大蒜素對硝苯地平致藥物性牙齦增生的干預(yù)作用

謝靜 高云云 朱形好

硝苯地平致藥物性牙齦增生（DGO）是由于長期服用硝苯地平引起的牙齦纖維數(shù)量增多和體積增大，為臨床常見的牙周疾病，致病率為15%～85%，國內(nèi)有報道為20.8%［1］。研究顯示大蒜素具有抗纖維化作用，可抑制成纖維細胞增殖、減少膠原分泌。既往研究發(fā)現(xiàn)將大蒜素作用于體外培養(yǎng)的人牙齦成纖維細胞，顯示其對Ⅰ型膠原的合成及分泌有抑制作用，提示大蒜素有抗牙齦纖維化作用［2］。而轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGF-β1）是致纖維化過程中的重要因子［3-4］。2015年5月至2016年10月作者通過實驗研究探討大蒜素對硝苯地平致DGO患者牙齦成纖維細胞（HGFs）I型膠原分泌與轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGF-β1）蛋白表達的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 （1）主要試劑：大蒜素注射液：山東魯抗辰欣藥業(yè)有限公司。抗波形絲蛋白抗體、角蛋白抗體、SABC試劑盒、人Ⅰ型膠原、TGF-β1ELISA試劑盒：武漢博士德公司。MTT、DMSO：Sigma公司。高糖型DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶：美國Gibco公司。ELX800酶標儀：美國Bio-Tek公司。（2）樣本來源：經(jīng)患者同意，選取本院經(jīng)牙周情況評價牙齦增生（gingival overgrowth，GO）指數(shù)分別為1級、2級、3級的硝苯地平致DGO患者各1例。3例患者年齡50～60歲，規(guī)則服用硝苯地平片2～6年，無糖尿病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等其他全身性疾病史，6個月內(nèi)未進行牙周治療。（GO指數(shù)使用Pernu等的標準［5］：0：無牙齦增生；1：牙齦邊緣輕度增厚或表面有明顯的顆粒和肉芽；2：增生的牙齦達到牙冠的1/2；3：增生的牙齦覆蓋牙冠的2/3，影響整個附著齦。）經(jīng)牙周基礎(chǔ)治療后行齦切術(shù)，收集各例切除的增生牙齦組織分別用于實驗。

1.2 方法 （1）細胞培養(yǎng)：采用組織塊貼壁法對增生牙齦成纖維細胞進行原代培養(yǎng)，抗波形絲蛋白、角蛋白染色法進行細胞鑒定，酶消化法常規(guī)傳代，取第5代增生牙齦成纖維細胞用于實驗。（2）藥物濃度及分組：MTT法測定細胞活性，依據(jù)大蒜素濃度分為4組：空白對照組（加等量不含大蒜素的培養(yǎng)液）；3μg/ml大蒜素組；6μg/ml大蒜素組；9μg/ml大蒜素組。每孔設(shè)6個復(fù)孔。（3）Ⅰ型膠原、TGF-β1含量測定：取對數(shù)生長期的第5代增生牙齦成纖維細胞，接種于培養(yǎng)皿培養(yǎng)24h，按不同大蒜素濃度分別更換培養(yǎng)基，培養(yǎng)72h，收集培養(yǎng)液用于標本含量測定。操作步驟按ELISA試劑盒說明書進行。酶標儀于450nm處讀取OD值，通過標準曲線獲得待測樣本Ⅰ型膠原、TGF-β1的濃度。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS20.0統(tǒng)計學(xué)軟件。計量資料以（x±s）表示，多組間比較用單因素方差分析，各組間兩兩比較采用Bonferroni檢驗，相同大蒜素濃度時不同增生程度牙齦間（GO=1、GO=2、GO=3）I型膠原含量比較采用協(xié)方差分析。I型膠原抑制率=（1-試驗組I型膠原值/對照組I型膠原值）×100%，TGF-β1抑制率 =（1-試驗組 TGF-β1值 /對照組TGF-β1值）×100%。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 GO=1時不同濃度大蒜素對牙齦成纖維細胞分泌I型膠原及TGF-β1的影響 GO=1時不同濃度大蒜素對藥物增生牙齦成纖維細胞分泌I型膠原、TGF-β1有抑制作用（見表1）。采用Pearson相關(guān)分析法計算GO=1時I型膠原與TGF-β1的相關(guān)系數(shù)r=0.561（P=0.004）。

表1 GO=1時不同濃度大蒜素對牙齦成纖維細胞分泌I型膠原及TGF-β1的影響（x±s）

2.2 GO=2時不同濃度大蒜素對藥物增生牙齦成纖維細胞分泌I型膠原、TGF-β1的影響 采用Pearson相關(guān)分析法計算GO=2時I型膠原與TGF-β1的相關(guān)系數(shù) r=0.823（P=0.000）。見表 2。

表2 GO=2時不同濃度大蒜素對牙齦成纖維細胞分泌I型膠原及TGF-β1的影響（x±s）

2.3 GO=3時不同濃度大蒜素對藥物增生牙齦成纖維細胞分泌I型膠原、TGF-β1的影響 采用Pearson相關(guān)分析法計算GO=3時I型膠原與TGF-β1的相關(guān)系數(shù) r=0.877（P=0.000）。見表 3。

