酵母水解物對(duì)大口黑鱸生長性能、血漿生化指標(biāo)以及肝臟組織健康的影響

時(shí)　博　郁歡歡　梁曉芳　陳　沛　陳雪松　盧存仁　鄭銀樺　吳秀峰　梁旭方　薛　敏,4*

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所國家水產(chǎn)飼料安全評(píng)價(jià)基地，北京 100081；2.珠海天香苑生物科技發(fā)展股份有限公司，珠海 519000;3.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，武漢 430070；4.農(nóng)業(yè)部飼料生物技術(shù)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，北京 100081)

大口黑鱸(Micropterussalmoides)，又名加州鱸，隸屬鱸形目(Perciforme)，太陽魚科(Ceutrarchidac)，黑鱸屬(Micropterus)。由于其具有生長快、病害少、耐低溫、味道鮮美、營養(yǎng)豐富等優(yōu)點(diǎn)，已成為我國養(yǎng)殖業(yè)中主要淡水魚品種之一[1]。投喂人工配合飼料常引起大口黑鱸出現(xiàn)不同程度的肝臟疾病和厭食，從而導(dǎo)致生長性能的降低，目前大口黑鱸養(yǎng)殖中仍依賴冰鮮小雜魚[2]。大口黑鱸的肝臟疾病已經(jīng)成為限制其投喂人工配合飼料的重要因素之一，誘發(fā)大口黑鱸肝臟疾病的主要原因可能是氧化應(yīng)激[3]、飼料中高水平的可消化碳水化合物(>19%)[4]和霉菌毒素等[5]。由于魚類對(duì)糖的利用率較低，高糖飼料會(huì)引起肝糖原儲(chǔ)積過剩和持久的高血糖[6]。已有研究表明高糖會(huì)引起魚體肝臟的病變[7]。

酵母水解物(yeast hydrolysate，YH)是以新鮮啤酒酵母為原料，采用現(xiàn)代生物工程技術(shù)，經(jīng)除雜、自溶、酶解、噴霧干燥等工藝精制而成的，其富含核酸、小肽、細(xì)胞壁多糖(免疫多糖)、游離氨基酸及豐富的B族維生素。氨基酸和小肽易于消化吸收，在動(dòng)物蛋白質(zhì)營養(yǎng)中優(yōu)勢(shì)顯著，因此酵母水解物是一種理想的功能性蛋白質(zhì)源[8]。本試驗(yàn)通過在基礎(chǔ)飼料中添加5 g/kg酵母水解物，以生長性能、蛋白質(zhì)沉積率、血漿生化指標(biāo)、肝臟組織學(xué)病理及相關(guān)基因表達(dá)量的分析為依據(jù)，研究酵母水解物對(duì)大口黑鱸肝臟組織健康的影響。

1　材料與方法

1.1　試驗(yàn)魚

試驗(yàn)用水產(chǎn)靶動(dòng)物為大口黑鱸，于2016年5月購自佛山市三水白金水產(chǎn)種苗有限公司。試驗(yàn)正式開始前，試驗(yàn)魚在養(yǎng)殖系統(tǒng)中暫養(yǎng)1周，暫養(yǎng)期間投喂暫養(yǎng)飼料。

1.2　試驗(yàn)飼料

采用低魚粉基礎(chǔ)飼料(目前商用大口黑鱸飼料中魚粉使用量超過40%)作為對(duì)照，在此基礎(chǔ)上添加5 g/kg的酵母水解物(由珠海天香苑生物科技發(fā)展股份有限公司提供)配制試驗(yàn)飼料，將2種飼料分別命名為YH0和YH5。物料經(jīng)超微粉碎，均勻混合后，使用雙螺桿擠壓膨化機(jī)(洋工機(jī)械TSE65)擠壓膨化，制成顆粒飼料，自然晾干后于-20 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆?。試?yàn)飼料組成及營養(yǎng)水平見表1。

1.3　分組及飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)在國家水產(chǎn)飼料安全評(píng)價(jià)基地(北京，南口)室內(nèi)循環(huán)流水養(yǎng)殖系統(tǒng)中進(jìn)行。隨機(jī)挑選體質(zhì)健康、個(gè)體均勻的大口黑鱸[平均初始體重為(28.50±0.01) g]，分配到容積為0.26 m3的圓錐形養(yǎng)殖桶中。本試驗(yàn)設(shè)計(jì)2個(gè)組，分別投喂飼料YH0和YH5，每組包含4個(gè)桶(重復(fù))，每桶養(yǎng)殖20尾魚。試驗(yàn)周期10周。每天表觀飽食投喂2次，投喂時(shí)間分別為08:00和16:00。定期檢測(cè)水質(zhì)，水質(zhì)條件保持在溶氧(DO)濃度>7.0 mg/L，總氨氮濃度<0.3 mg/L，pH=7.5～8.5，水溫(23±1) ℃。

