SDS-PAGE法測(cè)定蒜酶相對(duì)分子質(zhì)量及含量

李心雨， 朱 麗， 李新霞,3

(1新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，烏魯木齊 830011； 2新疆師范大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，烏魯木齊 830054； 3新疆醫(yī)科大學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊 830011)

大蒜(AlliumsativumL.)為百合科蔥屬植物蒜的地下鱗莖，作為藥食兩用植物，已有數(shù)千年的歷史[1-3]，大蒜具有抗菌、保肝、降血脂、降血壓、抗氧化及抗腫瘤等多種藥理活性作用[4-5]。前期研究表明大蒜中含有多種化學(xué)成分,主要包括含硫有機(jī)化合物和皂苷類。蒜酶(Alliinase)，又稱蒜氨酸裂合酶，具有催化裂解蒜氨酸、促進(jìn)大蒜活性物質(zhì)生成[6-7]等作用，是C-S鍵化合物的“裂合酶”，是兩個(gè)相同亞基構(gòu)成的二聚體糖蛋白，黃色結(jié)晶，無(wú)臭[8-9]。大蒜蒜酶的中試生產(chǎn)過(guò)程中除蒜酶活力外純度也是蒜酶質(zhì)量考察的重要指標(biāo)。其中SDS-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)法在蛋白質(zhì)研究中是一種經(jīng)典方法，因其穩(wěn)定性、精密度、重現(xiàn)性較好而被應(yīng)用[10-15]。本研究采用SDS-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)法測(cè)定蒜酶的相對(duì)含量及其分子質(zhì)量，測(cè)定不同批次蒜酶供試品，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1儀器DYY-6C型電泳儀(北京六一儀器廠)，PROTEAN?Ⅱ型電泳槽(美國(guó)Bio-Rad公司)，GS-800TMCalibrated Densitometer校準(zhǔn)型密度計(jì)(美國(guó)Bio-Rad公司)，Sorvall Legend Micro 21R型微量離心機(jī)(美國(guó)賽默飛世爾科技公司)，ZHWY-2102C恒溫振蕩器(上海智城分析儀器制造有限公司)，T6型紫外可見分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)，AB135-S型分析天平(Mettler Toledo集團(tuán))。

1.2試藥30%Acr-Bis(博士德生物工程有限公司，批號(hào)11122C61)，考馬斯亮藍(lán)R-250(美國(guó)Sigma-Aldrich公司，批號(hào)B-0149)，彩色預(yù)染標(biāo)準(zhǔn)蛋白Marker(美國(guó)賽默飛世爾科技公司，相對(duì)分子質(zhì)量范圍10～170 KDa，批號(hào)00442922)，四甲基乙二胺(索萊寶生物科技有限公司，批號(hào)810C021)，甘氨酸(美國(guó)Sigma-Aldrich公司，批號(hào)WXBC4482V，純度98%)，十二烷基硫酸鈉(SDS，上海試四赫維化工有限公司，批號(hào)0801101)，三羥甲基氨基甲烷(美國(guó)Sigma-Aldrich公司，批號(hào)WXBC3998W)，過(guò)硫酸銨(北京博奧拓達(dá)科技有限公司，批號(hào)20160831)，甘油(天津市盛奧化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)20150712)，溴酚藍(lán)(博士德生物工程有限公司，批號(hào)20170322)，5-磷酸吡哆醛(索萊寶生物科技有限公司，批號(hào)719B032)，β-巰基乙醇(天津市福晨化學(xué)試劑廠，批號(hào)20150720)，HyClone磷酸鹽緩沖液(江蘇澤源生物科技有限公司，批號(hào)AB10188719)。

1.3藥材蒜酶供試品(新疆埃樂欣藥業(yè)有限公司，批號(hào)201702011、201702012、201702013、201702021、201702022、201702023、201703011、201703012、201703013、201703021、201703022、201703023)；大蒜提取物(新疆埃樂欣藥業(yè)有限公司提供，產(chǎn)自新疆哈密巴里坤縣)。

2 方法與結(jié)果

2.1溶液的制備

2.1.1 電極緩沖液 稱取三羥甲基氨基甲烷3.0 g、甘氨酸14.4 g、十二烷基硫酸鈉1.0 g，加水適量溶解，用鹽酸調(diào)pH至8.3，加水稀釋至1 000 mL。

2.1.2 載樣緩沖液 分別量取1 mol/L三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液(Tris-HCl，pH= 6.8)1.25 mL，甘油2.5 mL，SDS 0.5 g，25 mg溴酚藍(lán)，加水至5 mL，室溫保存，使用前加入250 μL β-巰基乙醇。

2.1.3 磷酸鹽緩沖溶液 量取磷酸鹽緩沖液100 mL，使用前加入1 mmol/L 5-磷酸吡哆醛溶液2.5 mL。

2.1.4 考馬斯亮藍(lán)R-250染色液 稱取考馬斯亮藍(lán)R-250 0.2 g，分別量取甲醇40 mL、冰醋酸10 mL、水50 mL，混勻備用。