表3 GO=3時不同濃度大蒜素對牙齦成纖維細胞分泌I型膠原及TGF-β1的影響（x±s）

3 討論

牙齦組織中基質(zhì)合成與降解的動態(tài)平衡是維持正常牙齦形態(tài)和結(jié)構(gòu)的重要前提。牙齦增生的發(fā)生發(fā)展使牙周組織喪失這種動態(tài)平衡，細胞外基質(zhì)尤其是I型膠原大量分泌并積聚，使牙周的內(nèi)環(huán)境受到破壞。研究顯示大蒜素有抗纖維化作用，可抑制成纖維細胞的增殖、減少細胞膠原的合成與分泌等［6］。作者既往研究也顯示大蒜素對內(nèi)毒素作用下體外培養(yǎng)的人牙周膜成纖維細胞I型膠原的合成及分泌具有抑制作用［7］。本資料結(jié)果顯示：不同濃度大蒜素對不同嚴重程度患者增生牙齦成纖維細胞的I型膠原的分泌均有抑制作用，且此抑制作用隨大蒜素濃度的提高而愈加明顯，具有劑量依賴效應(yīng)，但兩兩比較結(jié)果顯示各濃度組間的差異并非均有統(tǒng)計學(xué)意義。GO=1時，3μg/ml組與對照組比較（P=1.000）、6μg/ml組與3μg/ml組比較（P=0.077）差異無統(tǒng)計學(xué)意義，提示對于輕度牙齦增生患者而言，低等濃度（3μg/ml）的大蒜素抑制I型膠原分泌的效果不明顯，而中等濃度（6μg/ml）組雖然與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義，但較低等濃度（3μg/ml）組差異無統(tǒng)計學(xué)意義，提示對于輕度牙齦增生，大蒜素的濃度梯度帶來的抑制效果差異不明顯，且需要較高的濃度才可以獲得抑制作用。這一點從各組的抑制率上也有所體現(xiàn)。GO=2時兩兩比較結(jié)果顯示3μg/ml組與6μg/ml組比較（P=0.071）差異無統(tǒng)計學(xué)意義，GO=3時兩兩比較結(jié)果顯示各組間比較結(jié)果差異均由統(tǒng)計學(xué)意義，提示隨著牙齦增生程度的加重，大蒜素的濃度梯度帶來的抑制效果差異也越顯著。針對各濃度組上的基線值而言，牙齦增生越重（即GO指數(shù)越高）的患者，其成纖維細胞分泌的I型膠原越多，結(jié)果具有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.01），不同程度增生牙齦間（GO=1、GO=2、GO=3）兩兩比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。采用協(xié)方差分析法扣除對照組基線差異后分析相同濃度的大蒜素對不同程度牙齦增生患者的I型膠原分泌抑制作用顯示：大蒜素濃度為3μg/ml或6μg/ml時，牙齦增生越嚴重，大蒜素對I型膠原分泌的抑制作用越明顯，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），兩個濃度點上不同程度增生牙齦間兩兩比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），提示低、中等濃度大蒜素對不同程度增生牙齦的I型膠原分泌的抑制作用不同，增生程度越高，抑制作用越顯著；大蒜素濃度為9μg/ml時，大蒜素對不同程度增生牙齦間的抑制作用差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.346），提示高等濃度（9μg/ml）大蒜素對不同程度增生牙齦的I型膠原分泌的抑制作用相似。

大蒜素抑制成纖維細胞膠原分泌的具體機制目前尚不清楚。TGF-β1是重要的致纖維化細胞因子之一［8］，是不同因素所致組織纖維化的共同通路，如TGF-β1/Smades信號通路在纖維化發(fā)生發(fā)展中起重要作用［9］。有研究表明TGF-β1對牙周膜成纖維細胞有較顯著的募集及促增殖作用，并刺激其合成膠原，促使膠原堆積，同時抑制基質(zhì)金屬蛋白酶分泌，從而抑制膠原降解［10-12］。由此可見，TGF-β1在成纖維細胞的趨化和增殖、膠原的合成和降解等過程中可能起到重要的調(diào)控作用。而有學(xué)者指出大蒜提取物可降低肝臟纖維化大鼠血清中TGF-β1水平［13］。本資料在測定各標本I型膠原的同時，也測定TGF-β1的含量。結(jié)果表明，不同濃度大蒜素對不同程度患者增生牙齦成纖維細胞的TGF-β1的分泌也有抑制作用，因此抑制效應(yīng)的變化趨勢與I型膠原的變化趨勢具有相關(guān)性。GO=1時I型膠原與TGF-β1的相關(guān)系數(shù)r=0.561（P=0.004），GO=2 時 r=0.823（P=0.000），GO=3 時r=0.877（P=0.000），提示不同濃度大蒜素作用下，增生程度越高的牙齦I型膠原與TGF-β1相關(guān)性越高。以上研究結(jié)果提示TGF-β1信號傳導(dǎo)通路可能是大蒜素抗纖維化作用的機制之一，但其具體的分子機制有待進一步的研究。