飼糧蛋白質(zhì)水平及纖維來源對生長豬盲腸液特性的影響

黨方昆　趙　峰*　高理想　高慶濤　王　亞　張　虎　趙江濤　張宏?！⊥踅ū?/p>

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，動物營養(yǎng)學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193；2.廣東溫氏食品集團(tuán)股份有限公司，新興 527400)

生長豬的大腸長度一般在3.5～6.0 m，食糜在其大腸內(nèi)的停留時(shí)間在18 h以上。大腸對高纖維飼料原料養(yǎng)分的消化有顯著貢獻(xiàn)。因此，在豬的模擬消化研究中，探討大腸的消化生理非常重要。盲腸位于大腸前段，占大腸總長度的7%～8%，是大腸微生物生長、結(jié)構(gòu)性碳水化合物消化的重要場所。生長豬盲腸內(nèi)容物中微生物的濃度約為2.37×1010CFU/g[1]，其自身代謝或分泌的碳水化合物酶、蛋白酶可降解未被小腸消化吸收的飼糧成分。研究表明，生長豬盲腸對飼糧有機(jī)物的消化率達(dá)11.7%以上，占整個大腸消化率的90%[2]。通過飼糧的營養(yǎng)成分可誘導(dǎo)盲腸微生物種群的變化[3]，從而影響飼糧養(yǎng)分的消化。如低蛋白質(zhì)飼糧可以顯著提高豬腸道中厚壁菌門與擬桿菌門的比例，進(jìn)而影響糞便中短鏈脂肪酸和生物胺的濃度[4]。豬盲腸微生物在體外對高蛋白質(zhì)飼糧消化后，可以顯著提高氨態(tài)氮、菌體蛋白和短鏈脂肪酸的含量[5]。飼糧的纖維來源影響了盲腸食糜中普氏菌屬、乳酸桿菌屬、瘤胃球菌屬、擬桿菌屬等微生物多樣性，從而影響纖維素酶、果膠酶、β-葡聚糖酶、木聚糖酶等非淀粉多糖酶的活性[6-7]。由此可見，飼糧的蛋白質(zhì)水平及纖維來源對豬盲腸液的特性有明顯的影響。而探討不同飼糧營養(yǎng)水平條件下生長豬盲腸液酶活性及水解能力的差異是制備模擬盲腸液的生物學(xué)依據(jù)。為此，本研究通過活體采集盲腸食糜分別比較2個粗蛋白質(zhì)水平飼糧和2個纖維來源飼糧條件下生長豬盲腸液組成成分與水解特性的差異，為生長豬大腸模擬消化過程提供基礎(chǔ)參數(shù)。

1　材料與方法

1.1　試驗(yàn)動物及管理

選取遺傳背景相近、胎次相同、初始體重為(20.05±1.87) kg的杜×長×大三元雜交去勢公豬12頭，于代謝籠中單籠飼養(yǎng)。適應(yīng)1周后在盲腸末端(回盲結(jié)合處后10 cm)安裝T型瘺管，術(shù)后飼養(yǎng)于代謝籠內(nèi)，按常規(guī)護(hù)理3周，待瘺管豬恢復(fù)健康后開始正式試驗(yàn)[8]。適應(yīng)期和護(hù)理期飼喂生長豬基礎(chǔ)飼糧。試驗(yàn)1、試驗(yàn)2結(jié)束時(shí)試豬體重分別為(62.59±3.87) kg和(80.08±4.52) kg。

1.2　豬試驗(yàn)飼糧與回腸末端食糜

基礎(chǔ)飼糧和試驗(yàn)飼糧根據(jù)NRC(2012)中20～60 kg生長豬營養(yǎng)需要量推薦標(biāo)準(zhǔn)配制，飼糧1～4是試驗(yàn)1、試驗(yàn)2中的試驗(yàn)飼糧，分別為高蛋白質(zhì)飼糧、低蛋白質(zhì)飼糧、玉米-大豆皮飼糧、玉米-小麥麩飼糧(表1)，飼糧5和6為實(shí)驗(yàn)室前期另一個試驗(yàn)中配制的玉米-豆粕配合飼糧?；啬c凍干食糜1和2分別為生長豬飼喂飼糧5和6后收集的回腸食糜制備成的凍干物。

1.3　試驗(yàn)設(shè)計(jì)

