運(yùn)動激活自噬對小鼠骨骼肌抗氧化防御功能的影響

王平Chun-Guang LI崔迪 邱守濤 漆正堂 李婭暉 丁樹哲

1杭州師范大學(xué)體育與健康學(xué)院（杭州 311121）

2 National Institute of Complementary Medicine，Western Sydney University

3華東師范大學(xué)青少年健康評價與運(yùn)動干預(yù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗室

4上海交通大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院

骨骼肌占機(jī)體總重的40%～50%，是一種高度可塑性組織，運(yùn)動刺激可使肌肉發(fā)生形態(tài)學(xué)和生理生化功能方面的適應(yīng)性顯型變化[1]。已有研究報道，耐力運(yùn)動可明顯增加老年大鼠腓腸肌總超氧化物歧化酶（TSOD）和銅鋅SOD（CuznSOD）的活性，同時增強(qiáng)腓腸肌線粒體錳SOD（MnSOD）的活性[2]。耐力運(yùn)動明顯增加3月齡大鼠股外側(cè)深肌、股外側(cè)淺肌和跖肌MnSOD的活性和股外側(cè)淺肌的CuznSOD活性[3]。一次性力竭運(yùn)動明顯增加大鼠股外側(cè)深肌MnSOD mRNA的表達(dá)，同時增加股外側(cè)淺肌MnSOD蛋白含量，股外側(cè)深肌和股外側(cè)淺肌CuznSOD蛋白含量[4]。故運(yùn)動使骨骼肌抗氧化防御功能的積極適應(yīng)是維持骨骼肌健康乃至整個機(jī)體健康的重要前提和基礎(chǔ)，但運(yùn)動性骨骼肌有益適應(yīng)的潛在分子機(jī)制還不是很清楚。

有研究發(fā)現(xiàn)，自噬參與骨骼肌氧化損傷等應(yīng)激反應(yīng)[5]。Dobrowolny等[6]為了證實(shí)自噬與骨骼肌抗氧化防御功能之間的關(guān)系，建立了CuznSOD基因突變小鼠模型，結(jié)果證實(shí)自噬與抗氧化防御功能之間關(guān)系密切。運(yùn)動可適度激活自噬，它可將骨骼肌細(xì)胞內(nèi)部分細(xì)胞器、蛋白質(zhì)形成分隔膜包繞，形成自噬體，然后通過細(xì)胞骨架微管系統(tǒng)運(yùn)輸至溶酶體消化降解，并有效清除骨骼肌收縮過程中產(chǎn)生的有害的活性氧，從而維持骨骼肌細(xì)胞功能穩(wěn)態(tài)[7]。

目前而言，運(yùn)動性自噬在骨骼肌氧化應(yīng)激過程中是否必須，運(yùn)動、自噬和骨骼肌抗氧化防御功能之間潛在的分子機(jī)制還不是很清楚。本研究建立一次性力竭運(yùn)動小鼠模型，通過檢測骨骼肌自噬相關(guān)因子Beclin1、P62、Bcl2的表達(dá)變化和T-SOD、CuznSOD、MnSOD活性和T-AOC的含量變化，及P62的蛋白表達(dá)與骨骼肌TAOC含量和CuznSOD活性之間的相關(guān)性分析，探討運(yùn)動能否激活自噬和運(yùn)動性自噬與骨骼肌抗氧化防御功能之間發(fā)生交互作用的控制節(jié)點(diǎn)。預(yù)期成果將進(jìn)一步闡明運(yùn)動性自噬是維持骨骼肌氧化應(yīng)激穩(wěn)態(tài)的一條重要調(diào)控路徑，增進(jìn)對骨骼肌顯型適應(yīng)調(diào)控機(jī)制的進(jìn)一步認(rèn)識，還有可能為鞏固和優(yōu)化骨骼肌質(zhì)量及其功能的分子機(jī)制提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗動物與分組

4周齡清潔級健康雄性ICR（Institute for Cancer Research）小鼠30只，體重25.17± 2.46 g，購自上海斯萊克動物實(shí)驗中心，生產(chǎn)許可證號為：SCXK（滬）2007-0005，使用許可證：SYXK（滬）2004-0001。小鼠常規(guī)分籠（5只/籠），國家標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類動物常規(guī)飼料（上海斯萊克動物實(shí)驗中心提供）飼養(yǎng)、自由飲水、飲食，室溫為20℃～23℃，相對濕度為50%～70%，光照12 h/天，更換墊料2～3次/周，保持通風(fēng)。ICR小鼠專用飼料和墊料均由上海生工生物技術(shù)有限公司提供。小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3天后，隨機(jī)分為安靜對照組（C組，n=6）和運(yùn)動組（n=24），運(yùn)動組小鼠進(jìn)行一次性力竭跑臺運(yùn)動，運(yùn)動力竭后再次分為運(yùn)動后即刻組0 h（n=6）、6 h組（n=6）、12 h組（n=6）和24 h組（n=6）。

