胺碘酮增加α-SMA表達(dá)誘導(dǎo)肺A549細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化機(jī)制研究

陳皓 黃時偉 朱寧 吳悠揚 鄒賀 姜文兵

胺碘酮是預(yù)防及治療惡性室性心律失常的有效藥物，但會產(chǎn)生嚴(yán)重的副作用。既往報道，在胺碘酮治療的患者中，肺毒性發(fā)生率從1%～10%不等，即使是在低劑量情況下［1］。當(dāng)胺碘酮誘導(dǎo)的肺纖維化（AIPF）被明確診斷時，為避免呼吸衰竭，立即停用并盡快降低胺碘酮的血藥濃度及皮質(zhì)醇激素的強(qiáng)化治療被報道是有效的［2］，但在AIPF早期未被確診的患者將死于不可逆轉(zhuǎn)的呼吸衰竭。因此，闡明該機(jī)制并防范AIPF的發(fā)生和發(fā)展至關(guān)重要。本文探討胺碘酮誘導(dǎo)肺泡基底上皮細(xì)胞（A549）上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）的機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料 （1）化學(xué)制品：胺碘酮購自江萊生物科技有限公司（上海）。胎牛血清，胰蛋白酶和Dulbecco改良的Eargle培養(yǎng)基購自Life Technologies（Grand Island，NY，USA）。肺 A549 細(xì)胞購自 ATCC（Rockville，MD，USA）。兔抗α-SMA 抗體購自Abcam（Cambridge，MA，USA）。Alexa Fluor 488和594綴合的抗兔IgG抗 體 購 自 Santa Cruz Biotechnology（Santa Cruz，CA，USA）。（2）細(xì)胞培養(yǎng)物：人肺泡上皮腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549購自中國科學(xué)院（上海）。將A549細(xì)胞在含有10%胎牛血清（FBS），抗生素（100IU / ml青霉素，100μg/ ml鏈霉素）的DMEM的25cm2培養(yǎng)瓶和6孔培養(yǎng)板中在37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱。當(dāng)細(xì)胞達(dá)到80%融合時，用PBS洗滌，然后用0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，從培養(yǎng)瓶中收集細(xì)胞，離心棄上清液，最后懸浮于完全培養(yǎng)基中，接種于塑料培養(yǎng)皿中。對所有實驗，將細(xì)胞傳代培養(yǎng)到6孔板中并維持直至亞匯合（80%），并在添加胺碘酮前將細(xì)胞血清剝奪24h。

1.2 方法 （1）免疫細(xì)胞化學(xué)分析：將A549細(xì)胞在6孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)。為檢測α-SMA，將細(xì)胞在PBS中沖洗，然后在室溫（RT）下在4%多聚甲醛（PFA）中固定15min，用PBS沖洗5min，重復(fù)3次。然后加入含有0.01%Tween-20的10%牛血清白蛋白（BSA）并溫育2h以合并在RT處的非特異性結(jié)合。將細(xì)胞與α-SMA（1：150稀釋）的一級抗體在4℃溫育過夜。第2天用PBS洗滌細(xì)胞。使用的二抗是Alexa Fluor 488或594-綴合的抗 - 兔IgG抗體（稀釋度1：200），在黑暗中溫育2h。最后，將細(xì)胞在PBS中沖洗，并用4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）孵育核染色10min。用配備熒光的相差顯微鏡（Nikon，Japan）拍攝熒光圖像。（2）Northern印跡分析：根據(jù)制造商的說明，使用Trizol試劑從A549細(xì)胞中提取總RNA。通過在260nm處的紫外吸收的分光光度測量來量化RNA。且通過在1.5%瓊脂糖凝膠上可視化28S和18S條帶來證實RNA完整性。使用RT-PCR試劑盒通過逆轉(zhuǎn)錄使用RNA樣品合成cDNA。設(shè)計的引物和已發(fā)表論文的確定引物被用于RT-PCR。用于該分析的α-SMA引物的序列如下：正向：5'-TGGCTGATGGAGTACTTC-3'和 反 向：5'-GATAGAGAAGCCAGGATG-3'。GAPDH被用作內(nèi)部控制。GAPDH引物的序列如下：正向：5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3'和 反 向：5'-AACGGTAGTGTCTTTGTGA-3'。對于RT-PCR反應(yīng)，PCR混合物在20μl終體積的SYBR主混合物（Invitrogen） 中 含 有 cDNA（1μl） 和 引 物（2μl）。94℃反應(yīng)15min，94℃反應(yīng)45s；55℃反應(yīng)48s，72℃反應(yīng)48s，共30個循環(huán)。PCR產(chǎn)物在2.0%瓊脂糖凝膠上運行。所有RT-PCR產(chǎn)物均表達(dá)相對于內(nèi)部對照的基因表達(dá)的百分比變化。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（x±s）表示，采用多因素方差分析，Tukey多重比較檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 免疫細(xì)胞化學(xué)分析肺A549細(xì)胞中α-SMA的表達(dá) 相差顯微鏡觀察A549細(xì)胞形態(tài)為立方形鵝卵石。在A549中微弱觀察到α-SMA（間充質(zhì)標(biāo)記）（見圖1A）。應(yīng)用胺碘酮50μM（見圖1B）、100μM、150μM處理A549 72 h，采用免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測α-SMA的表達(dá)。與對照組比較，細(xì)胞外觀轉(zhuǎn)變成纖維細(xì)胞樣，長而窄，紡錘形形態(tài)，提示α-SMA的高表達(dá)（見圖1C、D）。結(jié)果表明胺碘酮可以誘導(dǎo)A549細(xì)胞中的EMT樣表型。

