嗜酸乳桿菌微膠囊制備及工藝優(yōu)化

張宇，王連艷，王艷萍

1(天津科技大學(xué) 食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津，300450) 2(中國科學(xué)院 過程工程研究所，北京，100089)

嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus，LA)為乳桿菌屬，是革蘭氏陽性桿菌，廣泛存在于人體和一些動(dòng)物腸道內(nèi)，為益生菌[1-3]。很多益生菌口服經(jīng)過胃的強(qiáng)酸環(huán)境時(shí)容易失活，導(dǎo)致其在腸道發(fā)揮的活性作用較弱，為了最大限度保證益生菌在腸道中的活性，發(fā)揮腸道菌群調(diào)節(jié)作用的有益功效，將益生菌微膠囊化可以起到很好的隔離保護(hù)作用，使其到達(dá)腸道時(shí)發(fā)揮更好的功效。

海藻酸鈉是海藻中提取出來的β-D-甘露糖醛酸和 α-L-古羅糖醛酸組成，是線性雜多糖[4]，具有良好的生物相容特性和生物可降解特性，海藻酸鈉可在某些二價(jià)陽離子如Ca2+、Ba2+存在時(shí)吸收水分生成凝膠[5-13]，可用于微膠囊的制備。另外，海藻酸鹽微膠囊具有優(yōu)良的pH敏感釋放的特性，在酸性環(huán)境下表面更為致密，保護(hù)所包埋的益生菌，而在腸道的pH環(huán)境下，能夠迅速崩解，釋放出包埋的益生菌，發(fā)揮調(diào)節(jié)腸道菌群的作用?，F(xiàn)有的海藻酸鹽微膠囊的制備方法包括微乳化法、噴霧干燥法、擠壓法及復(fù)合凝聚法。其中，噴霧干燥法應(yīng)用最廣泛，具有操作簡(jiǎn)單，成本較低的優(yōu)點(diǎn)。噴霧干燥法是利用高壓泵，將物料通過霧化器以一定速度的氣流剪切成小液滴，與較高溫度的熱空氣接觸使水分迅速氣化得到干燥的產(chǎn)品。此方法中，干燥時(shí)，液滴要與高溫氣體接觸，這會(huì)導(dǎo)致所包埋的活性物質(zhì)失活。為了保持所包埋物質(zhì)的活性，在噴霧干燥法的基礎(chǔ)上，我們發(fā)展了噴霧法結(jié)合離子固化法，以嗜酸乳桿菌為模式益生菌，制備微膠囊。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus)來自于傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品，由天津科技大學(xué)發(fā)酵食品與微生物資源開發(fā)研究室提供。

海藻酸鈉, 比利時(shí)Acros Organics公司；無水氯化鈣、無水乙酸鈉、乙酸, 西隴科學(xué)股份有限公司；生理鹽水，石家莊四藥有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

B-290小型噴霧干燥儀，瑞士BUCHI Labortechnik公司；85-2型恒溫磁力攪拌器，上海司樂儀器有限公司；超聲波清洗機(jī)，寧波新芝生物科技公司；XSZ-H3光學(xué)顯微鏡，重慶光電儀器有限公司；WV-CP230/G攝像頭，日本Panasonic公司；Coulter Ls230激光粒度儀，美國Coulter 公司；JEM-6700F掃描電鏡，日本JEOL公司的產(chǎn)品；YQX-Ⅱ厭氧培養(yǎng)箱，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司；BS 110S型天平-，德國Sartorius公司；高速離心機(jī)，美國Beckman Coulter公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 MRS培養(yǎng)基的配置

培養(yǎng)基配制：蛋白胨10.0 g、牛肉膏10.0 g、酵母膏5.0 g、葡萄糖20.0 g、吐溫80 1.0 mL、 K2HPO42.0 g、醋酸鈉5.0 g、檸檬酸二銨2.0 g、MgSO4·7 H2O 0.58 g、MnSO4·4 H2O為0.25 g、蒸餾水1 000 mL，將上述物質(zhì)溶解后，調(diào)整培養(yǎng)基的pH值為6.2～6.6(滅菌后為6.0～6.5)，121 ℃下滅菌20 min[26]，備用。