1.2 運(yùn)動方案

運(yùn)動組小鼠進(jìn)行適應(yīng)性跑臺訓(xùn)練3天，坡度為0℃，速度為15 m/min，持續(xù)30 min/day。正式運(yùn)動參照Bedford根據(jù)鼠體重/攝氧量回歸方程所建立的遞增運(yùn)動負(fù)荷訓(xùn)練方案[8]，按以下程序運(yùn)動：第1級負(fù)荷：0°，8.2 m/min（相當(dāng)于53%VO2max），15 min；第2級負(fù)荷：5°，15 m/min（相當(dāng)于64%VO2max），15min；第 3級負(fù)荷：10°，19.3 m/min（相當(dāng)于 76%VO2max）運(yùn)動至力竭。運(yùn)動時使用毛刷刺激，使動物保持在跑道前1/3處，以保證運(yùn)動強(qiáng)度。待小鼠持續(xù)運(yùn)動至不能堅持原跑速，刺激驅(qū)趕無效，停跑后體征表現(xiàn)為俯臥位，呼吸急促，神情倦怠，對刺激反應(yīng)遲鈍時，判定為力竭[9]。整個實(shí)驗過程中每只小鼠跑的力竭時間被記錄，平均力竭時間為173.83±13.75 min。

1.3 取材

安靜對照組在安靜狀態(tài)、運(yùn)動組于運(yùn)動后對應(yīng)時間點(diǎn)頸椎脫臼處死小鼠，迅速取左側(cè)腓腸肌稱重，用于生化測試，右側(cè)腓腸肌切分若干份裝入已標(biāo)記好的凍存管，迅速置于液氮中，然后轉(zhuǎn)到－80℃冰箱保存，用于檢測轉(zhuǎn)錄基因表達(dá)和蛋白表達(dá)。

1.4 生化測定

腓腸肌T-SOD、CuznSOD和MnSOD活性均采用黃嘌呤氧化酶法測定，T-AOC含量采用比色法測定，生化具體操作均嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行，均采用Tecan 2000型酶標(biāo)儀檢測，蛋白定量采用BCA法。

1.5 Real-Time PCRe PCR檢測

冰上取腓腸肌約40 mg采用Invitrogen Trizol法提取總RNA，總RNA的OD260/OD280的比值采用紫外分光光度計檢測并計算選取符合Real-time PCR要求的RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄；逆轉(zhuǎn)錄時取5 μl RNA樣品，配置10 μl的總反應(yīng)體系，使用TOYOBO FSQ101反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成第一鏈cDNA（15℃，5 min；37℃，15 min；85℃，5 min）；以合成的cDNA為模板，以GAPDH為內(nèi)參，在ABI StepOne型實(shí)時熒光定量PCR進(jìn)行熒光定量，反應(yīng)條件為：95℃15 s，61℃30 s，72℃45 s，40個PCR循環(huán)。PCR儀給出各反應(yīng)孔的Ct值，以GAPDH為內(nèi)參，根據(jù)公式2-ΔΔCt計算各樣品目的基因的相對表達(dá)量，其中ΔΔCt=（Ct實(shí)驗組目的基因－Ct實(shí)驗組內(nèi)參基因）－（Ct對照組組目的基因－Ct對照組內(nèi)參基因）。熒光染料為TOYOBO QPK201 SYBR GREEN，實(shí)驗所用引物均參照GeneBank數(shù)據(jù)庫，由上海生物工程有限公司設(shè)計并合成。