圖1 胺碘酮誘導(dǎo)的A549細(xì)胞系中α-SMA表達(dá)的劑量依賴性（400×）。將A549細(xì)胞在0．1%FBS培養(yǎng)基中與胺碘酮50μM（圖B），100μM（圖C），150μM（圖D）培育72h。免疫細(xì)胞化學(xué)分析顯示，與對照組（圖A）相比，胺碘酮對A549細(xì)胞的α-SMA表達(dá)呈劑量依賴性增加。隨著胺碘酮劑量的增加，上皮鵝卵石形態(tài)逐漸轉(zhuǎn)變成纖維樣細(xì)胞樣形態(tài)。上皮細(xì)胞標(biāo)志物EMT標(biāo)記α-SMA（綠色：A-D）；細(xì)胞核用DAPI（藍(lán)色）染色

2.2 胺碘酮對A549細(xì)胞EMT標(biāo)志物表達(dá)的劑量依賴性變化 前期研究，A549細(xì)胞表現(xiàn)出對150μM胺碘酮作用72h的EMT，通過顯著增加間充質(zhì)標(biāo)記物α-SMA的表達(dá)，從其上皮表型轉(zhuǎn)變成成纖維細(xì)胞樣形態(tài)。將A549細(xì)胞與50μM，100μM和150μM胺碘酮溫育72h。免疫細(xì)胞化學(xué)分析表明，上皮鵝卵石形態(tài)在一定劑量下逐漸轉(zhuǎn)變成纖維樣細(xì)胞樣形態(tài)。且A549細(xì)胞標(biāo)記物間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物α-SMA增加（見圖 1）。

2.3 實時RT-PCR分析胺碘酮在A549細(xì)胞中表達(dá)EMT標(biāo)志物 見表1、2。

表1 各組α-SMA mRNA不同時間點不同劑量間表達(dá)的比較（x±s）

表2 各組α-SMA不同時間點不同劑量間表達(dá)的比較（x±s）

3 討論

特發(fā)性肺纖維化是以成纖維細(xì)胞和肌成纖維細(xì)胞群和細(xì)胞外基質(zhì)定位擴(kuò)張為特征的致命性肺部疾病。肺纖維化與上皮依賴性成纖維細(xì)胞活化過程有關(guān)。其特征是成纖維細(xì)胞、肌成纖維細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的積累，最終導(dǎo)致肺結(jié)構(gòu)的瘢痕形成和破壞。成纖維細(xì)胞和肌成纖維細(xì)胞灶被認(rèn)為是IPF發(fā)病的中心特征。IPF中成纖維細(xì)胞和肌成纖維細(xì)胞的來源仍不完全清楚。迄今為止，已經(jīng)提出肌成纖維細(xì)胞通過至少三種可能來源積累：駐留的肺成纖維細(xì)胞或間充質(zhì)前體的增殖；骨髓來源的纖維細(xì)胞或循環(huán)祖細(xì)胞轉(zhuǎn)化成成纖維細(xì)胞和上皮 - 間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT），其中肺泡上皮細(xì)胞（AEC）經(jīng)歷向（肌）成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)變［3］。也有文獻(xiàn)表明EMT是IPF中成纖維細(xì)胞和肌成纖維細(xì)胞的重要起源［4］。EMT是上皮細(xì)胞逐漸喪失其上皮功能和特征并轉(zhuǎn)化為獲得間充質(zhì)細(xì)胞特征的間充質(zhì)樣細(xì)胞的過程。在EMT過程中，上皮細(xì)胞失去頂端基底極性，基底膜附著和細(xì)胞 - 細(xì)胞連接，上皮表型逐漸獲得間充質(zhì)標(biāo)志物（α- SMA，波形蛋白，N-鈣粘蛋白）。經(jīng)歷EMT的細(xì)胞導(dǎo)致成纖維細(xì)胞增殖并將成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化成合成和沉積ECM成分的成肌纖維細(xì)胞?，F(xiàn)在越來越多的研究表明（?。┏衫w維細(xì)胞確實可以通過EMT從上皮細(xì)胞衍生出來，并可能導(dǎo)致肺纖維化的發(fā)生［5］。幾項研究報道，一些藥物可以誘導(dǎo)EMT引起肺纖維化，如甲氨喋呤（MTX），博來霉素（BLM）［6-7］。然而，目前還沒有關(guān)于肺泡上皮細(xì)胞是否在AIPF中經(jīng)歷相同EMT的數(shù)據(jù)。

