藍(lán)莓枝枯病病原菌生物學(xué)特性及室內(nèi)藥劑篩選

曾爾玲，任春光，桑維鈞，江 艷，丁 宜

(1.貴州大學(xué)農(nóng)學(xué)院，貴州貴陽(yáng) 520025； 2.貴州省生物研究所，貴州貴陽(yáng) 550009； 3.貴州省麻江藍(lán)莓產(chǎn)業(yè)工程技術(shù)中心，貴州麻江 557602)

藍(lán)莓又稱越橘，屬杜鵑花科越橘屬植物，是具有較高經(jīng)濟(jì)價(jià)值和廣闊開發(fā)前景的新興果樹樹種[1]。藍(lán)莓果實(shí)營(yíng)養(yǎng)價(jià)值很高，除含有一般的果糖、維生素外，還富含抗氧化成分、花青素、黃酮素等物質(zhì)[2-6]。藍(lán)莓具有抗氧化活性、解除眼睛疲勞、改善視力、增強(qiáng)記憶力、抗癌等作用，在國(guó)內(nèi)外極受歡迎，并已被國(guó)際糧農(nóng)組織列為人類五大健康食品之一[7-8]。目前已有關(guān)于藍(lán)莓枝枯病的報(bào)道，如趙洪海等報(bào)道棒狀擬盤多毛孢菌(Pestalotiopsisclavispora)可引起藍(lán)莓枝枯病[1]，金義蘭等報(bào)道擬莖點(diǎn)霉屬(Phmopsissp.)可引起藍(lán)莓枝枯病[5]，余磊等報(bào)道小新殼梭孢菌(Neofusicoccumparvum)可引起藍(lán)莓枝枯病[9]，徐成楠等報(bào)道葡萄座腔菌(Botryosphaeriadothidea)可引起藍(lán)莓枝枯病[10]，宮燕偉等報(bào)道假可可毛色二胞菌(Lasiodiplodiapseudotheobromae)可引起藍(lán)莓枝枯病[11]。由此可知，藍(lán)莓枝枯病可由多種病原菌引起。貴州省已有不少地區(qū)種植藍(lán)莓，近年來(lái)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，貴州省的藍(lán)莓基地常有病害發(fā)生，如藍(lán)莓枝枯病的發(fā)生相當(dāng)嚴(yán)重，造成植株頂芽枯死現(xiàn)象，對(duì)藍(lán)莓的生產(chǎn)造成較大的影響[12]。為了有效防治該病的發(fā)生和危害，筆者在病區(qū)實(shí)地調(diào)查，對(duì)病原菌的生物學(xué)特性進(jìn)行初步研究，并進(jìn)行殺菌劑抑菌試驗(yàn)，以期篩選出有效的殺菌劑，為生產(chǎn)中藍(lán)莓枝枯病的綜合防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病原菌的分離與鑒定

1.1.1 病原菌的分離 2017年5月從貴州省貴陽(yáng)市花溪區(qū)馬鈴鄉(xiāng)藍(lán)莓基地采集病害標(biāo)本，在貴州大學(xué)植物病理學(xué)實(shí)驗(yàn)室于PDA培養(yǎng)基上用常規(guī)組織分離法進(jìn)行分離培養(yǎng)[13]，在枝梢病部和健康組織交界處剪下5 mm2的組織，放入75%乙醇中消毒10 s，再用無(wú)菌水漂洗3次，轉(zhuǎn)至PDA培養(yǎng)基中于25 ℃恒溫箱中培養(yǎng)8 d后，觀察記錄菌落的形狀、顏色，并在光學(xué)電子顯微鏡下觀察分生孢子盤、分生孢子的形態(tài)并拍照。

1.1.2 病原菌形態(tài)鑒定 參照魏景超等的方法[14-16]，結(jié)合田間新鮮病枝和PDA培養(yǎng)基上病原菌的菌落形態(tài)和顏色，鏡檢和描述病原菌的分生孢子盤、分生孢子的形態(tài)特點(diǎn)，并進(jìn)行形態(tài)鑒定。