1.2.2 菌種的培養(yǎng)與方法

使用平板劃線法將保存于-80 ℃冰箱中的嗜酸乳桿菌接種于MRS平板上，通過平板劃線法，得到嗜酸乳桿菌單菌落。隨后，將嗜酸乳桿菌單菌落接種于5 mL的液體MRS培養(yǎng)基中，將其置于37 ℃的恒溫厭氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，待菌體布滿試管底部時(shí)，接著繼續(xù)傳代1次，將連續(xù)活化2次的菌體保存于4 ℃冰箱中，備用[2]。

1.2.3 空白海藻酸鈣微膠囊制備優(yōu)化

采用噴霧法結(jié)合離子固化法制備載嗜酸乳桿菌微膠囊，為了獲得最佳嗜酸乳桿菌包埋效果，首先進(jìn)行了空白海藻酸鈣微膠囊制備工藝優(yōu)化。具體制備過程如下：

將適量海藻酸鈉粉末溶解于生理鹽水中，制成海藻酸鈉溶液，由噴霧干燥器的蠕動(dòng)泵將其帶入設(shè)備中，由一定氣速的氣體將海藻酸鈉溶液切成小液滴，通過噴嘴噴入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的CaCl2水溶液，在300 r/min的攪拌速度下對(duì)噴入的液滴固化，隨后，離心洗滌去除多余的CaCl2和沒有固化的液滴，最后將海藻酸鈣微膠囊懸浮于生理鹽水中，備用[14]。

海藻酸鈣微膠囊的粒徑對(duì)益生菌包埋和后續(xù)體內(nèi)評(píng)價(jià)緊密相關(guān)。通常而言，益生菌大多為微米級(jí)，采用微膠囊進(jìn)行包埋時(shí)，若微膠囊粒徑太小，益生菌的包埋率會(huì)比較低；若微膠囊粒徑太大，在后續(xù)進(jìn)行動(dòng)物體內(nèi)評(píng)價(jià)時(shí)，不利于進(jìn)行給藥研究，通常采用小鼠進(jìn)行口服給藥后，進(jìn)行腸道微生態(tài)調(diào)節(jié)等評(píng)價(jià)，在進(jìn)行小鼠灌胃給藥時(shí)，微膠囊粒徑不能太大，通常需要控制在50 μm以下[27-29]。為了獲得合適粒徑的海藻酸鈣微膠囊，需要進(jìn)行空白微膠囊制備工藝優(yōu)化。采用噴霧結(jié)合離子固化法制備海藻酸鈣微膠囊時(shí)，海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)、氣速和進(jìn)料速度是調(diào)節(jié)微膠囊粒徑大小的主要因素。在獲得最優(yōu)海藻酸鈣微膠囊制備工藝后，再制備載嗜酸乳桿菌的海藻酸鈣微膠囊。

制備海藻酸鈣微膠囊時(shí)，海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)通常控制在1%～1.5%；氣速越高，微膠囊粒徑越小；進(jìn)料速度越大，微膠囊粒徑越大[14]。

綜合考慮，設(shè)計(jì)了L9(34)的正交試驗(yàn)，以海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)、氣速及進(jìn)料速度進(jìn)行3因素3水平的正交試驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 Level of factor used in orthogonal array design

1.2.4 微膠囊粒徑及粒徑分布測(cè)定

微囊的粒徑大小及粒徑分布采用激光粒度儀進(jìn)行測(cè)定。取一定量的微膠囊重懸于生理鹽水中，超聲分散后，將其滴加到激光粒度儀的樣品池中，進(jìn)行體積平均粒徑(d4,3)及粒徑分布(Span)的測(cè)定。

(1)

式中：di，每個(gè)粒子的直徑；ni，直徑是di的粒子數(shù)。

Span=(d90-d10)/d50

(2)

式中：d90、d50、d10分別表示微膠囊樣品中90%、50%、10%的顆粒直徑小于該值所示尺寸。

1.2.5 微膠囊形態(tài)觀察

采用具有拍攝功能的光學(xué)顯微鏡對(duì)微膠囊的形態(tài)進(jìn)行觀察、拍照及記錄，具體過程如下：使用滴管滴加少量樣品于載玻片上，輕輕蓋上蓋玻片，先在低倍鏡下找到合適的視野，再轉(zhuǎn)換到高倍鏡進(jìn)行微膠囊形態(tài)觀察，同時(shí)用WV-CP230/G攝像頭將樣品狀態(tài)拍攝記錄，通過形態(tài)觀察初步評(píng)價(jià)微膠囊的質(zhì)量。