本研究分3個部分進(jìn)行，其中試驗(yàn)1考察飼糧蛋白質(zhì)水平(粗蛋白質(zhì)含量分別為19.03%和13.96%)對生長豬盲腸液組成的影響。采用兩樣本完全隨機(jī)設(shè)計(jì)，將12頭在盲腸安裝瘺管的生長豬按體重隨機(jī)分為2組，每組6個重復(fù)，每個重復(fù)1頭豬，分別飼喂飼糧1和飼糧2。試驗(yàn)2在試驗(yàn)1結(jié)束并經(jīng)過10 d恢復(fù)期后考察飼糧的纖維來源(分別為大豆皮和小麥麩)對生長豬盲腸液組成的影響，試驗(yàn)設(shè)計(jì)同試驗(yàn)1，2組平均體重?zé)o顯著差異的試驗(yàn)豬分別飼喂飼糧3和飼糧4。試驗(yàn)1、試驗(yàn)2的預(yù)試期均為5 d，正試期均為10 d，期間每天08:00和16:00拌濕飼喂試驗(yàn)飼糧。為了消除采食量差異對試驗(yàn)豬的影響，按照體重的4%進(jìn)行投喂，自由飲水。其他管理按照動物營養(yǎng)學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室常規(guī)程序進(jìn)行。正試期前5 d為糞樣收集期，后5 d為隔日采集盲腸食糜樣品。試驗(yàn)3在試驗(yàn)1和試驗(yàn)2獲得豬盲腸食糜的基礎(chǔ)上考察盲腸液的來源與飼糧底物對還原糖釋放量的影響。采用4×8兩因素完全隨機(jī)設(shè)計(jì)，盲腸液來源設(shè)4個處理，分別為高蛋白質(zhì)飼糧(飼糧1)組收集的腸液(A)、低蛋白質(zhì)飼糧(飼糧2)組收集的腸液(B)、玉米-大豆皮飼糧(飼糧3)組收集的腸液(C)、玉米-小麥麩飼糧(飼糧4)組收集的腸液(D)；底物為8個處理包括飼糧1～6和2種回腸凍干食糜。每個處理5個重復(fù)，每個重復(fù)1根消化管，測定還原糖的釋放量。

1.4　樣品采集

試驗(yàn)1、試驗(yàn)2在試驗(yàn)第6天的09:00至第11天的09:00進(jìn)行全收糞，每日糞樣取樣后混合均勻，65 ℃烘干后回潮24 h，根據(jù)四分法取樣并儲存于-20 ℃中。在試驗(yàn)第11、13、15天09:30—10:30、13:30—14:30、17:30—18:30，采用自制的帶有低溫冷存功能的采樣袋從瘺管處連續(xù)收集食糜樣品，在每個時(shí)間段收集完成以后將每頭豬的腸液樣品按收集體積的比例混合均勻，取樣40 mL并立即于4 ℃、1 250×g離心10 min，將上清液混合均勻后分裝于1.5 mL離心管中，-80 ℃保存待測酶活性。每頭豬其余食糜樣品經(jīng)類似處理獲得腸液后，按飼糧處理將組內(nèi)試驗(yàn)豬的盲腸液等體積混勻，分裝到50 mL離心管中備用。

表1　試驗(yàn)飼糧組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

1)每千克飼糧中含有One kg of diet supplies：VA 8 250 IU，VD3825 IU，VE 40 IU，VK34 mg，VB11.0 mg，VB25 mg，VB62 mg，VB1225 μg，泛酸 pantothenic acid 15.0 mg，煙酸 nicotinic acid 35.0 mg，葉酸 folic acid 2 mg，生物素 biotin 4 mg，氯化膽堿 choline choride 600 mg，Cu 50.0 mg，F(xiàn)e 80.0 mg，Zn 100.0 mg，Mn 25.0 mg，Se 0.15 mg，I 0.5 mg。

2)粗蛋白質(zhì)和粗纖維為實(shí)測值，其余為計(jì)算值。CP and CF are determined values, while the other nutrient levels are calculated values.