1.6 Western Blot Blot檢測

取腓腸肌約50 mg冰上剪碎入研磨管中，按照Beyotime P0013 Western及IP裂解液說明書加入0.5 ml裂解液（含1mM PMSF），OMINI Bead Ruptor 24 型磁珠勻漿機(jī)勻漿，14000 g離心15 min，上清轉(zhuǎn)入離心管，BCA法測定蛋白濃度后蛋白變性。采用10%、12%分離膠電泳，濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜；使用5%脫脂奶粉封閉，一抗（Anti-Beclin1、Anti-Bcl2和Anti-P62稀釋比例分別為1∶1000、1∶200和1∶200，購于美國CST或Santa Cruz公司）4℃孵育12 h，TBST緩沖液清洗后，HRP標(biāo)記二抗室溫孵育2 h，Millipore ECL超敏試劑盒顯影，AlphaFC2型凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行冷光掃膜，使用FluorChem FC2軟件對所捕捉圖像進(jìn)行灰度值分析，內(nèi)參為GAPDH，實(shí)驗所用抗體購于Santa Cruz或CST公司。

表1 各基因引物序列

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

各組檢測數(shù)據(jù)錄入Excel 2013，每組數(shù)據(jù)結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，用GraphPad Prism5軟件進(jìn)行數(shù)理統(tǒng)計和圖生成，組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為顯著性水平，P＜0.01為極顯著性水平。

2 結(jié)果

2.1 運(yùn)動對小鼠腓腸肌自噬相關(guān)因子Beclin1、Bcl2和P62 mRNA表達(dá)的影響

與安靜對照組相比，運(yùn)動后0 h、6 h小鼠腓腸肌Beclin1 mRNA表達(dá)量均出現(xiàn)極顯著升高（P＜0.01），12 h、24 h均未出現(xiàn)顯著升高（P＞0.05，圖1A）；Bcl2 mRNA在運(yùn)動后0 h、6 h、12 h和24 h的表達(dá)量均未出現(xiàn)顯著變化（P＞0.05，圖1B）；P62 mRNA的表達(dá)量在運(yùn)動后24 h出現(xiàn)極顯著升高（P＜0.01），0 h、6 h和12 h均未出現(xiàn)顯著升高（P＞0.05，圖1C）。

圖1 各組小鼠腓腸肌Beclin1 mRNA、Bcl2 mRNA和P62 mRNA表達(dá)量

2.2 運(yùn)動對小鼠腓腸肌自噬相關(guān)因子Beclin1、Bcl2和P62蛋白表達(dá)的影響

與安靜對照組相比，小鼠腓腸肌Beclin1蛋白表達(dá)在運(yùn)動后0 h、6 h、12 h和24 h均未出現(xiàn)顯著變化（P＞0.05，圖2A）；Bcl2蛋白表達(dá)在運(yùn)動后0 h、6 h和12 h出現(xiàn)顯著升高（P＜0.05或P＜0.01），24 h未出現(xiàn)顯著變化（P＞0.05，圖2B）；P62蛋白表達(dá)在運(yùn)動后0 h、12 h和24 h均出現(xiàn)顯著下降（P＜0.05或P＜0.01），6 h未出現(xiàn)顯著變化（P＞0.05，圖2C）。

2.3 運(yùn)動對小鼠腓腸肌T-SOD、CuznSOD、MnSOD活性和T-AOC含量的影響

與安靜對照組相比，小鼠腓腸肌T-SOD活性在運(yùn)動后6 h出現(xiàn)極顯著下降（P＜0.01），0 h、12 h和24 h均未出現(xiàn)顯著變化（P＞0.05，圖3A）；CuznSOD活性在運(yùn)動后0 h顯著增加（P＜0.05），6 h顯著下降（P＜0.05），12 h和24 h均未出現(xiàn)顯著變化（P＞0.05，圖3B）；MnSOD活性在運(yùn)動后0 h出現(xiàn)極顯著升高（P＜0.01），6 h、12 h和24 h均未出現(xiàn)顯著變化（P＞0.05，圖3C）；T-AOC含量在運(yùn)動后6 h、12 h和24 h均出現(xiàn)顯著升高（P＜0.05或P＜0.01），0 h未出現(xiàn)顯著變化（P＞0.05，圖3D）。

圖2 各組小鼠骨骼肌Beclin1、Bcl2和P62蛋白表達(dá)變化

圖3 各組小鼠骨骼肌T-SOD、CuznSOD和MnSOD的活性及T-AOC含量的變化

2.4 自噬相關(guān)因子P62蛋白表達(dá)與小鼠腓腸肌T-AOC含量和CuZnSOD活性的相關(guān)性分析

小鼠腓腸肌P62蛋白表達(dá)與T-AOC含量之間呈負(fù)相關(guān)（r=－0.6239，P＜0.01，圖 4A）；P62蛋白表達(dá)與CuZnSOD活性之間雖然未達(dá)到統(tǒng)計學(xué)差異（r=－0.3379，P=0.0678＞0.05，圖4B），但具有相關(guān)性趨勢。