1.2.6 載嗜酸乳桿菌微膠囊的制備

稱取一定量的海藻酸鈉粉末溶于生理鹽水中，制成海藻酸鈉溶液備用。將適量菌液與上述海藻酸鈉溶液混合，緩慢攪拌，混合均勻后，用噴霧干燥器的蠕動(dòng)泵將含菌的海藻酸鈉懸浮液帶入設(shè)備中，在一定氣速作用下，將上述懸浮液切成小液滴，通過噴嘴噴入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的CaCl2水溶液中，在300 r/min的攪拌下固化液滴，隨后，離心洗滌除去多余的CaCl2和未固化的液滴，將收集的微膠囊懸浮在生理鹽水中，備用[14]。

1.2.7 嗜酸乳桿菌微膠囊活菌包埋率的測(cè)定

將嗜酸乳桿菌微膠囊置于無菌濃度為0.2 mol/L 的檸檬酸鈉溶液中，在 37 ℃ 、100 r/min攪拌條件下將微膠囊裂解30 min，微膠囊完全裂解后，離心收集菌體，重懸于生理鹽水中。用生理鹽水梯度稀釋菌液，分別吸取200 μL各梯度菌液涂布于MRS平板中，用無菌涂布器涂布均勻，各稀釋濃度做3個(gè)重復(fù)測(cè)定平板，并留下一個(gè)平板作空白對(duì)照。然后將平板倒置于37 ℃厭氧培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)48 h，觀察菌落生長(zhǎng)情況，計(jì)錄菌落數(shù)?；罹鷶?shù)按公式(3)計(jì)算，益生菌活菌包埋率按公式(4)計(jì)算：

(3)

(4)

式中：S，活菌數(shù)， CFU/mL；X1，平板1菌落數(shù)，個(gè)；X2，平板2菌落數(shù)，個(gè)；X3，平板3菌落數(shù)，個(gè)；E，包埋率，%；C1，微膠囊裂解后測(cè)得的活菌數(shù)，CFU/mL；C，總菌數(shù)，CFU/mL。

采用平板菌落計(jì)數(shù)法計(jì)算海藻酸鈣微膠囊中嗜酸乳桿菌的包埋率，其實(shí)也是對(duì)微膠囊中嗜酸乳桿菌活性的測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 空白海藻酸鈣微膠囊制備優(yōu)化

2.1.1 正交試驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果

空白海藻酸鈣微膠囊優(yōu)化制備的正交試驗(yàn)結(jié)果如表2所示。

表2 空白海藻酸鈣微膠囊正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 The orthogonal design results of blank calcium alginate microcapsules

海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)、氣速和進(jìn)料速度這3個(gè)因素對(duì)空白微膠囊粒徑大小的影響程度為：氣速>進(jìn)料速度>海藻酸鈉濃度?？瞻孜⒛z囊的最優(yōu)水平組合為A3B1C1，即海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.5%、氣速為450 L/h、進(jìn)料速度為1 mL/min。

圖1顯示了海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)、氣速及進(jìn)料速度對(duì)所制備的海藻酸鈣微膠囊粒徑大小的影響。結(jié)果顯示，隨著氣速的增加，微膠囊粒徑隨之減?。浑S著進(jìn)料速度的增加，微膠囊的粒徑也隨之增加；而海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)微膠囊粒徑大小影響不大。

圖1 海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)(A)、氣速(B)及進(jìn)料速度(C)對(duì)微膠囊粒徑大小的影響Fig.1 Effect of the concentration of sodium alginate(A), the spray gas flow(B) and the feed flow(C) on size of microcapsules

2.1.2 驗(yàn)證性試驗(yàn)

在上述優(yōu)化工藝下，制備了3批空白海藻酸鈣微膠囊，驗(yàn)證優(yōu)化結(jié)果可靠性。

采用光學(xué)顯微鏡對(duì)制備的3批微膠囊形態(tài)進(jìn)行了觀察，初步評(píng)價(jià)微膠囊產(chǎn)品質(zhì)量。圖2為放大倍數(shù)100×下3批空白海藻酸鈣微膠囊的光學(xué)顯微鏡照片，結(jié)果顯示，制備的3批空白海藻酸鈣微膠囊球形規(guī)整、分散性好，3批間差異不大。

