水稻紋枯病菌拮抗芽孢桿菌的篩選及鑒定

楊金松，王愛軍，張?jiān)倬?

（1.湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所，湖北武漢430064；2.糧食作物種質(zhì)創(chuàng)新與遺傳改良湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北武漢430064；3.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)水稻研究所，四川成都611130）

水稻紋枯病是由立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）引起的一種土傳性真菌病害，該病原菌可產(chǎn)生抗逆性強(qiáng)、在土壤中存活和傳播中起關(guān)鍵作用的菌核結(jié)構(gòu)，防控難度極大，嚴(yán)重發(fā)病時可造成水稻減產(chǎn)50%，現(xiàn)已成為制約我國南方水稻高產(chǎn)的第一大病害[1-2]。生產(chǎn)中長期單一使用化學(xué)藥劑，不僅使病原菌產(chǎn)生抗藥性、污染環(huán)境，高劑量的農(nóng)藥殘留還會危及人類健康，同時對土壤中有益微生物也產(chǎn)生抑制作用[3]。生物防治對環(huán)境、生態(tài)和人類健康安全，因此在防治水稻紋枯病中發(fā)揮著越來越重要的作用。開發(fā)新的有益微生物資源是生物防治的前提。

芽孢桿菌（Bacillus spp.）能產(chǎn)生耐熱抗逆的內(nèi)生芽胞，不僅分泌多種抑菌化合物，還可以促進(jìn)植物生長和誘導(dǎo)植物產(chǎn)生系統(tǒng)抗性。目前，性狀優(yōu)良的菌株資源已成功用于植物病害的防控[4-5]。李全勝等研究發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌S12的發(fā)酵液對棉花黃萎病病原大麗輪枝菌具有明顯的抑制效果[6]；黃秋斌等研究表明，蠟樣芽孢桿菌B3-7在大田條件下對小麥紋枯病菌具有良好的防治效果[7]；喬俊卿等研究了枯草芽孢桿菌Bs916對番茄青枯病的防治作用，發(fā)現(xiàn)菌株Bs916可以影響番茄根表及莖內(nèi)青枯病菌種群的數(shù)量，且對番茄植株具有促生作用[8]。

湖北是我國水稻種植大省，由立枯絲核菌（R.solani）引起的紋枯病是湖北水稻種植區(qū)的主要病害。為充分發(fā)掘利用水稻田已有的生防微生物資源，篩選出強(qiáng)拮抗水稻紋枯病菌的芽胞桿菌菌株，本研究從水稻田植株周圍耕作層土壤中分離并篩選對立枯絲核菌具有抑制作用的芽胞桿菌菌株，為水稻紋枯病的防治和生防制劑的研發(fā)提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 土樣采集

采用5點(diǎn)取樣法，采樣點(diǎn)位于四川農(nóng)業(yè)大學(xué)水稻試驗(yàn)田中，于水稻揚(yáng)花期采集根際0～20 cm的土樣用于分離芽孢桿菌菌株。每個種植小區(qū)采集5個點(diǎn)，混勻，共16份土樣，保存于-20℃冰箱，備用。

1.2 供試靶標(biāo)病原菌

供試靶標(biāo)病原菌為水稻紋枯病強(qiáng)致病力菌株R.solaniAG1 IA，用于篩選生防芽孢桿菌菌株，由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)水稻研究所植物病理實(shí)驗(yàn)室提供。

1.3 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基：稱取10 gNaCl、10 g胰蛋白胨、5 g酵母膏、16g瓊脂加入1000mL蒸餾水中溶解，115℃高壓滅菌20 min。

LB培養(yǎng)液：LB培養(yǎng)基不加瓊脂。

PDA培養(yǎng)基：稱取馬鈴薯240 g去皮，切成1 cm左右方塊，加1 000 mL蒸餾水煮沸10 min，過濾，加入葡萄糖10 g、瓊脂15 g，115℃高壓滅菌20 min。

1.4 芽孢桿菌的分離純化

每份土樣稱取1 g置于無菌三角瓶中，加入無菌蒸餾水99 mL，混勻，80℃水浴處理10 min[9]，制得土壤懸浮液。根據(jù)預(yù)試結(jié)果，采用10倍稀釋法[10]，將土壤懸浮液稀釋105倍。取105倍稀釋液0.5 mL均勻涂布于LB培養(yǎng)基上，重復(fù)3次。30℃恒溫培養(yǎng)箱中放置2 d，挑取單菌落純化培養(yǎng)24 h，置于60%甘油中保存，放于-20℃冰箱備用。以上試驗(yàn)均在無菌條件下操作。

1.5 拮抗芽孢桿菌的篩選

采用平板對峙培養(yǎng)法篩選對病原菌有拮抗作用的芽孢桿菌菌株。將靶標(biāo)菌于PDA培養(yǎng)基上活化，打取菌落邊緣直徑為6 mm菌餅，倒置于PDA培養(yǎng)基中央，培養(yǎng)24 h后，在距菌餅20 mm處上、下、左、右分別對稱點(diǎn)接4株待測芽孢桿菌菌株，重復(fù)3皿。于26～28℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，4 d后觀察芽孢桿菌抑菌情況，測量抑菌圈半徑并拍照處理。

1.6 拮抗芽孢桿菌菌株的鑒定

1.6.1 形態(tài)特征與生理生化特性。參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》[11]。

1.6.2 拮抗芽孢桿菌菌株基因組DNA的提取及檢測。將純化的芽孢桿菌菌株接種于LB液體培養(yǎng)基中，150 r/min培養(yǎng)16 h，取1 mL菌液，10 000 r/min離心1 min收集菌體。采用離心柱型細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒[生工生物工程（上海）有限公司提供]提取菌株DNA，1%瓊脂糖凝膠電泳對DNA質(zhì)量進(jìn)行檢測。