1.5　測定指標(biāo)與方法

盲腸食糜干物質(zhì)含量的測定：先稱量鮮食糜的重量，然后在65 ℃烘干至無水痕后，再按照GB/T 6435—2006測定計(jì)算干物質(zhì)含量[9]。使用Sartorius PB-10 pH計(jì)在39 ℃恒溫水浴條件下測定腸液的pH。纖維素酶、木聚糖酶、β-葡聚糖酶的活性測定分別參考NY/T 912—2004、GB/T 23874—2009、NY/T 911—2004的方法進(jìn)行。淀粉酶活性參考Dahlqvist[10]的方法進(jìn)行測定。酸性蛋白酶、中性蛋白酶活性的測定參考GB/T 28715—2012的方法進(jìn)行。

盲腸液對飼糧及食糜的還原糖釋放量根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室制定的《單胃動物仿生消化系統(tǒng)操作手冊》(第三版)，在第3代仿生消化系統(tǒng)的立式消化模塊測定。上樣量0.5 g，盲腸液10 mL，消化結(jié)束后將消化管中分解物準(zhǔn)確轉(zhuǎn)移到100 mL容量瓶中，定容后用0.22 μm濾膜過濾，用雙光束紫外分光光度計(jì)在530 nm波長下測定還原糖的釋放量(以葡萄糖計(jì))。

1.6　數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

利用SAS 9.0的MEANS模塊計(jì)算消化酶活性、飼糧養(yǎng)分消化率的基本統(tǒng)計(jì)量。采用t-test模塊對試驗(yàn)1、試驗(yàn)2消化酶活性和飼糧養(yǎng)分消化率的差異進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。試驗(yàn)3利用SAS 9.0的GLM模塊進(jìn)行兩因素方差分析，采用Duncan氏法對均值進(jìn)行多重比較。采用CORR模塊分析盲腸液中消化酶活性與還原糖釋放量的相關(guān)關(guān)系。數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P≤0.05表示差異顯著。

2　結(jié)果與分析

2.1　飼糧類型對生長豬盲腸食糜特性和養(yǎng)分消化率的影響

由表2可知，低蛋白質(zhì)飼糧組豬盲腸食糜的干物質(zhì)含量顯著地高于高蛋白質(zhì)飼糧組(P=0.05)，而玉米大豆皮飼糧組與玉米小麥麩飼糧組在盲腸食糜的干物質(zhì)含量上差異不顯著(P>0.05)。試驗(yàn)1、試驗(yàn)2中飼糧處理對豬盲腸液pH以及纖維素酶、木聚糖酶、葡聚糖酶、中性蛋白酶、酸性蛋白酶和淀粉酶活性的影響均無顯著差異(P>0.05)。試驗(yàn)1中高蛋白質(zhì)飼糧組的干物質(zhì)、總能、粗蛋白質(zhì)和粗纖維的消化率均顯著高于低蛋白質(zhì)飼糧組(P<0.05)。試驗(yàn)2中玉米大豆皮飼糧組的粗纖維消化率顯著地高于玉米小麥麩飼糧組(P<0.05)，而兩者在干物質(zhì)、總能、粗蛋白質(zhì)的消化率上無顯著性差異(P>0.05)。

表2　豬飼喂4種飼糧后盲腸食糜的特性及養(yǎng)分消化率

2.2　生長豬盲腸液來源與底物對消化后還原糖釋放量的影響

由表3可知，盲腸液來源和底物對還原糖釋放量均有顯著的影響(P<0.05)，且兩者對還原糖釋放量有顯著的互作效應(yīng)(P<0.05)。在6個飼糧底物中，盲腸液消化底物后還原糖釋放量的差異為玉米-大豆皮飼糧腸液>玉米-小麥麩飼糧腸液>低蛋白質(zhì)飼糧腸液>高蛋白質(zhì)飼糧腸液；而盲腸液對回腸食糜1和食糜2的還原糖釋放量差異分別為玉米-大豆皮飼糧腸液>高蛋白質(zhì)飼糧腸液>低蛋白質(zhì)飼糧腸液>玉米-小麥麩飼糧腸液以及玉米-大豆皮飼糧腸液>高蛋白質(zhì)飼糧腸液>玉米-小麥麩飼糧腸液>低蛋白質(zhì)飼糧腸液。在8種底物中，飼糧6的還原糖平均釋放量達(dá)到352 mg/g，顯著高于其他底物(P<0.05)，其他5種飼糧底物的還原糖釋放量在250～296 mg/g變化，組間存在顯著差異(P<0.05)；而2個回腸食糜的還原糖釋放量均為51 mg/g，顯著低于飼糧底物(P<0.05)。

表3　生長豬盲腸液來源對飼糧和食糜還原糖釋放量的影響

同一行(盲腸液平均值)或列(底物平均值)的數(shù)據(jù)肩標(biāo)字母不同表示顯著差異(P<0.05)，字母相同表示無顯著差異(P>0.05)。

In the same row (mean of cecal fluid) or column (mean of substrate), values with different letter superscripts mean significant difference (P<0.05), while with the same letter superscripts mean no significant difference (P>0.05).