表1　試驗(yàn)飼料組成水平及營養(yǎng)水平

1)預(yù)混料為每千克飼料提供Vitamin premix provided the following per kg of diets:VA 20 mg，VB110 mg，VB215 mg，VB615 mg，VB128 mg，VE 400 mg，VK320 mg，VD310 mg，煙酸胺 niacinaminde 100 mg，維生素C磷酸酯鈣 VC phosphate calcium (35%)1 000 mg，肌醇 inositol 200 mg，泛酸鈣 calcium pantothenate 40 mg，生物素 biotin 2 mg，葉酸 folic acid 10 mg，玉米蛋白粉 corn gluten meal 150 mg，CuSO4·5H2O 10 mg，F(xiàn)eSO4·H2O 300 mg，ZnSO4·H2O 200 mg，MnSO4·H2O 100 mg，KIO380 mg，Na2SeO310 mg，CoCl2·6H2O 5 mg，NaCl 100 mg，沸石粉 zeolite 695 mg。

2)酵母水解物主要營養(yǎng)成分如下 The main nutrients of yeast hydrolysate as follows：粗蛋白質(zhì) crude protein 46.8%，氨基酸amino acids (16種 16 kinds) 40.6%，β-葡聚糖 β-glucan 17.8%，甘露聚糖 mannan 10.5%，核酸 nucleic acid 2.01%(數(shù)據(jù)來源于中國廣州分析測(cè)試中心 Data from China National Analytical Center,Guangzhou)。

3)營養(yǎng)水平均為測(cè)定值，除干物質(zhì)為風(fēng)干基礎(chǔ)外，其他均為干物質(zhì)基礎(chǔ)。Nutrent levels were measured values, and dry matter based on air-dry, while the other based on dry matter.

10周生長試驗(yàn)結(jié)束后，禁食24 h，然后分別對(duì)各桶魚稱重并統(tǒng)計(jì)攝食量、存活數(shù)，用于計(jì)算生長指標(biāo)。每桶隨機(jī)取4尾魚，測(cè)量體長、體重、內(nèi)臟重、肝臟重，用于計(jì)算形體指標(biāo)。每桶隨機(jī)取6尾魚，三氯叔丁醇麻醉后尾靜脈取血，采用氟化鈉草酸鉀抗凝劑，在4 ℃、4 000 r/min的條件下離心10 min，取上層血漿保存于-80 ℃冰箱中待測(cè)。

1.4　指標(biāo)測(cè)定

1.4.1生長指標(biāo)

各指標(biāo)計(jì)算公式如下：

存活率(survival rate，SR,%)=100×Nt/N0；
增重率(weight gain rate，WGR,%)=
100×(Wt-W0+Wd)/W0；
特定生長率(specific growth rate，SGR,%/d)=
100×(lnW0-lnWt)/t；
飼料系數(shù)(feed conversion ratio，F(xiàn)CR)=
C/(Wt+Wd-W0)；
攝食率(feeding rate，F(xiàn)R,%/d)=100×C/
{[(W0+Wt+Wd)/2]/t}；
蛋白質(zhì)沉積率(protein deposition rate，PDR,%)=
100×(Wt×Wtp-W0×W0p)/(Wf×Wfp)。

式中：N0為初始魚數(shù)量(尾)；Nt為終末魚數(shù)量(尾)；W0為初始魚體總重(g)；Wt為終末魚體總重(g)；Wd為死亡魚體總重(g)；C為攝食量(g)；Wtp為終末全魚粗蛋白質(zhì)含量(%)；W0p為初始全魚粗蛋白質(zhì)含量(%)；Wf為飼料投喂量(g)；Wfp為飼料粗蛋白質(zhì)含量(%)；t為試驗(yàn)天數(shù)(d)。

1.4.2形體指標(biāo)

各指標(biāo)計(jì)算公式如下：

肥滿度(condition factor，CF，g/cm3)=
平均體重/平均體長3；
肝體比(hepatosomatic index，HSI，%)=
100×肝臟重/體重；
臟體比(viscerasomatic index，VSI，%)=
100×內(nèi)臟重/體重。

