幾丁質(zhì)酶-3樣蛋白-1在胃癌中的表達(dá)及其臨床意義

司仙科 李煒 張計(jì)訓(xùn) 曹亦軍 楊佳華?

幾丁質(zhì)酶-3樣蛋白-1 （CHI3L1）是存在于植物、昆蟲(chóng)及人類(lèi)機(jī)體中的一種古老家族的蛋白質(zhì)，由巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞分泌。研究表明CHI3L1蛋白水平升高與乳腺癌、腸癌、前列腺癌、肺癌和肝癌等腫瘤的分期、預(yù)后有關(guān)［1］。但CHI3L1蛋白在胃癌細(xì)胞中的表達(dá)及作用機(jī)制目前研究報(bào)道較少。本文探討CHI3L1在胃癌及癌旁組織中的表達(dá)，分析其與胃癌患者臨床病理特征的關(guān)系，分析CHI3L1在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用。

1 臨床資料

1.1 一般資料 收集2007年1月至2011年12月本院接受胃癌根治術(shù)的296例胃癌患者的癌組織標(biāo)本，男160例，女136例，年齡27～93歲，平均年齡（69±12.34）歲。術(shù)前均排除遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，均未接受放療及化療。組織標(biāo)本均在手術(shù)切除后由病理檢查證實(shí)為胃癌，均有完整臨床、病理及隨訪資料。并選取相應(yīng)的距離癌組織邊緣＞5cm的手術(shù)切緣，為癌旁組織，均經(jīng)病理檢查證實(shí)為正常的胃黏膜組織。腫瘤分期采用美國(guó)癌癥聯(lián)合會(huì)2010年第7版胃癌TNM分期標(biāo)準(zhǔn)。隨訪終止時(shí)間為2016年12月31日。

1.2 方法 （1）試劑：鼠抗人CHI3L1單克隆抗體（工作濃度1：100）購(gòu)自英國(guó)Abcam公司，通用型（SP）免疫組化試劑盒購(gòu)自上海鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司。（2）方法：采用鏈霉菌抗生物素蛋白-過(guò)氧化物酶（SP）三步法。切片常規(guī)脫蠟至水化，PBS液洗3次后高壓鍋內(nèi)煮沸8min修復(fù)抗原；滴加3%過(guò)氧化氫，室溫孵育10min，蒸餾水洗3次。滴加正常羊血清封閉液，室溫15min后，傾去血清，滴加CHI3L1單抗，4℃放置過(guò)夜。滴加二抗室溫孵育30min，PBS洗3次DAB顯色；蘇木精復(fù)染；中性樹(shù)脂封片。PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。

1.3 結(jié)果判定 以出現(xiàn)棕黃色或棕色顆粒的細(xì)胞作為陽(yáng)性細(xì)胞。在400倍高倍鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野（每個(gè)視野計(jì)數(shù)的細(xì)胞數(shù)不＜200個(gè)）。陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)＜5%為0分，5%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，＞75%為4分。按著色強(qiáng)度計(jì)分：細(xì)胞無(wú)染色為0分；染色呈淡黃色為1分；呈黃色為2分；呈棕黃色者為3分。2種計(jì)分的乘積即為陽(yáng)性強(qiáng)度：0～2分為陰性，3～12分為陽(yáng)性。由2名病理科醫(yī)師采用雙盲法獨(dú)立閱片。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)；計(jì)量資料以（x±s）表示；生存分析采用Kaplan-Meier法，并進(jìn)行Long-Rank假設(shè)檢驗(yàn)；使用Cox多因素回歸分析CHI3L1及其他病理參數(shù)對(duì)胃癌患者預(yù)后的評(píng)估，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CHI3L1蛋白在胃癌組織中的表達(dá) 免疫組織化學(xué)染色后，可見(jiàn)CHI3L1主要表達(dá)于癌細(xì)胞胞質(zhì)中，呈棕黃色顆粒（見(jiàn)圖1）。根據(jù)陽(yáng)性結(jié)果的判定標(biāo)準(zhǔn)，CHI3L1在胃癌組織中陽(yáng)性表達(dá)率67.90%，在癌旁組織中陽(yáng)性表達(dá)率37.16%，胃癌組織中陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

