番茄部分WRKY基因非生物脅迫表達(dá)和SlWRKY50基因沉默分析

陳青奇，張　紅，姜景彬，李景富

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝園林學(xué)院，哈爾濱　150030）

植物受外界刺激，體內(nèi)形成信號傳遞過程，誘導(dǎo)植物相關(guān)防御基因表達(dá)，抵御不良環(huán)境影響，轉(zhuǎn)錄因子在此過程中具有重要作用。近年來，轉(zhuǎn)錄因子防護(hù)反應(yīng)和逆境脅迫應(yīng)答反應(yīng)方面研究日益深入。Yang等研究發(fā)現(xiàn)，部分轉(zhuǎn)錄因子與植物抗逆性相關(guān)，轉(zhuǎn)錄因子可激活或促進(jìn)下游基因表達(dá)，使植物獲得抗性[1]。

隨功能基因組學(xué)研究不斷深入，基因芯片等高通量技術(shù)鑒定基因表達(dá)特性方法廣泛應(yīng)用于植物非生物脅迫基因表達(dá)研究，鑒定多種與非生物脅迫相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子[2-3]。WRKY基因家族是植物最大轉(zhuǎn)錄因子家族之一[4-6]，廣泛參與生物、非生物脅迫應(yīng)答反應(yīng)，并在信號分子傳遞及植物衰老和體細(xì)胞胚發(fā)育方面發(fā)揮重要作用[7]。WRKY轉(zhuǎn)錄因子含有一段大約由60個(gè)高度保守氨基酸殘基組成的多肽序列，被稱為WRKY結(jié)構(gòu)域，其N-末端含有7個(gè)標(biāo)志性氨基酸殘基WRKYGQK[8-9]。另外，WRKY轉(zhuǎn)錄因子DNA結(jié)合域一般均含一個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)。根據(jù)轉(zhuǎn)錄因子所含WRKY結(jié)構(gòu)域數(shù)量和鋅指結(jié)構(gòu)特征，一般將WRKY轉(zhuǎn)錄因子分為3大類[10]：第Ⅰ類含2個(gè)WRKY結(jié)構(gòu)域，且鋅指結(jié)構(gòu)類型屬C2H2型；第Ⅱ類僅含1個(gè)WRKY結(jié)構(gòu)域，鋅指結(jié)構(gòu)為C2H2型，大部分WRKY轉(zhuǎn)錄因子均屬該類型；第Ⅲ類僅含1個(gè)WRKY結(jié)構(gòu)域，鋅指結(jié)構(gòu)為C2-HC型。首先在甜薯中發(fā)現(xiàn)第一個(gè)WRKY轉(zhuǎn)錄因子，目前證實(shí)多種植物均參與非生物脅迫反應(yīng)，部分WRKY基因參與多種脅迫應(yīng)答[11-13]。番茄中發(fā)現(xiàn)有81個(gè)WRKY基因家族成員[14]。

非生物脅迫下主要通過表達(dá)譜分析WRKY轉(zhuǎn)錄因子，Seki等研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥在干旱、寒冷、高鹽條件下，40個(gè)轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)上調(diào)，其中4個(gè)是WRKY轉(zhuǎn)錄因子，分別是At1g80840、At2g30250、At5g13080和At4g18170[15]。Ramamoorthy等利用qRT-PCR方法分析水稻W(wǎng)RKY基因家族在低溫、干旱、鹽及激素處理?xiàng)l件下變化發(fā)現(xiàn)，發(fā)現(xiàn)16個(gè)WRKY基因響應(yīng)低溫脅迫，但其中僅有1個(gè)基因表達(dá)上調(diào)；19個(gè)WRKY基因響應(yīng)干旱脅迫，基因全部表達(dá)上調(diào)；27個(gè)WRKY基因響應(yīng)鹽脅迫，其中26個(gè)基因表達(dá)上調(diào)[16]。仇玉萍等利用Northern雜交方法分析13個(gè)水稻W(wǎng)RKY基因在非生物脅迫（高鹽、4℃低溫和42℃高溫）下應(yīng)答反應(yīng)，其中9個(gè)WRKY基因表達(dá)均受到3種脅迫影響，而OsWRKY9、Os-WRKY21、OsWRKY24和OsWRKY30這4個(gè)WRKY基因不受誘導(dǎo)[17]。