2.1.5 考馬斯亮藍(lán)R-250脫色液 量取甲醇40 mL、冰醋酸10 mL，加水定容至100 mL，混勻備用。

2.1.6 供試品溶液的配制 稱取蒜酶和大蒜供試品(大蒜在新疆埃樂欣藥業(yè)有限公司采用凍干工藝制成大蒜提取物)適量，水或磷酸鹽緩沖液溶解，渦旋混勻。取300 μL上清液加入100 μL載樣緩沖液混勻，100℃水浴加熱5 min，12 000 r/min離心5 min，棄沉淀，取上清液，備用。

2.2SDS-PAGE電泳測(cè)定方法配制12%分離膠，灌入玻璃板內(nèi)至玻璃板的2/3處，加乙醇或水封頂，聚合后，另配制5%濃縮膠溶液，緩慢插入樣品梳，靜置。采用垂直板電泳，在點(diǎn)樣孔中分別加入供試品溶液10 μL、彩色預(yù)染標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液5 μL。設(shè)置初始電壓為80 V，進(jìn)入分離膠時(shí)調(diào)至100 V，當(dāng)溴酚藍(lán)遷移至膠底處，停止電泳。電泳完畢取出膠片，振蕩染色50 min，然后用脫色液脫色5 h至凝膠背景透明。取出膠片，于GS-800TM Calibrated Densitometer校準(zhǔn)型密度計(jì)觀察并拍照，采用Gel-Pro analyzer對(duì)凝膠結(jié)果圖進(jìn)行分析。

2.3蒜酶供試品凝膠電泳影響因素考察

2.3.1 供試品溶劑考察 稱取蒜酶供試品約68 mg，至10 mL容量瓶中，分別采用水和磷酸鹽緩沖液溶解定容。按“2.1.6”項(xiàng)下配制蒜酶供試品溶液，按“2.2”項(xiàng)下方法進(jìn)行電泳和染色脫色。試驗(yàn)分別采用純水(A)和磷酸鹽緩沖液(B)溶解供試品，進(jìn)行凝膠圖譜掃描，A、B系列供試品均在小于55 KDa有一條明顯的蛋白條帶，根據(jù)文獻(xiàn)[16]蒜酶單個(gè)亞基相對(duì)分子質(zhì)量為51.5 KDa，由此可知圖中小于55 KDa處的蛋白條帶為蒜酶條帶，見圖1。稱取蒜酶供試品40.8、68.0、102.0、136.0、170.0 mg至10 mL容量瓶中，分別用水、磷酸鹽緩沖液溶解定容。按“2.1.6”項(xiàng)下配制蒜酶供試品溶液，按“2.2”項(xiàng)下進(jìn)行電泳和染色脫色。對(duì)比彩色預(yù)染標(biāo)準(zhǔn)蛋白，A、B系列在55 KDa附近處的蒜酶條帶隨著蒜酶濃度增加，顏色加深，條帶加寬。對(duì)比水與磷酸鹽緩沖液溶解供試品的凝膠圖譜顯示，磷酸鹽緩沖液溶解的蒜酶供試品條帶更清晰集中，試驗(yàn)確定以磷酸鹽緩沖液溶解蒜酶供試品更優(yōu)，見圖2。

圖1 蒜酶供試品不同溶劑的凝膠電泳圖譜

注: A：純水溶解供試品；B：磷酸鹽緩沖溶液溶解供試品；M：為彩色預(yù)染標(biāo)準(zhǔn)蛋白

圖2 蒜酶供試品不同溶劑的系列濃度凝膠電泳圖譜

注：A1-A5分別是蒜酶濃度為4.08、6.80、10.20、13.60、17.00 mg/mL的以水為溶劑的蒜酶供試液；B1-B5分別是蒜酶濃度為4.08、6.80、10.20、13.60、17.00 mg/mL的以磷酸鹽緩沖液為溶劑的蒜酶供試液；M為彩色預(yù)染標(biāo)準(zhǔn)蛋白。

2.3.2 蒜酶供試品濃度考察 稱取蒜酶供試品136、170、204、238、272、306、340 mg至10 mL容量瓶中，磷酸鹽緩沖液溶解定容。按“2.1.6”項(xiàng)下配制蒜酶供試品溶液，按“2.2”項(xiàng)下方法進(jìn)行電泳和染色脫色。蒜酶供試品濃度在30.6～34.0 mg/mL蒜酶供試品蛋白濃度較高，不便于準(zhǔn)確測(cè)定蛋白分子量，而濃度為23.8 mg/mL蒜酶供試品在15 KDa附近蛋白條帶不明顯，所以確定蒜酶供試品濃度為27.2 mg/mL進(jìn)行蒜酶供試品的電泳測(cè)定，見圖3。