圖1 胃癌組織和癌旁組織中CHI3L1蛋白的表達(dá)免疫組化SP染色 ×400

2.2 CHI3L1與臨床病理特征的關(guān)系 見(jiàn)表1。

表1 CHI3L1與胃癌臨床病理特征的關(guān)系

2.3 CHI3L1的高表達(dá)與對(duì)患者預(yù)后的影響 采用Kaplan-Meier生存曲線(xiàn)法顯示CHI3L1高表達(dá)組的中位生存期為33個(gè)月，而CHI3L1低表達(dá)組的中位生存時(shí)間為41個(gè)月，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=30.75，P＜0.01）。單因素分析顯示腫瘤的大小、分化程度、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期及CHI3L1的高表達(dá)與胃癌患者的生存期有關(guān)（P＜0.01）。Cox多因素回歸分析顯示胃癌組織中CHI3L1的高表達(dá)、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期是胃癌患者的獨(dú)立預(yù)后因素，而腫瘤的大小及分化程度不是胃癌的獨(dú)立預(yù)后因素，見(jiàn)圖2、表2。

表2 臨床病理特征對(duì)胃癌患者預(yù)后影響

圖2 CHI3L1蛋白的表達(dá)水平與胃癌患者的預(yù)后關(guān)系

3 討論

胃癌是我國(guó)常見(jiàn)的惡性腫瘤，其發(fā)病率與病死率均居各種惡性腫瘤前列。手術(shù)治療是胃癌目前首選的治療方法，術(shù)后聯(lián)合化療可提高胃癌的治療效果，但5年生存率仍比較低［2］。目前認(rèn)為，侵襲和轉(zhuǎn)移是胃癌生物行為中最重要的兩個(gè)特點(diǎn)，也是影響胃癌惡性程度和分期的主要原因［3］。

CHI3L1基因位于1號(hào)染色體q32，基因組結(jié)構(gòu)顯示其由分布于8 kb區(qū)域上的10個(gè)外顯子構(gòu)成，含383個(gè)氨基酸，因?yàn)槠湟粭l肽鏈氨基端的起始3個(gè)氨基酸：酪氨酸、賴(lài)氨酸和亮氨酸的符號(hào)分別為Y、K和L，其相對(duì)分子質(zhì)量約為40000，故又命名為YKL-40［4］。CHI3L1蛋白是結(jié)締組織細(xì)胞的生長(zhǎng)因子，同時(shí)也是內(nèi)皮細(xì)胞間形成粘附和遷移的重要因素［5］。研究表明CHI3L1蛋白水平升高在多種腫瘤的增殖、分化、浸潤(rùn)、侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮重要作用［6-9］。付亮等［10］研究發(fā)現(xiàn)膽囊癌組織中高表達(dá)CHI3L1蛋白，CHI3L1的表達(dá)水平與膽囊癌分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。Libreros等［11］對(duì)乳腺癌的研究中發(fā)現(xiàn)，利用小RNA干擾明顯抑制CHI3L1的表達(dá)，引起CCL2、CXCL2和MMP-9分泌減少，導(dǎo)致腫瘤侵襲能力減弱。Kawada等［12］通過(guò)對(duì)結(jié)腸癌的研究發(fā)現(xiàn)，CHI3L1蛋白可以促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的管腔形成，干擾沉默CHI3L1后，血管內(nèi)皮細(xì)胞管腔的形成受到抑制。

本資料顯示，胃癌組織中的CHI3L1陽(yáng)性率明顯高于正常組織。CHI3L1的高表達(dá)與患者年齡、性別、腫瘤大小及臨床分期無(wú)顯著相關(guān)性，而與組織分化程度、浸潤(rùn)深度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切有關(guān)。Kawada［12］等研究發(fā)現(xiàn)在結(jié)腸癌中CHl3L1蛋白誘導(dǎo)IL-8和MCP-1的分泌主要是通過(guò)激活ERK和JNK信號(hào)通路起作用。因此，在胃癌中CHl3L1可能也是通過(guò)激活ERK和JNK信號(hào)通路促進(jìn)IL-8和MCP-1的表達(dá)，從而促進(jìn)胃癌的增殖及侵襲轉(zhuǎn)移。然而，具體的分子機(jī)制尚有待于深入研究。

通過(guò)單因素分析顯示腫瘤的大小、分化程度、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期及CHI3L1的高表達(dá)與胃癌患者的生存期有關(guān)。Cox風(fēng)險(xiǎn)模型發(fā)現(xiàn)CHI3L1的高表達(dá)、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期是胃癌患者的獨(dú)立預(yù)后不良因素。生存分析結(jié)果表明胃癌患者中CHI3L1蛋白高表達(dá)者生存時(shí)間明顯短于CHl3L1蛋白低表達(dá)者，提示CHI3L1蛋白有可能成為胃癌預(yù)后的潛在分子標(biāo)志物。