1.4.3常規(guī)營養(yǎng)成分

飼料中的水分、粗灰分、粗蛋白質(zhì)、粗脂肪和總能分別采用105 ℃常壓干燥法(GB/T 6435—2006)、550 ℃灼燒法(GB/T 6438—2007)、凱氏定氮法(GB/T 6432—1994)、全脂肪測(cè)定法(GB/T 6433—2006)和氧彈儀燃燒法測(cè)定。

1.4.4血漿生化指標(biāo)

血漿中總膽固醇(total cholesterol，TC)、甘油三酯(triglyceride，TG)、葡萄糖(glucose，GLU)、總膽汁酸(total bile acid，TBA)、丙二醛(malondiadehyde，MDA)含量及堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，AKP)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine transaminase，ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate transaminase，AST)活性均按照試劑盒說明書測(cè)定，所用試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。

1.4.5肝臟組織切片

每個(gè)組隨機(jī)取16尾魚，解剖取0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm大小的肝臟組織，放入4%多聚甲醛溶液中固定24 h。經(jīng)脫水、透明后，石蠟包埋組織，切片厚度7 μm。之后，肝臟組織切片采取3種染色方式進(jìn)行染色，包括蘇木精-伊紅(HE)染色、天狼星紅膠原纖維染色及激活態(tài)半胱天冬酶免疫熒光染色，綠色熒光(Alexa Flour 488，山羊抗兔)顯示凋亡細(xì)胞，核染色采用DAPI熒光染料。以共焦顯微鏡(Leica DM2500，Leica)進(jìn)行觀察拍照。

1.4.6肝臟炎癥和凋亡因子相關(guān)基因mRNA提取、反轉(zhuǎn)錄和表達(dá)量的分析

用miRNasy Mini Kit試劑盒(TaKaRa)提取肝臟的總RNA。取1 μL RNA，采用超微量蛋白分析儀(Nanodrop2000, Thermo)檢測(cè)光密度(OD)值，確保OD260/OD280在1.9～2.1并記錄RNA濃度。反轉(zhuǎn)錄采用Prime Script RT Reagent Kit(Bio-Rad)試劑盒，于冰上操作。

將待測(cè)cDNA樣品進(jìn)行4倍梯度稀釋。采用2-△△Ct法計(jì)算目標(biāo)基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.5　數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SE)的形式呈現(xiàn)，數(shù)據(jù)分析使用軟件SPSS 20.0進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)(independent-samplettest)，以P<0.05為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。

表2　大口黑鱸肝臟炎癥和凋亡因子相關(guān)基因的熒光定量PCR引物

2　結(jié)　果

2.1　酵母水解物對(duì)大口黑鱸生長性能的影響

酵母水解物對(duì)大口黑鱸生長性能的影響見表3。結(jié)果顯示，除YH5組的蛋白質(zhì)沉積率顯著高于YH0組(P<0.05)外，大口黑鱸的其他生長性各組之間均無顯著差異(P>0.05)。

表3　酵母水解物對(duì)大口黑鱸生長性能的影響

同行數(shù)據(jù)肩標(biāo)無字母或相同字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同字母表示差異顯著(P<0.05)。下表同。

In the same row, values with no or the same letter superscripts mean no significant difference (P>0.05), while with different letter superscripts mean significant difference (P<0.05). The same as below.

2.2　酵母水解物對(duì)大口黑鱸血漿生化指標(biāo)的影響

酵母水解物對(duì)大口黑鱸血漿生化指標(biāo)的影響見表4。結(jié)果顯示，血漿中TG、TC、GLU、MDA、TBA含量以及AST和ALT活性各組之間均無顯著差異(P>0.05)。YH5組血漿中AKP活性顯著高于YH0組(P<0.05)。

表4　酵母水解物對(duì)大口黑鱸血漿生化指標(biāo)的影響

2.3　酵母水解物對(duì)大口黑鱸肝臟組織結(jié)構(gòu)及炎癥和凋亡因子相關(guān)基因表達(dá)的影響

肝臟組織切片表型統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表5。每組有16個(gè)樣本量，各組肝臟均出現(xiàn)不同程度的損傷，主要表型為正常肝臟、脂肪肝(空泡化細(xì)胞)和纖維化肝臟。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，YH0組有1尾顯示嚴(yán)重纖維化、7尾具有脂肪肝表型、正常樣本8尾。YH5組未見纖維化樣本，7尾顯示脂肪肝，其余9尾均正常。