本研究通過番茄WRKY基因家族生物信息學(xué)分析，選取6個(gè)WRKY基因SlWRKY13、SlWRKY24，SlWRKY31、 SlWRKY50、 SlWRKY62、 SlWRKY63，分析低溫、干旱、鹽脅迫處理?xiàng)l件下葉片表達(dá)量差異，通過比較不同處理不同時(shí)間基因表達(dá)量變化，分析基因在逆境環(huán)境下應(yīng)答情況。對逆境脅迫應(yīng)答分析中表達(dá)量變化較顯著基因作基因沉默分析，基因沉默后，檢測低溫脅迫條件下MDA、Pro和SOD指標(biāo)變化，為進(jìn)一步研究WRKY基因家族功能提供參考及理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1　材料

1.1.1植物材料

醋栗番茄（LA2184）由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝園林學(xué)院番茄研究所提供。

1.1.2主要試劑

主要試劑：TRIZOL、EasyTaq酶、cDNA第一鏈合成試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒購自全式金公司，Maker DNA Marker購自天根生物科技有限公司，其他化學(xué)試劑為國產(chǎn)分析純，AceQ qPCR（SYBR Green Master Mix）購自Vazume，氨卞青霉素（Ampicillin，Amp）、卡拉霉素（Kanamycin，Kan）、利福平（Rifampin，Rif）均購自 TaKaRa公司。主要載體及菌株：限制性內(nèi)切酶XbaⅠ、Bam HⅠ和T4DNA連接酶購自Fermantas公司，pTRV1、pTRV2、大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α、農(nóng)桿菌（Agrobactterium tumefaciens）LBA4404為東北農(nóng)業(yè)大學(xué)番茄研究所保存。

1.2　方法

1.2.1番茄WRKY基因非生物脅迫條件下表達(dá)模式分析

1.2.1.1不同逆境條件下材料處理及制備

醋栗番茄（LA2184）于2016年2月10日種植于東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝實(shí)驗(yàn)站溫室，取4葉期幼苗用于逆境脅迫試驗(yàn)處理。低溫脅迫試驗(yàn)中，選取生長狀態(tài)和植株大小一致4葉期幼苗6棵，置于5℃人工氣候箱中（Conviron，Canada），每隔0、1、3、6、12、24 h取葉片；高鹽脅迫試驗(yàn)中，選取生長狀態(tài)和植株大小一致4葉期醋栗番茄幼苗6棵，置于 0.2 mmol·L-1NaCl溶液中，每隔 0、1、3、6、12、24 h取葉片；干旱脅迫試驗(yàn)中，選取生長狀態(tài)和植株大小一致4葉期幼苗6棵，置于20%PEG中，每隔0、1、3、6、12、24 h取葉片。取完葉片后立即置于-80℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆?。試?yàn)重復(fù)3次。

1.2.1.2RNA提取

采用Trizol法提取RNA。

1.2.1.3反轉(zhuǎn)錄和gDNA去除

根據(jù)RNA濃度調(diào)整反轉(zhuǎn)錄用量，保證反轉(zhuǎn)錄后濃度一致。使用全式金公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒，根據(jù)全式金公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明操作：

（1）在去除RNAse離心管中配制以下反轉(zhuǎn)錄混合液，冰上操作。Total RNA 100 ng～5 μg：Anchored Oligo（dT）18Primer（0.5 μg·μL-1）1 μL，2×TS Reaction Mix 10 μL，TransScript RT/RI Enzyme Mix 1 μL，gDNA Remover 1 μL，RNase-free Water to 20 μL。

（2）混勻離心，產(chǎn)物用于qPCR，42℃孵育反轉(zhuǎn)錄15 min，產(chǎn)物用于PCR，42℃孵育反轉(zhuǎn)錄30 min，85℃加熱5 s失活TransScript RT/RI Enzyme Mix和gDNA Remover。