1.1.3 病原菌的致病力測(cè)定 用75%乙醇對(duì)健康、未接觸過(guò)藥劑的藍(lán)莓枝條進(jìn)行表面消毒，再用無(wú)菌水沖洗3遍后備用。再將分離純化的菌株用培養(yǎng)皿培養(yǎng)成完整菌落，然后用打孔器打成內(nèi)徑為0.5 cm的菌餅，接種于健康藍(lán)莓枝條的枝條和葉片上，保濕培養(yǎng)，每3 d觀察1次發(fā)病情況。每個(gè)處理3次重復(fù)，并以清水作對(duì)照。

1.1.4 病原菌分子學(xué)鑒定 將菌株接種于PDA培養(yǎng)基中，于25 ℃恒溫箱中培養(yǎng)6 d后，收集菌絲體用于DNA的提取。DNA提取方法采用CATB法。選取真菌rDNA-ITS通用引物ITS1和ITS4，對(duì)病原菌基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，由貴州鑫瓏生物科技有限公司進(jìn)行純化和測(cè)序，測(cè)序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行Blast比對(duì)分析[17]。

1.2 病原菌的生物學(xué)特征研究

1.2.1 溫度對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響 將病原菌接種在PDA培養(yǎng)基上于25 ℃恒溫箱中培養(yǎng)6 d，用打孔器取直徑為0.5 cm的菌餅置于PDA平板上，于不同溫度(5、10、15、20、25、30、35、40 ℃)下恒溫培養(yǎng)5 d后，用十字交叉法測(cè)量菌落直徑。每個(gè)處理設(shè)3次重復(fù)。

1.2.2 光照對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響 將直徑為0.5 cm的菌餅移至PDA平板上，分別在光照、光暗交替、黑暗條件下 25 ℃ 恒溫培養(yǎng)5 d后，用十字交叉法測(cè)量菌落直徑。每個(gè)處理3次重復(fù)。

1.2.3 不同碳源、氮源對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響 將直徑為 0.5 cm 的菌餅移至分別以葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、麥芽糖為碳源，以尿素、硝酸銨、酵母膏、牛肉膏為氮源的查氏培養(yǎng)基上，于25 ℃恒溫箱中培養(yǎng)6 d，用十字交叉法測(cè)量菌落直徑。每個(gè)處理3次重復(fù)。

1.3 室內(nèi)藥劑篩選試驗(yàn)

將待測(cè)菌株接種在PDA平板上25 ℃恒溫培養(yǎng)6 d。把供試殺菌劑(表1)稀釋不同倍數(shù)，各藥劑分別與PDA培養(yǎng)基按1 ∶9混合均勻后倒入滅菌的培養(yǎng)皿中，制成系列濃度梯度的含藥培養(yǎng)基。把已培養(yǎng)好的菌株用5 mm打孔器打成菌餅，移到含有藥劑的PDA平板上，以加入無(wú)菌水的平板為CK，每個(gè)處理3次重復(fù)，培養(yǎng)6 d后測(cè)量菌落直徑，計(jì)算抑菌率。計(jì)算公式[18]為抑菌率=[(對(duì)照菌落直徑-0.5 cm)-(處理菌落直徑-0.5 cm)]/(對(duì)照菌落直徑-0.5 cm)×100%。

表1 殺菌劑種類及稀釋倍數(shù)

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌形態(tài)

健康藍(lán)莓葉片和枝條接種3 d后出現(xiàn)病斑(圖1)。經(jīng)分離純化，從具典型癥狀的藍(lán)莓枝條枝梢獲得的菌株在PDA培養(yǎng)基上25 ℃恒溫箱中培養(yǎng)6 d后，菌落直徑達(dá)到58 mm，菌落呈白色，背面乳白色至淡黃色，10 d后菌落上出現(xiàn)黑色分生孢子盤，其上產(chǎn)生黑色黏液。產(chǎn)孢細(xì)胞無(wú)色透明，圓棒狀，分生抱子呈紡錘形，直立或稍彎曲，具4個(gè)隔膜，5個(gè)細(xì)胞，頂細(xì)胞呈倒錐形，無(wú)色，長(zhǎng)3.1～5.0 μm；基部細(xì)胞呈倒錐形，無(wú)色，長(zhǎng)4.7～5.3 μm；自頂端起第2、第3個(gè)細(xì)胞為暗褐色，第4個(gè)細(xì)胞為淡褐色，長(zhǎng)15.1～15.5 μm，寬4.8～5.6 μm；頂端附屬絲2～3根，長(zhǎng)7.5～14.3 μm；基部附屬絲1根，長(zhǎng)4.3～6.2 μm(圖2)。根據(jù)以上形態(tài)學(xué)特征初步鑒定該菌為擬盤多毛孢屬真菌。