表5　大口黑鱸肝臟組織切片表型統(tǒng)計(jì)

大口黑鱸肝臟組織病理切片見圖1。HE染色結(jié)果可見纖維化肝臟中大面積組織壞死，脂肪肝樣品表現(xiàn)大量空泡化細(xì)胞，核消失或移位。天狼星紅膠原纖維染色結(jié)果在纖維化樣本中可見大量紅色的膠原信號(hào)，說明均為纖維化組織。正常和脂肪肝樣本中膠原信號(hào)較低。在纖維化組織中顯示較高的激活態(tài)半胱天冬酶3(caspase 3)信號(hào)，說明該表型下細(xì)胞凋亡嚴(yán)重高于脂肪肝和正常肝臟。大口黑鱸肝臟炎癥和凋亡因子相關(guān)基因相對(duì)表達(dá)量結(jié)果(圖2)顯示，與YH0組相比，YH5組肝臟中轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)基因的相對(duì)表達(dá)量有下調(diào)的趨勢(shì)(P>0.05)，肝臟中α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和半胱天冬酶(caspase)家族基因的相對(duì)表達(dá)量各組間沒有顯著差異(P>0.05)。

3　討　論

3.1　酵母水解物對(duì)大口黑鱸生長性能的影響

本研究顯示，在飼料中添加5 g/kg的酵母水解物對(duì)大口黑鱸的成活率和增重率的影響無顯著影響，但會(huì)顯著提高魚體的蛋白質(zhì)沉積率。Oliva-Teles等[13]研究了啤酒酵母水解物在幼鱸(Dicentrarchuslabrax)飼料中部分替代魚粉對(duì)魚體生長的影響，結(jié)果表明，用30%的啤酒酵母水解物替代魚粉可以提高飼料效率及魚體蛋白質(zhì)沉積率，用50%的啤酒酵母水解物替代魚粉對(duì)幼鱸的生長沒有負(fù)面影響。Rumsey等[14]在虹鱒(Oncorhynchusmykiss)上的研究發(fā)現(xiàn)，隨著酵母提取物添加量的增加，魚體氮沉積率也隨之增加。這表明，添加一定量的酵母水解物有提高魚體蛋白質(zhì)沉積的作用。這可能是由于酵母水解物富含氨基酸和小肽，一些研究表明添加小肽之后會(huì)顯著提高魚體蛋白質(zhì)保留效率[15-16]。魚類飼料中的蛋白質(zhì)不僅為氮沉積和利用提供氨基酸的來源，而且蛋白質(zhì)中所含的小肽可以在消化道中隨著消化過程而釋放，其中具有生物活性的小肽可影響魚類消化吸收和血液循環(huán)，從而影響機(jī)體對(duì)氨基酸的吸收與利用[17]。本試驗(yàn)所用的酵母水解物含有較高水平的氨基酸(40.6%)、β-葡聚糖(17.8%)和甘露聚糖(10.5%)，有研究表明在飼料中補(bǔ)充氨基酸可以提高大口黑鱸全魚蛋白質(zhì)含量[18]。葡聚糖、甘露聚糖和核苷酸均可以通過改善腸道微生物組成和組織結(jié)構(gòu)，促進(jìn)營養(yǎng)素吸收，提高魚體免疫能力及生長性能[19-20]，從而影響魚體對(duì)蛋白質(zhì)的代謝。不同酵母水解物所含的有效成分有一定差別，除必需氨基酸外，酵母水解物的功能性物質(zhì)主要為甘露聚糖、葡聚糖和核苷酸等益生物質(zhì)。Yu等[19]確定花鱸飼料中酵母細(xì)胞壁最適添加量為500 mg/kg，其主要功能性成分葡聚糖和甘露聚糖的有效含量分別為140和120 mg/kg。本試驗(yàn)中，5 g/kg的酵母水解物中主要功能性成分β-葡聚糖和甘露聚糖含量達(dá)到890和525 mg/kg，因此酵母類產(chǎn)品在魚類飼料中應(yīng)用的過程中有效成分的含量是指導(dǎo)合理使用的前提。