1.2.1.4qRT-PCR檢測脅迫條件下WRKY基因表達(dá)

本試驗(yàn)選取6個(gè)WRKY基因（SlWRKY13、Sl-WRKY-24、SlWRKY31、SlWRKY50、SlWRKY62 和SlWRKY63），運(yùn)用qRT-PCR方法檢測醋栗番茄不同時(shí)間不同脅迫條件下采集葉片作表達(dá)情況，運(yùn)用SYBR Green I法作熒光定量PCR。以番茄肌動(dòng)蛋白基因Actin（基因登陸號U60480.1）為內(nèi)參基因。Actin引物作qRT-PCR檢測CT值，使CT值落在20～28。為更準(zhǔn)確檢測基因表達(dá)量變化，每個(gè)樣品設(shè)置3次重復(fù)，未添加模板和未反轉(zhuǎn)錄RNA為模板的反應(yīng)作為陰性對照（No template control，NTC）。利用qRT-PCR軟件作溶解曲線分析，出現(xiàn)單峰時(shí)表示結(jié)果可靠。SYBR Green I試劑應(yīng)避光保存，為保持其活性，在冰上加樣操作，盡量縮短操作時(shí)間，減小非特異擴(kuò)增，避免產(chǎn)生氣泡，保證加樣量準(zhǔn)確性，加樣后用低速離心機(jī)充分混勻。

使用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)熒光定量PCR引物，設(shè)計(jì)6個(gè)SlWRKY基因引物（見表1）。使用iQ5實(shí)時(shí)PCR檢測系統(tǒng)（Bio-Rad，USA）反應(yīng)。反應(yīng)程序?yàn)?5℃ 10 min，40×（95℃5 s，59℃15 s，72℃30 s）。溶解曲線分析采用95℃條件下15 s，55℃15 s，每循環(huán)緩慢升溫0.5℃至95℃，伴隨熒光采集。通過所得CT值計(jì)算基因相對表達(dá)量，數(shù)據(jù)分析采用2-△△CT法。

表1　WRKY基因引物Table 1　WRKY genes primer

1.2.2番茄WRKY基因沉默分析

1.2.2.1SlWRKY50-TRV2和PDS-TRV2載體構(gòu)建基因

①RNA提取同1.2.1.2，反轉(zhuǎn)錄同1.2.1.3。

②VIGS引物設(shè)計(jì)：根據(jù)SGN上SlWRKY50（Solyc07g005650.2.1）基因登陸mRNA序列，運(yùn)用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)PCR引物，加XbaⅠ和Bam HⅠ內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)。

由華大基因公司合成：SlWRKY50-F：5'GCTCTAGATCAGCAGCAGG AGGTGAATA 3'XbaⅠ，Sl-WRKY50-R：5'CGC GGATCCCGGTCCAAATGTTACTAACTTTTCC3'Bam HⅠ。

③PDS和SlWRKY50片段擴(kuò)增

反應(yīng)體系：Template（cDNA）2 μL，10×Trans Taq HiFi BufferⅡ 5 μL，dNTPs（2.5 mmol·L-1）4 μL，Primer-F（10 μmol·L-11 μL，Primer-R（10 μmol·L-1）1 μL，10×Trans Taq HiFi DNA Polymerase 1 μL，ddH2O 36 μL，總體積50 μL。

反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，65℃復(fù)性30 s,72℃延伸30 s，擴(kuò)增35個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min，置于4℃保存。1%瓊脂糖凝膠電泳，80～120 V，20 min；凝膠成像系統(tǒng)觀察條帶情況。

④片段產(chǎn)物PCR純化：使用DNA純化試劑盒純化目標(biāo)片段PDS和SlWRKY50。

⑤純化后目標(biāo)片段雙酶切

酶切反應(yīng)體系如下：PCR純化產(chǎn)物16 μL，10×Tango Buffer 2 μL，Bam HⅠ 1 μL，XbaⅠ 1 μL混勻，稍離心，37℃酶切3～4 h，純化，-80℃存放備用。