圖3 以磷酸鹽緩沖液為溶劑的不同濃度蒜酶供試品凝膠圖譜

注：B4-B10分別是蒜酶濃度分別為13.6、17.0、20.4、23.8、27.2、30.6、34.0 mg/mL的以磷酸鹽緩沖液為溶劑的蒜酶供試液，M為彩色預(yù)染標(biāo)準(zhǔn)蛋白。

2.4蒜酶相對(duì)含量和相對(duì)分子質(zhì)量測(cè)定

2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 已知在SDS-PAGE電泳中蛋白質(zhì)的遷移率和相對(duì)分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)呈線性關(guān)系，符合下式：lgMW=K-bRf，MW為蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量，Rf為相對(duì)遷移率，b為標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率，K為常數(shù)[17-18]。本試驗(yàn)以彩色預(yù)染蛋白Marker的比移值為橫坐標(biāo)(X)，相對(duì)分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)(lgMW)為縱坐標(biāo)(Y)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：Y=-1.268 6X+2.106 8，r=0.972 3。將不同蛋白條帶的比移值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，可得到各條帶的相對(duì)分子質(zhì)量，記錄數(shù)據(jù)。

2.4.2 蒜酶供試品測(cè)定 稱取蒜酶供試品約272 mg，至10 mL容量瓶，磷酸鹽緩沖液溶解定容。按“2.1.6”項(xiàng)下方法配制蒜酶供試品溶液，按“2.2”項(xiàng)下方法進(jìn)行電泳和染色脫色。對(duì)12批蒜酶供試品進(jìn)行測(cè)定，不同的蒜酶供試品在55 KDa和10 KDa處均有較為明顯的2條蛋白條帶，見圖4。相對(duì)分子質(zhì)量在40～55 KDa蛋白條帶和10 KDa蛋白條帶顏色較深且寬。蒜酶供試品在45～55 KDa均顯示清晰條帶，12個(gè)蒜酶供試品中蒜酶平均相對(duì)分子質(zhì)量為50.84 KDa，在總蛋白條帶中蒜酶平均相對(duì)含量達(dá)52.39%，除蒜酶條帶外，10 KDa處也有明顯的蛋白條帶，平均相對(duì)分子質(zhì)量為10.56 KDa，蛋白平均相對(duì)含量為52.02%，見表1。

2.4.3 不同樣品中蒜酶相對(duì)含量和相對(duì)分子質(zhì)量的測(cè)定 分別稱取大蒜供試品和蒜酶供試品約272 mg，加磷酸鹽緩沖液定容至10 mL容量瓶中。按“2.1.6”項(xiàng)下方法配制蒜酶供試品溶液，按“2.2”項(xiàng)下方法測(cè)定，蒜酶供試品中的蒜酶相對(duì)含量大于大蒜中的蒜酶相對(duì)含量，在1～9蒜酶供試品中，蒜酶平均相對(duì)分子質(zhì)量為51.12 KDa，平均相對(duì)含量50.20%；大蒜中蒜酶平均相對(duì)分子質(zhì)量為50.52 KDa，平均相對(duì)含量6.28%。經(jīng)提取純化后的蒜酶供試品在平均相對(duì)分子質(zhì)量10.42 KDa有較為明顯的蛋白條帶，蛋白平均相對(duì)含量28.39%；大蒜在平均相對(duì)分子質(zhì)量11.58 KDa處有明顯蛋白條帶，蛋白平均相對(duì)含量93.71%，見圖5、6、表2。

圖4 蒜酶供試品凝膠電泳圖譜

注：1～12分別是不同批次蒜酶供試品，依次為201702011、201702012、201702013、201702021、201702022、201702023、201703011、201703012、201703013、201703021、201703022、201703023；M是彩色預(yù)染蛋白。

表1 不同批次蒜酶的主要共有蛋白條帶

圖5 大蒜與蒜酶蛋白含量凝膠電泳圖譜比較

注：1～9是蒜酶供試品；10～14是大蒜供試品，M是彩色預(yù)染蛋白。

圖6 蒜酶和大蒜供試品主要共有蛋白條帶含量柱狀圖

注：1～9為蒜酶供試品；10～15為大蒜供試品。

表2 蒜酶和大蒜供試品的主要蛋白條帶

3 討論

本研究建立SDS-PAGE法測(cè)定蒜酶含量和分子量，分別對(duì)供試品溶樣方式及樣品濃度進(jìn)行考察，確定最佳條件，該條件下蒜酶條帶清晰，無(wú)拖尾現(xiàn)象，經(jīng)蒜酶供試品和大蒜提取物兩種樣品的考察，顯示此方法可檢測(cè)不同樣品中的蒜酶，方法簡(jiǎn)便、可行。通過(guò)SDS-PAGE法測(cè)定蒜酶含量，旨在為大蒜蒜酶提取純化奠定實(shí)驗(yàn)研究基礎(chǔ)。