A：蘇木精-伊紅染色；B：天狼星紅膠原纖維染色；C：免疫熒光法對(duì)激活態(tài)半胱天冬酶3染色(細(xì)胞凋亡信號(hào))。肝臟組織纖維化和大范圍信號(hào)凋亡(表型Ⅰ，圖B中用綠色箭頭標(biāo)記和圖C中用黃色箭頭標(biāo)記)，肝脂肪浸潤(表型Ⅱ，圖A中用紅色箭頭標(biāo)記的強(qiáng)烈空泡化)和正常組織(表型Ⅲ)。

A: hematoxylin and eosin (HE) staining; B: sirius red staining of collagen fibers; C: cleaved-caspase 3 staining (apoptosis signal) by immunofluorescence method. Hepatic fibrosis and large scale apoptosis signals (phenotype Ⅰ, marked with green arrows in figure B and yellow color signal in figure C, hepatic steatosis (phenotype Ⅱ, intense vacuoles marked with red arrows in figure A) and normal tissues (phenotype Ⅲ).

圖1大口黑鱸肝臟組織病理切片

Fig.1Histopathologic sections of liver for largemouth bass

3.2　酵母水解物對(duì)大口黑鱸血漿生化指標(biāo)的影響

血液生化指標(biāo)的檢測(cè)為魚類營養(yǎng)水平、機(jī)體代謝及疾病診斷提供重要信息，是衡量魚類健康狀況的重要參考依據(jù)[21]。本研究顯示，各組大口黑鱸血漿中TG、TC、GLU含量和AST活性均沒有顯著差異，且均在參考范圍內(nèi)。TC和TG是血液脂肪的組成成分，反映體內(nèi)膽固醇以及飼料中脂類在動(dòng)物體中吸收與代謝狀況。本試驗(yàn)結(jié)果表明，血漿中TC、TG和GLU含量均無顯著差異，表明飼料中添加5 g/kg的酵母水解物對(duì)大口黑鱸脂肪代謝和糖代謝均沒有產(chǎn)生顯著影響。MDA作為脂類物質(zhì)氧化應(yīng)激的最終產(chǎn)物，可以衡量機(jī)體內(nèi)活性氧的水平和氧化應(yīng)激的程度[22]，已有研究用MDA來反映機(jī)體受氧化損傷的程度[23-24]。本研究結(jié)果顯示，血漿中MDA含量各組之間沒有顯著差異，表明在飼料中添加5 g/kg的酵母水解物對(duì)大口黑鱸并沒有造成氧化性損傷。

數(shù)據(jù)柱上標(biāo)無字母表示差異不顯著(P>0.05)。

Data columns with no letter mean no significant difference (P>0.05).

圖2大口黑鱸肝臟炎癥和凋亡因子相關(guān)基因相對(duì)表達(dá)量

Fig.2Liver inflammatory and apoptosis factor gene relative expression levels of largemouth bass (n=14)

血漿中TBA含量和AKP活性共同升高是膽汁淤積的重要指標(biāo)，本研究中各組血漿中TBA含量沒有顯著差異，血漿中AKP活性單獨(dú)升高可能與梗阻性黃疸有關(guān)[25]。正常生理?xiàng)l件下血漿中ALT和AST活性很低，當(dāng)動(dòng)物肝細(xì)胞受損時(shí)其活性會(huì)顯著升高，升高程度與肝細(xì)胞受損程度相一致[26]，血漿中ALT和AST活性的升高可以作為肝損害和慢性肝炎的指標(biāo)[26-27]。本研究顯示，血漿中TBA含量以及ALT和AST活性各組之間均沒有顯著差異，YH5組血漿中AKP活性雖然顯著高于對(duì)照組，但并未見其他膽汁酸代謝障礙的指標(biāo)異常，飼料中添加5 g/kg酵母水解物是否會(huì)引起膽汁淤積癥尚需進(jìn)一步研究。

3.3　酵母水解物對(duì)大口黑鱸肝臟組織結(jié)構(gòu)的影響

本研究針對(duì)大口黑鱸肝臟進(jìn)行了病理學(xué)分析，從大口黑鱸的肝臟組織切片可以看出，各組的肝臟均出現(xiàn)了不同程度的損傷，對(duì)照組出現(xiàn)1尾肝臟纖維化。各組肝臟均出現(xiàn)損傷的原因可能與飼料中含有相對(duì)較高水平的碳水化合物有關(guān)。徐祥泰等[28]報(bào)道，飼料中淀粉含量高于10%即有可能導(dǎo)致大口黑鱸肝臟病變。譚肖英等[29]報(bào)道，大口黑鱸飼料中含有15%～23%的碳水化合物主要影響大口黑鱸內(nèi)臟器官的相對(duì)質(zhì)量及肝臟的營養(yǎng)成分組成。