2.2 病原菌分子學(xué)鑒定

將病原菌菌株進(jìn)行DNA提取，用通用引物ITS1、ITS4進(jìn)行PCR擴(kuò)增測(cè)序，該菌株的序列經(jīng)比對(duì)后與韋斯梅擬盤多毛孢菌(Pestalotiopsisvismiae)序列的相似性為99%。結(jié)合形態(tài)學(xué)鑒定的結(jié)果，將該菌株確定為韋斯梅擬盤多毛孢菌。

2.3 病原菌生物學(xué)特性

2.3.1 溫度對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響 由表2可知，韋斯梅擬盤多毛孢菌菌絲在5～30 ℃條件下均能生長(zhǎng)，20 ℃時(shí)生長(zhǎng)較快，25 ℃時(shí)菌絲生長(zhǎng)最快且最濃密，在5、10 ℃時(shí)菌絲生長(zhǎng)緩慢且稀疏，35 ℃時(shí)菌絲幾乎不生長(zhǎng)。由此可見，藍(lán)莓?dāng)M盤多毛孢枝枯病病原菌菌絲的較適生長(zhǎng)溫度范圍為 20～25 ℃。

2.3.2 光照對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響 研究結(jié)果表明，藍(lán)莓?dāng)M盤多毛孢枝枯病病菌在全黑暗條件下培養(yǎng)的菌絲生長(zhǎng)速度最快，其次是全光照條件，光暗交替條件下最差。

注：同列數(shù)據(jù)后小寫字母不同代表差異顯著(P<0.05)。表3、表4同。

2.3.3 不同碳源、氮源對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響 由表3可知，供試的4種碳源都能被病原菌利用，但在不同碳源條件下菌絲生長(zhǎng)有差異，病原菌在以蔗糖為碳源條件下菌絲生長(zhǎng)最快，其次分別是葡萄糖、可溶性淀粉、麥芽糖，它們之間無(wú)顯著性差異，且以麥芽糖為碳源的培養(yǎng)基上菌絲生長(zhǎng)最慢。由此可見，培養(yǎng)藍(lán)莓?dāng)M盤多毛孢枝枯病病原菌的最佳碳源為蔗糖。

表3 不同碳源對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響

注：+++表示菌絲濃密；++表示菌絲較密；+表示菌絲稀疏。表4同。

由表4可知，在4種供試的氮源中，以酵母膏為氮源時(shí)菌絲生長(zhǎng)最快，其次分別是牛肉膏、硝酸銨，在以尿素為氮源條件下菌絲生長(zhǎng)速度最慢。由此可見，藍(lán)莓?dāng)M盤多毛孢枝枯病病菌培養(yǎng)的最佳氮源為酵母膏。

表4 不同氮源對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響

2.4 不同藥劑對(duì)藍(lán)莓枝枯病病菌菌絲生長(zhǎng)的抑制作用

由表5可知，在試驗(yàn)濃度下，6種殺菌劑對(duì)藍(lán)莓?dāng)M盤多毛孢枝枯病病菌菌絲生長(zhǎng)均有不同程度的抑制效果，其抑菌效果表現(xiàn)為400 g/L氟硅唑乳油>10%苯醚甲環(huán)唑水分散粒劑>木霉菌2億活孢子/g可濕性粉劑>25%溴菌腈乳油>75%百菌清可濕性粉劑>20%丁香菌酯懸浮劑。