圖4 小鼠腓腸肌T-AOC含量、CuZnSOD活性與P62蛋白表達(dá)之間的相關(guān)性分析

3 分析與討論

3.1 運(yùn)動對骨骼肌自噬相關(guān)因子Beclin1和P62表達(dá)的影響

自噬在骨骼肌肌纖維分解代謝中的作用引起學(xué)者們的普遍關(guān)注，關(guān)于骨骼肌分解代謝模型（饑餓、缺氧和惡液質(zhì)）的研究發(fā)現(xiàn)，自噬激活同時伴隨著蛋白轉(zhuǎn)換增加[10]。適宜負(fù)荷的運(yùn)動可提高骨骼肌細(xì)胞自噬水平，分析其機(jī)制發(fā)現(xiàn)，自噬除了降解運(yùn)動過程中產(chǎn)生和積累的破損、衰老的細(xì)胞器，還和合成或折疊錯誤的蛋白質(zhì)有關(guān)，從而為肌纖維更新代謝提供一定的能量與合成所需的底物，同時抑制骨骼肌細(xì)胞凋亡和死亡[11]。但關(guān)于骨骼肌運(yùn)動適應(yīng)過程中自噬調(diào)控的分子機(jī)制還不是很清楚。Beclin1（又稱Atg6）在真核細(xì)胞中高度保守，屬于自噬相關(guān)蛋白家族，在自噬體（autophagosome）的形成過程中是必需的。它可介導(dǎo)其它自噬蛋白定位于吞噬泡（phagophore），調(diào)控哺乳動物自噬體的形成與成熟。Beclin1表達(dá)水平上升提示自噬活性增加[12]。而P62位于自噬體，其作用是募集蛋白質(zhì)進(jìn)入自噬體進(jìn)行降解，P62水平下降提示自噬活性增加，而P62積累提示自噬缺陷[13]。Jeong等[14]研究發(fā)現(xiàn)，耐力游泳運(yùn)動明顯增加小鼠骨骼肌Beclin1蛋白表達(dá)，明顯降低P62蛋白表達(dá)。Hecongcong[15]研究發(fā)現(xiàn)，一次性力竭跑臺運(yùn)動明顯降低小鼠骨骼肌P62蛋白表達(dá)。Vitor等[16]研究發(fā)現(xiàn)，耐力轉(zhuǎn)輪運(yùn)動顯著增加小鼠骨骼肌Beclin1蛋白表達(dá)，并顯著降低P62蛋白表達(dá)，提示運(yùn)動可有效增加骨骼肌自噬水平以維持骨骼肌收縮活動和新陳代謝所需。

本研究發(fā)現(xiàn)，一次性力竭跑臺運(yùn)動后0 h和6 h小鼠骨骼肌Beclin1 mRNA轉(zhuǎn)錄水平顯著提高，0 h、12 h和24 h P62蛋白表達(dá)顯著降低，提示運(yùn)動引起的Beclin1 mRNA表達(dá)增加反應(yīng)早，但延續(xù)時間相對短，而P62蛋白表達(dá)下調(diào)反應(yīng)早且延續(xù)的時間相對長。因此Beclin1 mRNA和P62蛋白表達(dá)可以同時作為一次性力竭運(yùn)動后早期自噬反應(yīng)的敏感性指標(biāo)；P62蛋白表達(dá)還可以作為一次性力竭運(yùn)動后延遲性自噬反應(yīng)的敏感性指標(biāo)。這些結(jié)果提示不同的自噬指標(biāo)對一次性力竭運(yùn)動后的不同時程敏感性是不同的，故選擇合適地能夠反映自噬的指標(biāo)非常重要。本實(shí)驗中Beclin1 mRNA和P62蛋白表達(dá)的變化提示一次性力竭跑臺運(yùn)動可激活骨骼肌自噬，是骨骼肌自噬強(qiáng)有力的誘導(dǎo)劑，這與先前的研究結(jié)果報道一致。但文獻(xiàn)中也有相反的報道，Kim等[17]研究發(fā)現(xiàn)，一次性力竭運(yùn)動顯著降低小鼠骨骼肌Beclin1蛋白表達(dá)，提示一次性力竭運(yùn)動也可能減弱骨骼肌自噬信號途徑。造成上述研究結(jié)果不一致的原因可能如下：第一，運(yùn)動過程中能量消耗的不同（不同實(shí)驗中的運(yùn)動強(qiáng)度和運(yùn)動持續(xù)時間均不同）可能決定自噬的活性。腺苷酸活化蛋白激酶（AMP activated protein kinase，AMPK）是能量狀態(tài)的敏感感受器，也是細(xì)胞自噬的重要激活因子。如果運(yùn)動使骨骼肌肌纖維內(nèi)AMP/ATP比值顯著增加，則可激活其下游信號分子AMPK，后者可通過磷酸化Raptor的Ser722/Ser792位點(diǎn)或磷酸化TSC2 Thr1227/Ser1345位點(diǎn)抑制mTOR，誘導(dǎo)細(xì)胞自噬。但如果運(yùn)動時能量消耗是暫時的且儲存在細(xì)胞中的能源物質(zhì)沒有耗盡時，自噬有可能不被激活，甚至降低[18]。故不同能量消耗可引起不同的自噬反應(yīng)。第二，運(yùn)動前肌糖原含量不同，自噬反應(yīng)可能也不同。已有研究發(fā)現(xiàn)，運(yùn)動前肌糖原含量與AMPK活性呈負(fù)相關(guān)[19]。第三，自噬變化可能與不同肌纖維類型、處死時間、樣本的收集、飲食和年齡等內(nèi)在和外在因素有關(guān)系[20]。

