質(zhì)譜-色譜技術(shù)在早產(chǎn)兒蛋白質(zhì)代謝中的應(yīng)用研究

馬麗霞, 鄭曉玲, 朱小敏

(珠海市第二人民醫(yī)院新生兒科， 廣東 珠海 519000)

近年來，隨著醫(yī)學(xué)的飛速進展，早產(chǎn)兒的出生率呈逐年上升趨勢，且早產(chǎn)兒的存活率也有大大提高，但存活者卻存在著各種并發(fā)癥，其中出生早期的營養(yǎng)不足是影響早產(chǎn)兒后期生存質(zhì)量的常見問題[1-2]。

近期，已有大量研究顯示[3-4]，早產(chǎn)兒出生早期營養(yǎng)攝入不足不僅影響疾病恢復(fù)與生長發(fā)育，而且還可影響大腦細(xì)胞發(fā)育，導(dǎo)致永久性腦損傷，因此常常需要腸外營養(yǎng)，目前新生兒科工作者都采用早期、足量的腸外營養(yǎng)為早產(chǎn)兒提供糖類、蛋白質(zhì)以及脂肪等營養(yǎng)物質(zhì)，以滿足其生后“追趕性生長”的要求[5-6]。但隨之而來的也有許多遠(yuǎn)期并發(fā)癥，例如心血管系統(tǒng)的疾病、糖尿病和肥胖癥等代謝綜合征[7]。這就需要有一個精確的評估早產(chǎn)兒三大代謝物質(zhì)(蛋白質(zhì)、糖類、脂肪)代謝特點的方法，來指導(dǎo)新生兒科醫(yī)生在臨床工作中“精確”而且“個體化”地為不同的早產(chǎn)兒提供營養(yǎng)支持。

本研究利用氣相色譜法-質(zhì)譜技術(shù)(gas chromatography-mass spectrometry, GC-MS)，分析早產(chǎn)兒和足月兒尿液中多種蛋白質(zhì)的代謝產(chǎn)物：賴氨酸、苯丙氨酸、組氨酸、鳥氨酸、延胡索酸、蘋果酸，尋找早產(chǎn)兒特異的生物標(biāo)志物和代謝通路，為早產(chǎn)兒合理補充氨基酸提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1研究對象選擇2016年7月-2017年12月在珠海市第二人民醫(yī)院(珠海市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院)新生兒科的47例胎齡為28～36 w的早產(chǎn)兒為研究對象，歸入試驗組(早產(chǎn)兒組)。選擇同時期分娩的正常足月兒(胎齡37～41 w)45例為對照組(足月兒組)。2組新生兒出生體質(zhì)量和胎齡差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(Z=-3.752，P<0.001；Z=-3.249，P<0.001)。本研究獲得醫(yī)院倫理委員會的批準(zhǔn)，研究對象選擇獲得受試者家屬的知情同意。

1.2入選標(biāo)準(zhǔn)(1)胎齡28～36 w出生的早產(chǎn)兒，無明顯窒息史(產(chǎn)前和產(chǎn)時)，生后6 h內(nèi)未出現(xiàn)并發(fā)癥(新生兒呼吸窘迫綜合征、新生兒高膽紅素血癥、新生兒缺氧缺血性腦病、新生兒感染、新生兒顱內(nèi)出血、母嬰血型不合溶血病等)，Apgar評分≥8分，血氣分析pH和乳酸值未見明顯異常。(2)足月新生兒(胎齡37～41 w)，無合并癥，Apgar評分≥8分，血氣分析pH和乳酸值在正常范圍內(nèi)。(3)所有新生兒(早產(chǎn)兒和足月兒)均為適于胎齡兒，生后6 h內(nèi)未實施頭罩吸氧、CPAP和(或)機械通氣等，未使用抗氧化劑(如維生素E、氨溴索等)治療。(4)所有新生兒(早產(chǎn)兒和足月兒)母親既往無慢性疾病史(如糖尿病、高血壓、心血管疾病及腎臟疾病等)，無感染性疾病史(如結(jié)核、梅毒等)，無營養(yǎng)不良病史，無不良嗜好(如酗酒、吸煙、吸毒等)及濫用藥物史。早產(chǎn)兒母親可能存在妊娠合并癥；足月兒母親無妊娠合并癥存在。