圖2 最優(yōu)工藝下制備的3批空白海藻酸鈣微膠囊的粒徑分布圖Fig.2 Size distributions of blank alginate microcapsules prepared by optimal parameters

所制備的3批空白海藻酸鈣微膠囊的粒徑及粒徑分布結(jié)果如圖3所示，結(jié)果顯示，制備得3批空白海藻酸鈣微膠囊粒徑大小和粒徑分布相近，3批微膠囊的平均粒徑大小和Span值的偏差分別為1.640、1.729、1.938，表明正交試驗(yàn)優(yōu)化得到的最優(yōu)工藝真實(shí)可靠。

圖3 優(yōu)化條件下制備的3批空白海藻酸鈣微膠囊的光學(xué)顯微鏡照片F(xiàn)ig.3 Optical micrographs of blank calcium alginate microcapsules prepared by optimal parameters

2.2 載嗜酸乳桿菌的海藻酸鈣微膠囊制備

分別采用光學(xué)顯微鏡和掃描電子顯微鏡對(duì)嗜酸乳桿菌的形貌進(jìn)行觀察，結(jié)果如圖4所示。通過革蘭氏染色法對(duì)嗜酸乳桿菌進(jìn)行鑒別，圖4-A結(jié)果顯示，包埋用的嗜酸乳桿菌為革蘭式陽性菌；采用掃描電子顯微鏡觀察了嗜酸乳桿菌的形貌，圖4-B為放大5 000倍下的嗜酸乳桿菌的形貌，結(jié)果顯示，嗜酸乳桿菌為桿狀菌，桿的末端呈圓形，長(zhǎng)度約為2～3 μm，桿的截面直徑約為600 nm。

圖4 嗜酸乳桿菌的光學(xué)顯微鏡照片(A)和掃描電鏡照片(B)Fig.4 Optical graphs(A)and SEM graphs(B)of Lactobacillus acidophilus

2.2.1 嗜酸乳桿菌加入量對(duì)海藻酸鈣微膠囊制備的影響

在優(yōu)化條件下考察了不同菌加入量對(duì)載嗜酸乳桿菌的海藻酸鈣微膠囊形貌、粒徑和菌包埋量的影響。在菌加入量分別為108、109、1010和1011CFU/mL的條件下進(jìn)行了載嗜酸乳桿菌微膠囊的制備，制備得到的微膠囊的粒徑及粒徑分布和平均粒徑比較結(jié)果如圖5所示。

從圖5可以看出，隨著菌液含量增加，微膠囊的粒徑增大，這是因?yàn)槭人崛闂U菌的加入增大了料液固含量，在相同進(jìn)料速度和氣速下，剪切得到的液滴尺寸略微增大；同時(shí)，由于嗜酸乳桿菌尺寸 為微米級(jí)，這也會(huì)導(dǎo)致料液在相同剪切力下被剪切成較大的液滴，因此，所制備的載菌海藻酸鈣微膠囊粒徑隨菌加入量增加而增大。

對(duì)所制備的載嗜酸乳桿菌海藻酸鈣微膠囊進(jìn)行了光學(xué)顯微鏡觀察，圖6為100×放大倍數(shù)下觀察的不同菌加入量制備的載嗜酸乳桿菌微膠囊的光學(xué)顯微鏡照片。

圖6 含菌量為(A)108 CFU/mL，(B)109 CFU/mL， (C)1010 CFU/mL，(D)1011 CFU/mL制備的載嗜酸乳桿菌微膠囊的光學(xué)顯微鏡照片F(xiàn)ig.6 Optical micrographs of Lactobacillus acidophilus-loaded microcapsules with different Lactobacillus acidophilus

從圖6可以看出，當(dāng)菌加入量為108和109CFU/mL時(shí)，制備的載嗜酸乳桿菌海藻酸鈣微膠囊形態(tài)較完整、球形較佳，且分散性良好；當(dāng)菌加入量增大至1010和1011CFU/mL時(shí)，制備的載嗜酸乳桿菌微膠囊球形完整，但分散性較差，這可能是由于菌加入量的增大導(dǎo)致海藻酸鈣微囊固化不好，未固化好的凝膠與菌形成凝聚物，導(dǎo)致微膠囊間的粘連；另外，從光學(xué)顯微鏡照片也可以明顯看出，當(dāng)菌加入量增加至1010和1011CFU/mL時(shí)，所制備的載嗜酸乳桿菌海藻酸鈣微膠囊粒徑明顯增大。