本研究發(fā)現(xiàn)一次性力竭運(yùn)動后24 h骨骼肌P62 mRNA表達(dá)增加，與Tam等[21]的研究結(jié)果一致，但蛋白表達(dá)明顯下降。分析其原因可能是在自噬的降解階段，P62基因在轉(zhuǎn)錄延長階段消耗了一部分（降解增加），其目的是為了避免自噬相關(guān)因子耗盡[22]；也有可能P62的作用除了作為自噬適應(yīng)物之外，還有其他的生物學(xué)作用，包括在Ras/Raf/MAPK和NF-κB通路、氧化應(yīng)激和腫瘤生成等信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中發(fā)揮作用[23]。

本研究還發(fā)現(xiàn)，一次性力竭運(yùn)動并沒有使骨骼肌Beclin1蛋白表達(dá)發(fā)生顯著變化，與Jamart[24]的研究結(jié)果一致。后者研究發(fā)現(xiàn)，禁食并沒有引起B(yǎng)eclin1蛋白表達(dá)的變化。同樣，Tam[21]發(fā)現(xiàn)禁食后的耐力運(yùn)動并沒有導(dǎo)致骨骼肌Beclin1蛋白表達(dá)發(fā)生變化。運(yùn)動性骨骼肌自噬的變化可能與禁食時誘導(dǎo)的自噬一致。分析Beclin1 mRNA表達(dá)增加而蛋白表達(dá)不增加的原因可能如下：其一，蛋白表達(dá)水平的變化與轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控、翻譯及翻譯后水平調(diào)控及蛋白質(zhì)降解等均有關(guān)系；其二，蛋白的表達(dá)不一定與它相對應(yīng)的mRNA水平呈現(xiàn)同步表達(dá)[25]。已有人對同一基因的蛋白表達(dá)與mRNA表達(dá)是否一致做了相關(guān)性研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相關(guān)系數(shù)為0.46～0.68[26]，但其具體分子機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。

3.2 運(yùn)動激活自噬相關(guān)因子Bcl2和P62對骨骼肌抗氧化防御功能的影響

B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2（Bcl2，B cell lymphoma/leukemia-2）是一種含有多個BH結(jié)構(gòu)域的抗凋亡蛋白。有研究發(fā)現(xiàn)，它在調(diào)控細(xì)胞自噬過程中具有重要作用，通過與Beclin1的BH3結(jié)構(gòu)域結(jié)合形成復(fù)合物，抑制Beclin1誘導(dǎo)細(xì)胞自噬。在哺乳動物細(xì)胞中，Bcl2與Beclin1的分離對于自噬的誘導(dǎo)至關(guān)重要[27]。Hecongcong[15]使用免疫沉淀反應(yīng)研究發(fā)現(xiàn)運(yùn)動15分鐘Bcl2與Beclin1復(fù)合物明顯下降，運(yùn)動30分鐘，其復(fù)合物基本檢測不到。