1.3喂養(yǎng)方式所有入選的早產(chǎn)兒和足月兒均于生后3 h開始經(jīng)口喂養(yǎng)嬰兒配方奶粉：早產(chǎn)兒和足月兒分別使用的特別能恩(熱卡2 084 kJ/100 g)和超級能恩(熱卡2 145 kJ/100 g)均為雀巢(Nestle)公司產(chǎn)品，早產(chǎn)兒按1.0～2.0 mL·kg-1·h-1量開始喂養(yǎng)，每2小時喂哺1次；足月兒按起始量每次20～30 mL，每3小時喂哺1次。所有早產(chǎn)兒和足月兒收集尿液標(biāo)本前均未進行腸道外營養(yǎng)支持。

1.4方法

1.4.1 尿液標(biāo)本收集 新生兒出生24 h內(nèi)留取尿液標(biāo)本。記錄一般臨床資料(住院號、胎齡、出生體質(zhì)量、診斷、標(biāo)本收集時間)，用尿袋收集清潔尿液2 mL，置于普通干燥管，或浸透于專用尿液收集的濾紙片(日本松本生命科學(xué)研究院研制)上，用油性記號筆寫上編號和姓名，置于-20℃冰箱里保存，在1 w內(nèi)進行檢測。

1.4.2 尿液代謝產(chǎn)物檢測 應(yīng)用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀進行尿液代謝產(chǎn)物分析，測定尿代謝產(chǎn)物水平，包括賴氨酸、苯丙氨酸、組氨酸、鳥氨酸、延胡索酸、蘋果酸。

1.4.3 儀器與試劑 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(日本電子，Q1000型)、試管濃縮儀(維新明智科技有限公司，TC-8F)、干式加熱器(北京來亨科貿(mào)有限責(zé)任公司，L-129A)、試管濃縮氮吹儀(北京來亨科貿(mào)有限責(zé)任公司，023-119A)、循環(huán)水真空泵(上海亞榮生化儀器，SHZ-ⅢD)、離心機(德國艾本德公司，5147-C)、色譜柱(日本Ultra Alloy+5UA5-30M-0.25F)、尿激酶(美國Sigma Type CⅢ)、誘導(dǎo)劑(美國Sigma，BSTFA/TMCS)。

2 結(jié)果

2.12組新生兒的尿液賴氨酸、苯丙氨酸、組氨酸水平分析早產(chǎn)兒組的尿液中賴氨酸、苯丙氨酸以及組氨酸水平均明顯低于足月兒組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1早產(chǎn)兒與足月兒組尿液賴氨酸、苯丙氨酸、組氨酸水平(正常值的倍率)

分組例數(shù)賴氨酸苯丙氨酸組氨酸早產(chǎn)兒組470*0*0*足月兒組450.21±0.280.02±0.021.24±1.80t值3.4004.0643.072P值0.0030.0010.006

注：*早產(chǎn)兒組中所有早產(chǎn)兒尿液中賴氨酸、苯丙氨酸以及組氨酸水平均在可測范圍之下(數(shù)值為0)。

2.22組新生兒尿液中鳥氨酸、延胡索酸、蘋果酸水平分析早產(chǎn)兒組的尿液中鳥氨酸、延胡索酸及蘋果酸水平均明顯低于足月兒組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

3 討論

氣相色譜法-質(zhì)譜法聯(lián)用(gas chromatography-mass spectrometry, GC-MS)技術(shù)是代謝組學(xué)研究中的一種主要方法，是一種全新的高通量化學(xué)分析和多維統(tǒng)計分析方法，僅需對極少量物質(zhì)(如尿液、血液)進行分析，就可檢測到生物體內(nèi)代謝產(chǎn)物的變化[8]。目前已廣泛應(yīng)用于心血管疾病、傳染病、癌癥及精神分裂癥的輔助診斷和治療效果的監(jiān)測。在兒科領(lǐng)域主要用于遺傳代謝性疾病的診斷和篩查上[9-10]。國外最新研究表明，此項技術(shù)應(yīng)用于新生兒可為早期診斷、監(jiān)測新生兒疾病的重要生物標(biāo)志物(Biomark)提供重要線索[11-12]。