2.3　生長豬盲腸液消化酶活性與底物還原糖釋放量的相關(guān)性

從生長豬盲腸液中消化酶活性與底物還原糖釋放量的相關(guān)關(guān)系看(表4)，6個飼糧的還原糖釋放量與木聚糖酶、葡聚糖酶、中性蛋白酶和淀粉酶活性均有顯著相關(guān)關(guān)系(r≥0.74；P<0.05)，而與纖維素酶和酸性蛋白酶活性無顯著相關(guān)關(guān)系(|r|≤0.49；P>0.05)?；啬c食糜1的還原糖釋放量與木聚糖酶和淀粉酶活性顯著正相關(guān)(r≥0.58；P<0.05)，與酸性蛋白酶活性有顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0.79；P<0.05)，而與纖維素酶、葡聚糖酶和中性蛋白酶活性無顯著相關(guān)性(r≤0.19；P>0.05)。而回腸食糜2與纖維素酶、木聚糖酶、葡聚糖酶、中性蛋白酶和淀粉酶活性顯著相關(guān)(|r|≥0.51；P<0.05)，與酸性蛋白酶活性無顯著相關(guān)(r=-0.16；P>0.05)。

3　討　論

3.1　飼糧的原料組成對生長豬盲腸液成分的影響

飼糧在生長豬體內(nèi)經(jīng)胃、小腸消化后，淀粉、脂肪、氨基酸的消化率分別在97%、87%、83%以上[11-13]，而粗纖維的消化率在25%以下變化[14]。這表明，進(jìn)入大腸內(nèi)的底物是以飼料植物細(xì)胞壁為主要成分，兼含少量的抗性淀粉和未消化的飼糧、腸壁脫落蛋白質(zhì)。本試驗(yàn)得出生長豬采食高蛋白質(zhì)飼糧和低蛋白質(zhì)飼糧后盲腸食糜中干物質(zhì)含量為9.2%～10.4%，采食玉米-大豆皮飼糧和玉米-小麥麩飼糧后盲腸食糜中干物質(zhì)含量為9.9%～10.4%，略低于孫巍巍等[5]通過屠宰法獲得的豬盲腸食糜干物質(zhì)含量為13.68%的結(jié)果，這可能是食糜采集方法不同引起的。然而，豬飼喂高蛋白質(zhì)飼糧與低蛋白質(zhì)飼糧相比，盲腸食糜中水分的含量更高。這可能是高蛋白質(zhì)飼糧增加了腸道中揮發(fā)性脂肪酸、氨、酚類以及吲哚類物質(zhì)的含量，從而使腸道食糜的滲透壓更高，系水性更強(qiáng)[5，15]。豬腸道的緩沖能力隨日齡增長趨于穩(wěn)定，達(dá)31日齡時(shí)盲腸內(nèi)容物的pH已穩(wěn)定在6.40～6.48[16]。本試驗(yàn)得出盲腸液pH為6.43～6.62，而且飼糧的蛋白質(zhì)水平與纖維來源對盲腸液pH均無顯著影響，這表明豬盲腸對進(jìn)入其內(nèi)的底物具有較強(qiáng)的緩沖能力，該結(jié)果與鐘永興[17]的報(bào)道一致。在飼糧底物與盲腸液酶活性的關(guān)系上，Morita等[18]和Liu等[19]發(fā)現(xiàn)增加飼糧中抗消化的蛋白質(zhì)水平可以增加進(jìn)入盲腸的底物含量，提高盲腸中總揮發(fā)性脂肪酸產(chǎn)生量；Rist等[20]也表明飼糧中蛋白質(zhì)水平可以影響豬后腸丁酸的產(chǎn)生量，進(jìn)而改變盲腸中微生物的組成，而飼糧中蛋白質(zhì)的水平對豬盲腸液消化酶活性的影響還未見相關(guān)報(bào)道。另外，在纖維類底物濃度較低時(shí)，難以檢測到飼糧纖維水平對生長豬盲腸液中碳水化合物酶活性的影響，而在纖維類底物濃度較高的條件下，生長豬大腸內(nèi)菌群的數(shù)量會顯著增加[21-22]，并且高纖維水平會凸顯飼糧纖維來源對豬盲腸食糜纖維素酶活性的影響[23]。本試驗(yàn)中，飼糧的蛋白質(zhì)水平與纖維來源均未影響盲腸液的水解酶活性，這主要是由于在當(dāng)前的營養(yǎng)需要量下配制的飼糧粗蛋白質(zhì)水平的差異以及中性洗滌纖維(NDF)含量低于15%時(shí)，纖維來源的差異經(jīng)過胃、小腸的消化后在盲腸食糜中底物濃度的差異變小，不足以引起微生物產(chǎn)生的水解酶活性有統(tǒng)計(jì)顯著性差異。這一結(jié)果與高理想[24]報(bào)道生長豬飼喂NDF含量低于20%的4種飼糧時(shí)，豬盲腸食糜中纖維素酶、木聚糖酶和葡聚糖酶活性沒有顯著差異相一致。

