害微生物的抑制作用不強，蛋白酶的分泌不足，影響大分子蛋白的降解；發(fā)酵時間過長，發(fā)酵底物中營養(yǎng)物質(zhì)就會被微生物的大量繁殖所消耗，而且雜菌大量生長，微生物的代謝產(chǎn)物也會發(fā)生變化，有可能導(dǎo)致發(fā)酵失敗。同時發(fā)酵時間過長不僅會提高輸出成本，還會影響產(chǎn)品生產(chǎn)周期，使產(chǎn)品品質(zhì)不穩(wěn)定。發(fā)酵時長不同時，發(fā)酵產(chǎn)物的總氮含量見圖4。

圖4 發(fā)酵時間對發(fā)酵產(chǎn)物中總氮含量的影響Fig.4 Effect of fermentation time on total nitrogen content in fermentation products

由圖4可知，發(fā)酵產(chǎn)物中總氮含量隨著發(fā)酵時間的延長不斷增加，當發(fā)酵時間為96 h時，發(fā)酵產(chǎn)物中總氮含量最高為3 409.33 mgN/100 g，之后總氮含量趨于平緩下降。原因可能是在發(fā)酵初期，由于發(fā)酵時間較短，菌體生長不完全，無法充分分解利用發(fā)酵底物，所以總氮含量較低，當?shù)孜锝到馔耆?，繼續(xù)發(fā)酵，因營養(yǎng)不足，會抑制微生物增殖，進而菌體會出現(xiàn)自然溶解現(xiàn)象[18]。

2.1.5 含氧水平對發(fā)酵產(chǎn)物總氮含量的影響

含氧量是影響微生物機體生長和代謝繁殖的重要因素之一。含氧量不足會影響好氧微生物的生長，導(dǎo)致原料中有機質(zhì)的降解受抑制，影響發(fā)酵效果。因為枯草芽孢桿菌、酵母菌為好氧菌，植物乳桿菌為厭氧或兼性厭氧菌，因此按1.2.1.5設(shè)計了4組發(fā)酵期間不同含氧量的試驗，發(fā)酵產(chǎn)物的總氮含量見圖5。

由圖5可知，全程有氧的發(fā)酵產(chǎn)物中總氮含量最高，全程缺氧的發(fā)酵產(chǎn)物中總氮含量最低，其他兩種情況的發(fā)酵產(chǎn)物的總氮含量居于兩者之間。其原因可能是枯草芽孢桿菌、酵母菌為好氧菌，盡管無氧條件下也能對發(fā)酵底物進行降解，但降解作用有限，而植物乳桿菌為厭氧或兼性厭氧菌，在無氧條件下會發(fā)酵產(chǎn)生乳酸，使發(fā)酵底物pH值改變，影響微生物生長。因此，正交實驗優(yōu)化工藝時采用全程有氧發(fā)酵方式。

A-有氧；B-前48 h有氧后48 h無氧；C-前48 h無氧后48 h有氧；D-無氧。圖5 含氧量對發(fā)酵效果的影響Fig.5 Effect of oxygen content on Fermentation

2.1.6 微生物發(fā)酵魚粉正交試驗結(jié)果分析

發(fā)酵工藝優(yōu)化的正交試驗結(jié)果如表2、表3所示。極差分析顯示，對發(fā)酵產(chǎn)物總氮含量影響強弱順序為C>B>A，即發(fā)酵時間影響最大，其次為發(fā)酵溫度，接菌量的影響最小。方差分析結(jié)果表明，發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度的p<0.01，對總氮含量的影響十分顯著，接菌量的p<0.10，對總氮含量的影響顯著。確定優(yōu)化的工藝條件為A3B2C2，即發(fā)酵時間為96 h，發(fā)酵溫度為30 ℃，接菌量為6%。在優(yōu)化工藝條件下進行驗證試驗，平行測定3個樣品，測得發(fā)酵產(chǎn)物中總氮含量為3 462.67±50.45 mgN/100 g，說明此工藝是穩(wěn)定、可行的。

表2 微生物發(fā)酵魚粉正交試驗結(jié)果分析表Table 2 Results of orthogonal test of microbial fermented fish meal