表2 早產(chǎn)兒與足月兒組尿液鳥氨酸水平(正常值的倍率)

尿液中含有三大營養(yǎng)物質(zhì)以及多種其他物質(zhì)的代謝產(chǎn)物(中間或終末性的)，這些代謝產(chǎn)物的水溶性相對而言較高，所以它們經(jīng)過腎臟后仍可大量排出，故尿中測出的濃度要遠(yuǎn)高于其在血液中的濃度。

本研究應(yīng)用UP-GC-MS技術(shù)選擇性測定了部分早產(chǎn)兒及足月兒尿液中的氨基酸，包括在新生兒生長發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用的賴氨酸、苯丙氨酸、組氨酸，以及直接或者間接參與尿素循環(huán)的鳥氨酸、延胡索酸、蘋果酸。賴氨酸是一種堿性氨基酸，能促進生長發(fā)育、提高免疫水平，并且對人的中樞神經(jīng)和周圍神經(jīng)系統(tǒng)都起著重要作用；同時賴氨酸能與其他物質(zhì)共同形成膠原蛋白，能夠強化骨骼、肌肉、肌腱、關(guān)節(jié)軟骨和結(jié)締組織等組織器官。賴氨酸是合成蛋白質(zhì)的氨基酸中最重要的一種，其缺乏會影響其余氨基酸的利用，故有人稱其為人體必需氨基酸的第一位。苯丙氨酸參與生成腎上腺素、甲狀腺素和黑色素。組氨酸對兒童或者成人都為必需氨基酸。組胺能強烈地舒張血管，與許多炎癥反應(yīng)、變態(tài)反應(yīng)關(guān)系密切，還能促進胃蛋白酶及胃酸的分泌。鳥氨酸參與尿素循環(huán)，與尿素生成密切相關(guān)，延胡索酸參與葡萄糖氧化產(chǎn)能的過程，不僅能調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)，還能清除炎癥過程中釋放的破壞性“氧自由基”，促進神經(jīng)細(xì)胞存活。蘋果酸是生物體三羧酸循環(huán)的中間產(chǎn)物，其有護肝作用，也可改善腦組織的能量代謝進而調(diào)整腦內(nèi)的神經(jīng)遞質(zhì)。

本研究結(jié)果顯示， 早產(chǎn)兒組的賴氨酸、苯丙氨酸以及組氨酸水平均明顯低于足月兒組?？赡艿脑驗椋?(1)新生兒體內(nèi)原始氨基酸儲備來自于妊娠晚期的胎兒期，胎齡越小，其體內(nèi)氨基酸儲備越少；(2)氨基酸代謝過程需要許多酶參與，這些酶的活性隨著胎齡增長而日益成熟，而早產(chǎn)兒體內(nèi)某些酶尚未成熟，氨基酸代謝受之影響，導(dǎo)致其體內(nèi)的氨基酸相對缺乏；(3)早產(chǎn)兒生后比足月兒更需要充分的氨基酸供給來完成其“追趕性生長”的過程，其體內(nèi)的氨基酸利用更多，故而造成其尿中氨基酸的排泄減少；(4)早產(chǎn)兒腎臟功能發(fā)育完善程度不及足月兒，故氨基酸經(jīng)腎臟排出的量相對減少。

鑒于上文所述幾種氨基酸的代謝特點，在臨床工作中為早產(chǎn)兒補充氨基酸時不僅要注意量的補充，且不同氨基酸的成分配比也應(yīng)得到重視。早產(chǎn)兒生后營養(yǎng)供給的途徑主要是腸道外營養(yǎng)，所以在臨床上使用適合早產(chǎn)兒的氨基酸制劑十分重要。關(guān)于現(xiàn)有的小兒氨基酸制劑是否確實適合早產(chǎn)兒生長發(fā)育、對其遠(yuǎn)期健康是否有利尚無充分的研究報道，結(jié)合本研究結(jié)果，有必要對更多早產(chǎn)兒及足月兒進行尿代謝產(chǎn)物篩查分析及其他相關(guān)輔助檢查，建立大樣本、多中心的臨床研究，完善各胎齡新生兒氨基酸代謝譜，為新生兒(尤其是早產(chǎn)兒)適當(dāng)(包括量及種類)地提供氨基酸補給提供依據(jù)。