⑥TRV2載體制備

將攜帶pTRV2載體大腸桿菌DH5α在LB（50 μg mL-1Kan）平板培養(yǎng)基上劃線，37℃條件下恢復(fù)培養(yǎng)，至平板出現(xiàn)1 mm菌落時(shí)，挑取單菌落，接種于 5 mL LB（50 μg·mL-1Kan）液體培養(yǎng)基中，37℃，220 r·min-1條件下震蕩培養(yǎng)12 h，使用質(zhì)粒提取試劑盒提取空載體pTRV2，然后pTRV2雙酶切及特異片段膠回收。

⑦目的片段與載體連接

將準(zhǔn)備好的酶切載體與目的基因片段SlWRKY50用T4連接酶連接。連接體系：Vector 3 μL，insert fragment 10 μL，T4-ligase（5 U·μL-1）1 μL，10×Tango Buffer 2 μL，加ddH2O到20 μL，22 ℃條件連接4 h。

⑧連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5

取無菌1.5 mL離心管，每管依次加入10 μL質(zhì)粒DNA，50 μL大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞懸浮液，槍頭反復(fù)吸取混勻。冰浴30 min；放入42℃水浴鍋90 s；冰浴2 min。加入300 μL LB，置于37℃搖床200 r·min-1溫育3～4 h使細(xì)菌復(fù)蘇。4 000 r·min-1離心2 min，收集菌體于管底。吸去300 μL上清，反復(fù)吹打以重懸菌體，均勻涂布于加有卡那霉素LB平板，倒置于37℃溫箱中培養(yǎng)過夜，至出現(xiàn)1 mm單菌落。4℃冰箱存放。

⑨陽性菌落篩選與鑒定

滅菌槍頭挑取單菌落至含3 mL LB液體培養(yǎng)的5 mL滅菌離心管中，37℃，200 r·min-1振蕩培養(yǎng)5 h，使用原擴(kuò)增引物、體系、條件對菌液作PCR鑒定，擴(kuò)增產(chǎn)物1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。檢測含目的條帶菌液，重新?lián)u菌后，提取質(zhì)粒雙酶切驗(yàn)證，成功后送華大基因測序，測序結(jié)果與基因序列一致即代表載體構(gòu)建成功。

⑩農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化

將轉(zhuǎn)化質(zhì)粒2 μg加入農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞，輕輕混勻，冰上放置5 min。將離心管用封口膜密封后，放液氮罐中迅速冷凍1 min，移至37℃水浴熱激5 min（防止管崩），向離心管中加入800 μL LB液體培養(yǎng)基，于溫度28℃，220 r·min-1恒溫振蕩搖床培養(yǎng)4 h使細(xì)菌復(fù)蘇。4 000 r·min-1離心2 min，吸去400 μL上清，輕彈重懸沉淀，將剩余菌液均勻涂布于LB固體培養(yǎng)基（含50 μg·mL-1Kan和50 μg·mL-1Rif）上，倒置于28 ℃溫箱中培養(yǎng)1～2 d至出現(xiàn)單菌落。將鑒定結(jié)果正確陽性工程菌擴(kuò)大培養(yǎng)，并向菌液中加入等體積50%無菌甘油，混勻后保存于-80℃冰箱，用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.2.2番茄植株侵染

以醋栗（LA2184）為材料，采用無菌土播種，待植株長至4片真葉時(shí)侵染。保存于-70℃，攜帶TRV2:PDS載體和TRV1載體兩個(gè)農(nóng)桿菌株系恢復(fù)培養(yǎng)。在LB（50 μg·mL-1Kan，100 μg·mL-1Rif）平板培養(yǎng)基劃線，30℃恢復(fù)培養(yǎng)48 h，挑取單菌落，接種于3 mL LB（50 μg·mL-1Kan，100 μg·mL-1Rif）液體培養(yǎng)基中，30℃，200 r·min-1震蕩培養(yǎng)16～18 h。侵染具體方法參照文獻(xiàn)[18]。