表3 方差分析表Table 3 Variance analysis table

2.2 發(fā)酵液總游離氨基酸含量分析

2.2.1 氨基酸標準曲線

以氨基酸質(zhì)量(mg)為橫坐標，吸光值(A)為縱坐標，得到氨基酸標準曲線如圖6所示。

圖6 谷氨酸標準曲線Fig.6 Standard curve of glutamic acid

經(jīng)統(tǒng)計分析，得線性回歸曲線為：y=1.750 7x-0.064 6，R2=0.990 2，說明曲線可信度較高，可以運用。

2.2.2 原料和發(fā)酵液的游離氨基酸總量

已有研究表明混菌發(fā)酵后產(chǎn)物中氨基酸含量均高于未接菌的[19]。由表4可知，水產(chǎn)下腳料經(jīng)微生物發(fā)酵后，游離氨基酸總量有明顯提高，由發(fā)酵前1.71 g/100 g提高到發(fā)酵后3.86 g/100 g，提高了1.26 倍。說明菌種分解原料蛋白質(zhì)的能力較強，作為水產(chǎn)飼料的蛋白源，可以提高飼料的消化利用率。

表4 原料和發(fā)酵液的原料游離氨基酸總量Table 4 Total free amino acids in raw materials and fermentation broth

2.3 魚粉主要成分分析

水產(chǎn)下腳料經(jīng)過微生物發(fā)酵，所得發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)真空冷凍干燥后，濃縮得到發(fā)酵魚粉，其主要成分含量如表5所示。

蛋白質(zhì)含量是評價魚粉質(zhì)量的一項關(guān)鍵指標，也是影響魚粉價格的重要因素。蛋白質(zhì)含量越高，魚粉質(zhì)量越好，此外，魚粉中的粗脂肪、灰分和水分等也是評價魚粉的重要指標[20-24]，以不飽和脂肪酸為主的魚粉容易氧化從而造成魚粉品質(zhì)下降，灰分越高就說明魚粉中魚骨砂石等就越多，魚粉品質(zhì)就越差。由表5可知，魚粉中蛋白質(zhì)質(zhì)量分數(shù)為61.59 %，達到一級品標準；粗脂肪質(zhì)量分數(shù)為12.43 %，達到二級品標準；灰分質(zhì)量分數(shù)為17.52 %，達到一級品標準；水分質(zhì)量分數(shù)為7.75 %，達到一級品標準。

表5 發(fā)酵魚粉主要成分含量Table 5 Contents of main components in fermented fish meal

3 結(jié)論

本文以水產(chǎn)下腳料為原料，利用微生物固態(tài)發(fā)酵法制備魚粉，通過對影響發(fā)酵效果的因素：輔料、接菌量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間和含氧量，進行一系列的單因素試驗和正交試驗，最終確定最佳發(fā)酵工藝條件為：魚粉中輔料質(zhì)量分數(shù)1%、接菌量6%、發(fā)酵溫度30 ℃、發(fā)酵時間96 h、有氧發(fā)酵。在此發(fā)酵條件下，發(fā)酵產(chǎn)物中總氮含量達到(3 462.67±50.45) mgN/100 g。發(fā)酵液經(jīng)濃縮后所得魚粉營養(yǎng)指標接近一級品，其中關(guān)鍵質(zhì)量指標蛋白質(zhì)含量達到國標一級品標準。本研究充分挖掘了水產(chǎn)下腳料的資源價值，工藝技術(shù)綠色、安全，為優(yōu)質(zhì)魚粉的開發(fā)提供了一定的技術(shù)支持，具有良好的應(yīng)用前景。

魚粉是水產(chǎn)飼料中蛋白質(zhì)的主要來源，微生物發(fā)酵制備魚粉可以在人工控制的條件下，通過一些有益微生物在飼料原料中進行一系列的新陳代謝和生長繁殖，將飼料原料中那些對動物有毒有害的物質(zhì)或動物不能完全消化吸收的物質(zhì)進行轉(zhuǎn)化分解，從而產(chǎn)生容易被動物消化吸收的無毒無害的代謝產(chǎn)物和富含消化酶及益菌體的飼料。而且，利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)魚粉可以使大分子的動物蛋白分解成小分子的肽和氨基酸，使魚粉具有更高的附加值，具有更廣闊的市場前景。