有研究發(fā)現(xiàn)，Bcl2還可通過多種機(jī)制調(diào)控細(xì)胞抗氧化防御系統(tǒng)[28]。Veis[29]的研究發(fā)現(xiàn)，Bcl2基因敲除小鼠的抗氧化防御功能存在缺陷。Kane等[30]研究發(fā)現(xiàn)，Bcl2過表達(dá)提高細(xì)胞中谷胱甘肽（GSH）含量。Merad[31]采用過表達(dá)技術(shù)上調(diào)細(xì)胞中Bcl2蛋白的表達(dá)，以模擬SOD過表達(dá)的效應(yīng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Bcl2與SOD具有正相關(guān)關(guān)系。本實(shí)驗研究發(fā)現(xiàn)，一次性力竭運(yùn)動后0 h、6 h和12 h骨骼肌Bcl2蛋白表達(dá)明顯增加，提示運(yùn)動引起的Bcl2蛋白表達(dá)增加反應(yīng)早且延續(xù)時間相對長，它也可作為一次性力竭運(yùn)動后即刻且延遲到運(yùn)動后12 h自噬反應(yīng)的敏感性指標(biāo)。同時0 h骨骼肌MnSOD、CuznSOD活性均顯著增加，6 h、12 h和24 h骨骼肌TAOC含量也顯著增加，Bcl2蛋白表達(dá)的增加趨勢基本與骨骼肌抗氧化防御功能增加的趨勢一致，上述研究結(jié)果提示：當(dāng)主要位于線粒體膜的Bcl2蛋白表達(dá)增加時，MnSOD和CuznSOD活性增加，骨骼肌總T-AOC含量也明顯增加，這樣可以降低細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）的水平，阻止氧化應(yīng)激的細(xì)胞損傷[28]。Bcl-2還能夠與GSH結(jié)合，清除線粒體氧化呼吸鏈上漏出的超氧陰離子等ROS[32]。有研究發(fā)現(xiàn)Bcl-2能夠影響細(xì)胞色素C氧化酶Ⅳ（COXⅣ）的活性進(jìn)而影響電子呼吸鏈的功能及線粒體超氧陰離子的水平[28]，同時，本研究還發(fā)現(xiàn)，P62蛋白表達(dá)與骨骼肌T-AOC含量呈相關(guān)性，提示激活自噬相關(guān)因子Bcl2和P62的蛋白表達(dá)與骨骼肌抗氧化防御功能有關(guān)，其過程可能與Bcl2和P62的蛋白表達(dá)的、時間點(diǎn)活化有關(guān)，因此，Bcl2和P62或共同調(diào)控和增強(qiáng)骨骼肌的抗氧化防御功能，然而具體生物學(xué)分子機(jī)制仍需要進(jìn)一步研究。

本實(shí)驗研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，一次性力竭運(yùn)動并沒有引起骨骼肌Bcl2 mRNA表達(dá)變化，但Bcl2蛋白表達(dá)增加，分析原因：其一，可能與mRNA的產(chǎn)生效率有關(guān)。通常情況下，mRNA的產(chǎn)生效率遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于蛋白質(zhì)，某一給定的mRNA每小時只能復(fù)制2次，但同樣時間可以拷貝數(shù)十個相應(yīng)的蛋白；其二，mRNA穩(wěn)定性差，mRNA半衰期通常是2.6～7 h，而蛋白是46 h[33]。也有不同的報道，發(fā)現(xiàn)一次性力竭游泳運(yùn)動使小鼠骨骼肌Bcl2 mRNA表達(dá)下降，可能是由于不同的運(yùn)動方式、不同的運(yùn)動強(qiáng)度與運(yùn)動時間導(dǎo)致小鼠骨骼肌Bcl2轉(zhuǎn)錄基因表達(dá)產(chǎn)生不同的反應(yīng)[34]。

綜上所述，Bcl2和P62在自噬過程中可能起著關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用，在骨骼肌抗氧化防御功能中也有重要作用，提示自噬和抗氧化防御系統(tǒng)之間存在著復(fù)雜的聯(lián)系。關(guān)于運(yùn)動、Bcl2、P62和抗氧化防御功能的確切分子機(jī)制，還需要進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

一次性力竭跑臺運(yùn)動可明顯激活骨骼肌自噬相關(guān)因子Beclin1 mRNA和P62蛋白的表達(dá)，可適度提高自噬，但不同自噬指標(biāo)對運(yùn)動的敏感時程性不同，且激活后活性延遲的時間不同；一次性力竭運(yùn)動可增強(qiáng)骨骼肌抗氧化防御功能，骨骼肌抗氧化防御功能的增加與自噬相關(guān)因子P62蛋白的表達(dá)具有相關(guān)性。