1.2.2.3基因沉默植株沉默效果檢測

植株沉默后，觀察植株表型變化。提取接種農(nóng)桿菌植株RNA并反轉(zhuǎn)錄cDNA，利用cDNA為模板，通過熒光定量PCR檢測植株沉默情況。具體方法同1.2.1。

1.2.3沉默植物相關(guān)生理指標(biāo)測定

1.2.3.1基因沉默植株逆境脅迫處理及樣品采集

①高鹽脅迫：選取鑒定為陽性沉默植株，以生長狀態(tài)一致正常植株為對照，0.2 mmol·L-1NaCl處理1 h，分別采集未處理及處理后陽性植株和對照植株葉片保存。

②干旱脅迫：選取鑒定為陽性沉默植株，以生長狀態(tài)一致正常植株為對照，20%PEG處理1 h，分別采集未處理及處理陽性植株和對照植株葉片保存。

③低溫脅迫：選取鑒定為陽性沉默植株，以生長狀態(tài)一致正常植株為對照，置于5℃恒溫培養(yǎng)箱處理1 h，分別采集未處理及處理后陽性植株和對照植株葉片保存。

1.2.3.2相關(guān)生理指標(biāo)測定

丙二醛（MDA）、脯氨酸（Proline）含量、超氧化歧化酶（SOD）活性測定參照文獻(xiàn)[19]。

2　結(jié)果與分析

2.1　番茄WRKY基因非生物脅迫條件下表達(dá)模式分析

2.1.1鹽脅迫處理分析

由圖1可知，鹽脅迫處理前后對照發(fā)現(xiàn)，6個(gè)WRKY基因?qū)aCl脅迫均表現(xiàn)顯著差異。其中Sl-WRKY13、SlWRKY31、SlWRKY50、SlWRKY62、Sl-WRKY63基因表達(dá)水平上調(diào)，但隨時(shí)間延長，基因表達(dá)顯著下調(diào)，說明長時(shí)間使用高鹽處理，可能抑制該基因表達(dá)。且SlWRKY31、SlWRKY50、Sl-WRKY62、SlWRKY63均在NaCl處理1 h后達(dá)峰值，SlWRKY13在6 h達(dá)峰值，與對照相比差異顯著，而SlWRKY24基因表達(dá)下調(diào)，且與對照相比差異極顯著。SlWRKY63與其他5個(gè)基因相比，受NaCl處理后表達(dá)量變化最大，處理1 h后為對照15倍，其他5個(gè)基因峰值時(shí)表達(dá)量不足對照4倍。

圖1　qRT-PCR方法分析6個(gè)番茄SlWRKY基因NaCl處理表達(dá)情況Fig.1　qRT-PCR analysis of six SlWRKY genes in NaCl treatment of tomato plant

2.1.2干旱脅迫處理分析

由圖2可知，干旱脅迫處理前后對照發(fā)現(xiàn)，6個(gè)WRKY基因?qū)Ω珊得{迫均表現(xiàn)顯著差異。其中SlWRKY13、SlWRKY31、SlWRKY62、SlWRKY63 基因表達(dá)上調(diào)，SlWRKY24、SlWRKY50基因表達(dá)下調(diào)。SlWRKY13干旱處理1 h時(shí)未見明顯變化，處理3 h后顯著上調(diào)，12 h達(dá)最大值，是對照60倍。SlWRKY31、SlWRKY62、SlWRKY63處理3 h時(shí)達(dá)峰值，且與對照相比差異極顯著，SlWRKY63表達(dá)量變化范圍最大，可達(dá)對照500倍，SlWRKY50處理1 h時(shí)，表達(dá)量下降，直到6 h時(shí)上升，幾乎達(dá)對照表達(dá)水平，隨后下降。PEG處理24 h時(shí)，6個(gè)基因幾乎均不表達(dá)。