將不同菌加入量制備的載嗜酸乳桿菌微膠囊破壞，釋放出其中的嗜酸乳桿菌，對(duì)其活性進(jìn)行了定量檢測(cè)，進(jìn)而計(jì)算出微膠囊對(duì)嗜酸乳桿菌的包埋率。結(jié)果如圖7所示。

圖7 不同菌加入量制備的海藻酸鈣微膠囊對(duì)嗜酸乳桿菌的包埋率的影響Fig.7 Effect of different amounts of Lactobacillus acidophilus on encapsulation efficiency of Lactobacillus acidophilus-loaded microcapsules

結(jié)果表明，在菌加入量低于109CFU/mL時(shí)，隨菌加入量增加，微膠囊對(duì)嗜酸乳桿菌的包埋率增大，當(dāng)菌加入量為109CFU/mL時(shí)，海藻酸鈣微膠囊對(duì)嗜酸乳桿菌的包埋率達(dá)最高；此時(shí)，繼續(xù)增加菌加入量，微膠囊對(duì)嗜酸乳桿菌的包埋率則隨菌加入量的增加而降低，表明109CFU/mL的菌加入量為最優(yōu)加入量，菌的過量加入并不提高微膠囊對(duì)嗜酸乳桿菌的包埋率。

2.2.2 最優(yōu)條件下制備的載嗜酸乳桿菌海藻酸鈣微膠囊及表征

最終獲得的載嗜酸乳桿菌海藻酸鈣微膠囊的最優(yōu)制備工藝參數(shù)如下：海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.5%、氣速為450 L/h、進(jìn)料速度1 mL/min、菌加入量為109CFU/mL。在此最優(yōu)條件下，制備了載嗜酸乳桿菌的海藻酸鈣微膠囊，其粒徑及粒徑分布圖、光學(xué)顯微鏡照片和掃描電鏡照片如圖8所示，結(jié)果顯示，微膠囊的平均粒徑為33.143 μm；光學(xué)顯微鏡結(jié)果顯示，大量嗜酸乳桿菌被包埋進(jìn)微膠囊內(nèi)；包埋率測(cè)定結(jié)果顯示，所制備的海藻酸鈣微膠囊對(duì)活菌的包埋率為79.77%；通過超臨界干燥對(duì)載嗜酸乳桿菌的海藻酸鈣微膠囊進(jìn)行了干燥，掃描電鏡結(jié)果顯示，所制備的載菌微膠囊的呈球形，表面可見大量嗜酸乳桿菌被包埋在微膠囊內(nèi)。

圖8 載嗜酸乳桿菌微膠囊的粒徑及粒徑分布圖(A)、光學(xué)顯微鏡照片(B)、掃描電子鏡照片(C)Fig.8 Size and size distributions(A) , optical micrographs(B) and scanning electron micrographs(C)of Lactobacillus acidophilus-loaded microcapsules

3 結(jié)論

本研究以海藻酸鈉為壁材，采用噴射法結(jié)合離子固化法制備載嗜酸乳桿菌的海藻酸鈣微膠囊，通過對(duì)空白海藻酸鈣微膠囊制備工藝進(jìn)行了優(yōu)化，確定制備的最佳工藝條件為：海藻酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.5%、氣速450 L/h、進(jìn)料速度1 mL/min。在此最優(yōu)制備工藝條件下，考察了不同菌加入量對(duì)載嗜酸乳桿菌微膠囊粒徑及粒徑分布、形態(tài)及菌包埋率的影響，最終選取菌加入量為109CFU/mL進(jìn)行載嗜酸乳桿菌的海藻酸鈣微膠囊制備。結(jié)果顯示，制備的微膠囊粒徑為30 μm左右，菌包埋率達(dá)到79.77%以上。通過光學(xué)顯微鏡及掃描電子顯微鏡對(duì)微膠囊進(jìn)行表征，微膠囊球形佳，粒徑小，分散性好，可滿足后續(xù)動(dòng)物體內(nèi)評(píng)價(jià)需求。