表4　盲腸液中消化酶活性與飼糧或回腸食糜還原糖釋放量的簡單相關(guān)關(guān)系

*表示顯著相關(guān)(P<0.05)。* means significant correlation (P<0.05).

3.2　生長豬盲腸液對飼糧及回腸末端食糜消化能力的差異

豬盲腸液中含有多種水解酶。若以目前飼用酶制劑的推薦添加量為參考制備模擬消化液[25-26]，則盲腸液的非淀粉多糖酶、蛋白酶的活性遠(yuǎn)高于這些外源飼用酶在飼糧中添加的活性濃度。雖然本試驗(yàn)中生長豬飼喂不同飼糧后盲腸液中水解酶的活性并無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但多種水解酶小微的差異組合在一起可能會導(dǎo)致消化能力的差異。Knudsen等[11]發(fā)現(xiàn)，當(dāng)生長豬飼喂不同β-葡聚糖含量的飼糧時(shí)，大腸對飼糧纖維及碳水化合物的消化率呈線性增加。J?rgensen等[27]研究表明，生長豬采食低纖維飼糧和高纖維飼糧時(shí)，大腸對進(jìn)入其內(nèi)的干物質(zhì)消化率分別為45.9%和64.7%，非淀粉多糖的消化率分別為55.9%和75.0%。這表明豬大腸對其內(nèi)容物的消化能力受飼糧成分的影響。體外模擬消化也表明，豬大腸階段模擬中添加不同的非淀粉多糖酶，飼糧的干物質(zhì)和能量消化率均存在顯著差異[28]。本試驗(yàn)采集的豬盲腸液僅經(jīng)解凍、離心，保留了原腸液95%以上的酶活性，對底物消化后還原糖的釋放量表達(dá)了盲腸液對碳水化合物的水解能力。不同來源的盲腸液顯著地影響了其對飼糧的水解能力，而且該水解能力與盲腸液中木聚糖酶、葡聚糖酶、淀粉酶及中性蛋白酶的活性相關(guān)。在所檢測的6種水解酶中，飼喂高蛋白質(zhì)飼糧的豬盲腸液有5種水解酶的活性最低，而飼喂玉米-大豆皮飼糧的豬盲腸液有5種水解酶的活性最高，這2種盲腸液對6個飼糧的水解能力與此對應(yīng)。這表明盲腸液中多種水解酶小微的變化組合在一起放大了水解能力的明顯差異。而2種盲腸液對回腸末端食糜的水解能力均與木聚糖酶及淀粉酶的活性相關(guān)，這與豬飼喂玉米-豆粕飼糧后回腸末端食糜中木聚糖以及抗性淀粉的含量有關(guān)。此外，盲腸液對6種飼糧的水解能力遠(yuǎn)高于對2種回腸末端食糜的水解能力，這是由于回腸末端食糜是飼糧經(jīng)過了胃和小腸的消化，大部分營養(yǎng)物質(zhì)被分解吸收，從而減少了盲腸液中水解酶的作用對象。

4　結(jié)　論

① 飼糧蛋白質(zhì)水平顯著地影響豬盲腸食糜的干物質(zhì)含量，對盲腸液pH和水解酶活性無顯著影響；飼料纖維來源對盲腸食糜干物質(zhì)含量、pH及水解酶活性均無顯著影響。

② 生長豬飼喂不同飼糧后，盲腸液的消化能力有顯著差異。盲腸液中木聚糖酶、葡聚糖酶、中性蛋白酶及淀粉酶活性影響了對飼糧的消化能力，而木聚糖酶與淀粉酶活性影響了對回腸末端食糜的消化能力。