2.1.3低溫脅迫處理分析

由圖3可知，低溫脅迫處理前后，6個(gè)SlWRKY基因?qū)Φ蜏孛{迫應(yīng)答均表現(xiàn)顯著變化。其中SlWRKY24基因在植株受到冷脅迫后與對照比表達(dá)下調(diào)，而SlWRKY13、 SlWRKY31、 SlWRKY50、 SlWRKY62、SlWRKY63基因總體表達(dá)上調(diào)，SlWRKY13、SlWRKY 62、SlWRKY63處理6 h時(shí)達(dá)峰值。SlWRKY31、Sl-WRKY50處理1 h達(dá)峰值，SlWRKY31與對照相比差異顯著，而SlWRKY50與對照相比差異極顯著。

圖2　qRT-PCR方法分析6個(gè)番茄SlWRKY基因PEG處理表達(dá)情況Fig.2　qRT-PCR analysis of six SlWRKY genes in PEG treatment of tomato plant

圖3　qRT-PCR方法分析6個(gè)番茄SlWRKY基因5℃處理表達(dá)情況Fig.3　qRT-PCR analysis of six SlWRKY genes in 5℃treatment of tomato plant.

2.2 番茄S1WRKY50基因TRV2載體構(gòu)建

根據(jù)逆境條件下6個(gè)WRKY基因表達(dá)情況，選取SlWRKY50基因作基因沉默分析，該基因?qū)Ω邷乇憩F(xiàn)下調(diào)，對低溫表現(xiàn)明顯上調(diào)，對鹽脅迫上調(diào)表現(xiàn)不明顯，表達(dá)特點(diǎn)明確，具有代表性，便于基因沉默分析。

2.2.1目標(biāo)片段SlWRKY50和PDS擴(kuò)增

SlWRKY50擴(kuò)增片段長度313 bp，PDS擴(kuò)增長度223 bp，該結(jié)果與預(yù)期PCR結(jié)果一致（見圖4）。所獲SlWRKY50和PDS目標(biāo)片段可作后續(xù)試驗(yàn)。

圖4　SLWRKY50和PDS基因擴(kuò)增Fig.4　Amplification of SLWRKY50 and PDS genes

2.2.2質(zhì)粒提取

使用質(zhì)粒提取試劑盒提取空載體pTRV2，獲得pTRV2。獲得pTRV2提取3個(gè)樣品均有一條明亮條帶，無拖尾現(xiàn)象，證明質(zhì)粒提取完好（見圖5）?？捎糜诤罄m(xù)試驗(yàn)。

圖5　提取獲得pTRV2載體Fig.5　Extraction of pTRV2 vector

2.2.3重組菌液PCR驗(yàn)證

1%瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)，SlWRKY50片段長度250～500 bp，PDS片段長度100～250 bp，與預(yù)期片段一致（見圖6）。

2.2.4重組質(zhì)粒酶切鑒定

經(jīng)菌落PCR初步鑒定后，提取重組質(zhì)粒經(jīng)XbaⅠ和Bam HⅠ雙酶切，得到雙酶切產(chǎn)物，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，泳道1～4片段長度為300 bp單一條帶，泳道5片段長度100～250 bp，兩條片段分別與預(yù)期片段一致（見圖7）。說明目標(biāo)片段已連入載體。把重組載體命名為pTRV-SlWRKY50和pTRV-PDS。對重組菌液PCR驗(yàn)證，雙酶切成功菌液即陽性克隆送華大基因測序。

2.2.5重組質(zhì)粒測序結(jié)果

將構(gòu)建成功pTRV2-SlWRKY50和pTRV-PDS送華大基因公司測序，測序結(jié)果與SGN公布序列比對一致并未產(chǎn)生突變。

圖6　重組質(zhì)粒菌落PCR驗(yàn)證Fig.6　Verification of recombinant plasmid PCR

圖7　重組質(zhì)粒pTRV-SlWRKY50和pTRV-PDS酶切鑒定Fig.7　Identification of recombinant plasmid TRVSlWRKY50 and pTRV-PDS digested

2.2.6農(nóng)桿菌侵染

2.2.6.1VIGS沉默效果

番茄幼苗接種農(nóng)桿菌15 d后逐漸出現(xiàn)白化現(xiàn)象，接種3～4周后番茄幼苗葉片明顯漂白（見圖8），表明番茄幼苗PDS基因被成功沉默。