1.6.3gyrB序列分析。以“1.6.2”節(jié)中提取的拮抗芽孢桿菌菌株DNA為模板，gyrB-1（TTGRCGGHRGY GGHTATAAAGT）、gyrB-2（TCCDCCSTCAGARTCW CCCTC）為正、反向引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增菌株的gyrB片段[12]，1%瓊脂糖凝膠電泳對PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測，送成都擎科生物科技有限公司進(jìn)行測序。采用BLAST程序，將測序所得序列與GenBank中核酸數(shù)據(jù)庫序列進(jìn)行同源性比對，利用DNAstar軟件中的MegAlign程序?qū)⒈葘Y(jié)果同源性較高的芽孢桿菌登記菌株序列與所得序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗菌株的篩選結(jié)果

從16份土樣中共篩選到96株芽孢桿菌菌株，通過平板對峙試驗(yàn)，得到1株抑菌帶寬度＞5 mm的菌株 Q9-0-1（圖 1），5株 4～5 mm的菌株，14株3～4 mm的菌株，26株2～3 mm的菌株，50株0～2 mm的菌株（表1）。

2.2 菌株Q9-0-1的鑒定

2.2.1 菌株Q9-0-1的形態(tài)學(xué)與生理生化特征。將拮抗芽孢桿菌菌株Q9-0-1在LB瓊脂平板上培養(yǎng)24 h后的菌落形態(tài)為不規(guī)則形，直徑2 mm左右，顯微黃色，表面有突起或褶皺，產(chǎn)生橢圓形芽孢。其生理生化指標(biāo)測定結(jié)果見表2。

表1 拮抗芽孢桿菌菌株篩選結(jié)果

2.2.2 菌株Q9-0-1的gyrB序列分析。PCR擴(kuò)增后，得到了1 200 bp左右清晰的條帶（圖2）。經(jīng)測序，得到了大小為1 080 bp的堿基序列。將所得序列與GenBank中核酸數(shù)據(jù)庫序列進(jìn)行同源性比對，結(jié)果表明，拮抗菌株Q9-0-1與Genbank登記的B.pumilus（AUEM104）、B.pumilus（AUEM12）、B.pumilus（AUES82）、B.pumilus（KYC24）、B.pumilus（ATCC 27142）、B.pumilus（LNXM12）、B.pumilus（NMTD17）、B.pumilus（MZGC1）和B.pumilus（KYC18）9 株菌株的同源性達(dá)99%。選取這9株菌株與菌株Q9-0-1構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，由圖3可知，Q9-0-1與菌株B.pumilus（LNXM12）處于最小分支，親緣關(guān)系最近。結(jié)合其形態(tài)特征與生理生化測定結(jié)果，將其鑒定為短小芽孢桿菌（B.pumilus）[11]。

表2 菌株Q9-0-1的生理生化特性

圖1 芽孢桿菌菌珠Q9-0-1（右）對立枯絲核菌的拮抗效果

圖2 芽孢桿菌菌珠Q9-0-1PCR擴(kuò)增條帶

圖3 菌株Q9-0-1的系統(tǒng)發(fā)育樹

3 討論

土壤中含有大量的有益微生物資源，部分可以通過人工培養(yǎng)分離獲得。本研究從水稻根際分離到96株芽孢桿菌菌株，通過對水稻紋枯病菌的拮抗篩選，得到49株抑菌帶寬度大于2 mm的菌株，占分離總數(shù)的51%，這些菌株都可以進(jìn)一步開發(fā)利用，有望應(yīng)用于農(nóng)作物的生產(chǎn)中。

對細(xì)菌的分類鑒定是細(xì)菌研究的重要基礎(chǔ)性工作之一，16SrDNA序列分析是對細(xì)菌進(jìn)行分子鑒定的標(biāo)準(zhǔn)方法[13]。但是，由于16SrDNA序列具有高度的保守性，其分析鑒定細(xì)菌的方法有一定的局限性，難以分辨親緣關(guān)系較近的種[14]。gyrB基因編碼DNA促旋酶的β亞單位蛋白，在不改變氨基酸序列前提下，其特有的遺傳密碼子兼并性可使DNA序列發(fā)生較多的變異，gyrB基因序列較非蛋白編碼基因16S rDNA更能精確區(qū)分和鑒定芽孢桿菌的近緣種。Wang等使用16SrDNA序列分析了8個枯草芽孢桿菌群的系統(tǒng)發(fā)育，無法準(zhǔn)確區(qū)分相似度在98%以上的亞群，而采用gyrB基因序列可精確區(qū)分其亞群[15]。

利用有益微生物對植物病蟲害進(jìn)行防控已經(jīng)成為目前農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的趨勢，芽孢桿菌屬細(xì)菌，其因獨(dú)特的生物學(xué)特性更具有廣泛的應(yīng)用前景，已有多種芽孢桿菌制劑成功用于農(nóng)作物病蟲防治中。張學(xué)君等報(bào)道了生防菌B3制劑對小麥紋枯病具有較好的田間防效[16]；枯草芽孢桿菌可濕性粉劑（百抗）可用于水稻紋枯病、三七根腐病、煙草黑脛病的防治，并已推廣至多個省份，施用面積達(dá)4 667 hm2[17]。本研究篩選到的短小芽孢桿菌Q9-0-1菌株在室內(nèi)平板條件下對水稻紋枯病菌有較強(qiáng)的拮抗作用，可進(jìn)一步驗(yàn)證其田間防治效果，為生物農(nóng)藥的開發(fā)利用提供了一種有效的菌種資源。