通常認(rèn)為組織的纖維化是由于正常傷口愈合失敗所導(dǎo)致的[30]。組織受損后，需要形成新的結(jié)締組織，在此過程中需要成纖維細(xì)胞的活化、增殖并遷移到傷口處[31]。處于損傷處的成纖維細(xì)胞是由特定的肌成纖維細(xì)胞形成的，而肌成纖維細(xì)胞在α-SMA中高表達(dá)，成纖維細(xì)胞可以使損傷處愈合，肌成纖維細(xì)胞存在于纖維化病變過程中，會(huì)導(dǎo)致組織的纖維化[30]。此外，組織的損傷愈合是在一系列促纖維化細(xì)胞因子與抗纖維化細(xì)胞因子相互作用下完成的，主要包括轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)和TNF-α等[32]。在組織損傷愈合的過程中促炎因子TNF-α在巨噬細(xì)胞中表達(dá)[33]。肝癌患者的肝組織中TNF-α陽性細(xì)胞數(shù)量增加，預(yù)示著TNF-α可能會(huì)促進(jìn)肝臟的纖維化[34]。肝臟的纖維化是由一系列刺激引起的慢性炎癥反應(yīng)的結(jié)果，包括持續(xù)性感染、自身免疫反應(yīng)、化學(xué)損傷、組織損傷和氧化應(yīng)激，其中氧化應(yīng)激會(huì)提高線粒體通透性并促進(jìn)肝細(xì)胞損傷和肝臟纖維化[35]。此外，TNF-α可以導(dǎo)致肝細(xì)胞凋亡并引起肝細(xì)胞損傷或肝臟癌癥[36]。TGF-β1可以抑制多種類型細(xì)胞的生長與分化，調(diào)節(jié)免疫和炎癥反應(yīng)，調(diào)節(jié)傷口愈合[37]。TGF-β1抑制促炎反應(yīng)，被認(rèn)為是一種抗炎因子[38]。有研究表明TGF-β1的下調(diào)抑制肝臟干細(xì)胞的活化和肝臟纖維化的發(fā)展[39]。

caspase家族是通過調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)來維持體內(nèi)平衡的重要基因家族，其中凋亡通路通常分為外在途徑和內(nèi)在途徑的細(xì)胞凋亡。外在細(xì)胞凋亡途徑的激活是通過將配體綁定在死亡結(jié)構(gòu)域上，例如TNF-α超家族及其受體，從而激活半胱蛋白酶8(caspase 8)和半胱蛋白酶10(caspase 10)，通過啟動(dòng)caspase 3啟動(dòng)細(xì)胞凋亡[40]。內(nèi)在細(xì)胞凋亡途徑被稱為線粒體凋亡。首先，有利于線粒體通透性的氧化應(yīng)激誘導(dǎo)線粒體功能障礙[41]。線粒體功能障礙在凋亡信號(hào)通路中發(fā)揮著重要作用，伴隨著凋亡信號(hào)通路ROS的增強(qiáng)，導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化物的積累和細(xì)胞色素C釋放到細(xì)胞質(zhì)中[42]。然后，通過各種細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)激活半胱氨酸蛋白酶9(caspase 9)，線粒體細(xì)胞凋亡途徑被激活。最后，活化的caspase 9通過激活啟動(dòng)肝細(xì)胞凋亡和纖維化，切割和激活caspase 3[40]。本研究中，因只有1個(gè)樣本存在明顯的凋亡信號(hào)，2組大口黑鱸脂肪肝樣本發(fā)生幾率一致，且尚未觀察到大量的凋亡細(xì)胞，這可能是2組間在炎癥和凋亡通路相關(guān)基因表達(dá)方面沒有顯著差異的主要原因。YH5組肝臟中TGF-β1的相對(duì)表達(dá)量較對(duì)照組有下調(diào)的趨勢(shì)，可能是該組未見纖維化樣本的原因之一。

4　結(jié)　論

在大口黑鱸飼料中添加5 g/kg的酵母水解物可促進(jìn)大口黑鱸魚體蛋白質(zhì)沉積，并有降低肝細(xì)胞纖維化風(fēng)險(xiǎn)的趨勢(shì)。