由表6可知，6種藥劑對(duì)藍(lán)莓枝枯病菌的室內(nèi)毒力測(cè)定，其EC50表現(xiàn)為400 g/L氟硅唑乳油<10%苯醚甲環(huán)唑水分散粒劑<木霉菌2億活孢子/g(可濕性粉劑)<25%溴菌腈乳油<75%百菌清可濕性粉劑<20%丁香菌酯懸浮劑。

表5 不同殺菌劑的室內(nèi)抑菌作用

表6 6種殺菌劑對(duì)藍(lán)莓?dāng)M盤多毛孢枝枯病菌菌絲生長(zhǎng)的回歸方程及EC50

3 結(jié)論與討論

藍(lán)莓枝枯病是藍(lán)莓生產(chǎn)上較為嚴(yán)重的病害之一，嚴(yán)重時(shí)可以引起藍(lán)莓整株枯萎，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。藍(lán)莓枝枯病可由單一的病原菌引起，也可由多種病原菌綜合引起[19]。韋斯梅擬盤多毛孢菌(Pestalotiopsisvismiae)只是引起藍(lán)莓枝枯病的病原菌之一，該病原菌屬于半知菌亞門真菌，目前對(duì)該病原菌的生物學(xué)特性和藥劑篩選的相關(guān)研究較少，且未見用生物源殺菌劑來(lái)防治藍(lán)莓枝枯病。本試驗(yàn)選用幾種化學(xué)殺菌劑和新型的生物源殺菌劑對(duì)該病原菌進(jìn)行了試驗(yàn)研究。

從貴州省貴陽(yáng)市花溪區(qū)馬鈴鄉(xiāng)藍(lán)莓基地采集的標(biāo)本中，成功分離篩選出了藍(lán)莓枝枯病的致病菌，形態(tài)鑒定和分子鑒定結(jié)果表明，藍(lán)莓枝枯病病原菌菌株與韋斯梅擬盤多毛孢具有高度同源性(99%)，初步鑒定為韋斯梅擬盤多毛孢。本試驗(yàn)對(duì)引起藍(lán)莓枝枯病的病原菌進(jìn)行了生物學(xué)特性研究，研究發(fā)現(xiàn)，溫度對(duì)藍(lán)莓枝枯病病菌菌絲的生長(zhǎng)影響較大，在5～30 ℃ 內(nèi)菌絲都能生長(zhǎng)，但最適生長(zhǎng)溫度為20～25 ℃；碳源和氮源分別以蔗糖和酵母膏為宜；光照對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響不大。

本試驗(yàn)選用6種藥劑對(duì)藍(lán)莓枝枯病菌的室內(nèi)毒力進(jìn)行測(cè)定，EC50是藥物安全性指標(biāo)，旨在說(shuō)明所選藥劑防治藍(lán)莓枝枯病的效果，該值越小說(shuō)明藥劑效果越好，EC50表現(xiàn)為 400 g/L 氟硅唑乳油<10%苯醚甲環(huán)唑水分散粒劑<木霉菌2億活孢子/g可濕性粉劑<25%溴菌腈乳油<75%百菌清可濕性粉劑<20%丁香菌酯懸浮劑。400 g/L氟硅唑乳油效果最好，其EC50為0.002 5 g/L；10%苯醚甲環(huán)唑水分散粒劑、木霉菌2億活孢子/g可濕性粉劑、25%溴菌腈乳油、75%百菌清可濕性粉劑的效果次之，其EC50分別為0.023 8、0.040 9、0.070 1、0.105 2 g/L；20%丁香菌酯懸浮劑的效果最差，其EC50為1.050 7 g/L。因此，在生產(chǎn)上可以采用新型的生物源殺菌劑來(lái)防治此類病害，達(dá)到綠色、安全的理念。本試驗(yàn)尚未進(jìn)行田間試驗(yàn)，室內(nèi)藥劑篩選試驗(yàn)所得到的結(jié)果具有一定的局限性，對(duì)病害的控制效果最終還須要經(jīng)過(guò)田間試驗(yàn)來(lái)檢驗(yàn)。