本研究結(jié)果表明，胺碘酮可以通過EMT（肺纖維化的一部分）誘導(dǎo)肺A549細(xì)胞的纖維化反應(yīng)。作者觀察到胺碘酮治療的肺A549細(xì)胞通過EMT的形態(tài)學(xué)改變與特發(fā)性肺纖維化非常相似。從這些發(fā)現(xiàn)中得出結(jié)論，至少在一定程度上，EMT可能在胺碘酮誘導(dǎo)的肺纖維化進(jìn)展中起關(guān)鍵作用。

在過去幾年中，越來越多的證據(jù)表明，IPF可能是由復(fù)發(fā)性肺泡上皮細(xì)胞（AECs）損傷引起的，初始損傷導(dǎo)致AECs的異常活化，并隨之導(dǎo)致形成成纖維細(xì)胞病灶，這被認(rèn)為是纖維化的活性部位［8］。眾所周知，胺碘酮及其代謝物對不同類型的細(xì)胞具有直接和間接毒性［9］。AECs與肺纖維化有關(guān)胺碘酮細(xì)胞毒性的關(guān)系仍不清楚。作者觀察到胺碘酮可引起肺纖維化，并導(dǎo)致肺A549細(xì)胞減少和肌成纖維細(xì)胞增殖。本研究結(jié)果表明胺碘酮誘導(dǎo)上皮細(xì)胞的細(xì)胞毒性和纖維化中的成纖維細(xì)胞的增殖。因此，肺A549細(xì)胞比成纖維細(xì)胞更易受到細(xì)胞損傷。

Willis等在2005年鑒定IPF患者肺組織中常見表達(dá)的上皮標(biāo)志物和α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA），表明細(xì)胞在IPF肺中發(fā)生表型轉(zhuǎn)換并首次描述EMT參與人肺纖維化過程的可能性［10］。在2006年，Kim［11］報道AECs是體內(nèi)成纖維細(xì)胞的祖細(xì)胞，而ECM是纖維形成過程中EMT的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。Xi及其同事指出，美多環(huán)素可通過抑制EMT抑制纖維化，進(jìn)一步支持EMT信號在肺纖維化中的作用［12］。因此，越來越多的證據(jù)表明肺成纖維細(xì)胞和肌成纖維細(xì)胞可能通過EMT從上皮細(xì)胞中獲得。為闡明胺碘酮是否能誘導(dǎo)肺泡上皮細(xì)胞的EMT。經(jīng)胺碘酮刺激后，肺泡上皮細(xì)胞呈纖維狀，長而窄，呈梭形，細(xì)胞間低度接觸。作者觀察到胺碘酮可以通過免疫細(xì)胞化學(xué)分析增加α-SMA的表達(dá)，從而通過EMT誘導(dǎo)肺纖維化。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)α-SMA在肺A549細(xì)胞中的表達(dá)增加具有劑量依賴性和時間依賴性。

總之，胺碘酮通過增加α-SMA表達(dá)誘導(dǎo)肺A549細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，可能是胺碘酮誘發(fā)肺纖維化的重要促纖維化因子。EMT可能是胺碘酮誘導(dǎo)肺纖維化的重要步驟。因此，本研究預(yù)計會產(chǎn)生新的藥物發(fā)現(xiàn)，用于預(yù)防藥物誘導(dǎo)的纖維化，并為尋找仍然未被證實的肺纖維化機(jī)制提供線索。