2.2.6.2基因SlWRKY50表達(dá)量分析

提取接種農(nóng)桿菌植株RNA并反轉(zhuǎn)錄cDNA，利用cDNA為模板，通過熒光定量PCR檢測植株沉默情況（見圖9）。SlWRKY50在沉默番茄中表達(dá)量均下降，說明TRV重組載體已成功轉(zhuǎn)入番茄幼苗并在植株體內(nèi)復(fù)制、表達(dá)。

2.3　逆境條件下SlWRKY50基因沉默植株生理指標(biāo)測定

2.3.1鹽脅迫下SlWRKY50基因沉默植株生理指標(biāo)測定

處理前對照組植株（CK）和沉默植株MDA、Pro和SOD含量均無顯著差異。NaCl處理1 h后CK和沉默植株葉片MDA、Pro和SOD含量均升高，但CK植株和沉默植株中檢測值差別不明顯，沉默植株MDA略上升，Pro和SOD略下降（見圖10）。

圖8　對照基因PDS沉默導(dǎo)致番茄植株白化現(xiàn)象Fig.8　Silencing of PDS control gene causes photobleaching in tomato plants

圖9　SlWRKY50基因在沉默植株葉片中表達(dá)水平Fig.9　Expression level of SlWRKY50 genes in the VIGS plants

圖10　鹽脅迫下沉默植株丙二醛、脯氨酸和超氧化物歧化酶含量Fig.10　MDA,proline and SOD content in the VIGS plants under salt treatment

2.3.2干旱脅迫下SlWRKY50基因沉默植株生理指標(biāo)測定

處理前對照組植株（CK）和沉默植株MDA、Pro和SOD含量均無顯著差異（P＞0.05）。干旱處理1 h后CK和沉默植株葉片MDA、Pro和SOD含量均升高，但CK植株和沉默植株中檢測值差別較小。沉默植株MDA略升，Pro和SOD略降（見圖11）。

2.3.3低溫脅迫下SlWRKY50基因沉默植株生理指標(biāo)測定

處理前對照組植株（CK）和沉默植株MDA、Pro和SOD含量差異不顯著，MDA含量沉默植株稍高于對照。低溫處理1 h后，沉默植株MDA含量顯著高于CK，沉默植株P(guān)ro和SOD含量顯著低于CK植株（見圖12）。結(jié)果表明，SlWRKY50基因沉默后，低溫逆境脅迫耐受能力下降。

圖11　干旱脅迫下沉默植株丙二醛、脯氨酸和超氧化物歧化酶含量Fig.11　MDA,proline and SOD content in the VIGS plants under drought treatment

3　討論與結(jié)論

植物生長過程中，溫度、光照、水分、土壤是生長要素，植物為更好適應(yīng)外界環(huán)境變化，進(jìn)化系列防御體系調(diào)控相關(guān)基因和代謝途徑，應(yīng)對各種非生物脅迫影響[20-21]。植物和藻類中，WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族是經(jīng)典DNA合成蛋白，WRKY轉(zhuǎn)錄因子在植物生物脅迫和非生物脅迫中有重要作用。番茄WRKY基因有不同時(shí)間和空間表達(dá)模式，響應(yīng)不同生物和非生物脅迫與不同發(fā)育過程[22]，WRKY基因抗病原菌相關(guān)研究較多[23-24]，作用于植物生長和次生代謝中[25]。Munns等研究認(rèn)為WRKY基因家族中，WRKYIIa和IIb亞族與植物非生物脅迫關(guān)系較大，如在擬南芥中II-a亞家族WRKY基因參與非生物脅迫響應(yīng)，AtWRKY18、AtWRKY40和At-WRKY60在植物響應(yīng)ABA和非生物脅迫時(shí)呈復(fù)雜表達(dá)模式[26]，因此本試驗(yàn)從已報(bào)道81個(gè)WRKY基因家族中，通過前期研究選取6個(gè)典型WRKYIIa和IIb亞族基因SlWRKY13、SlWRKY-24、Sl-WRKY31、SlWRKY50、SlWRKY62、SlWRKY63，通過低鹽、高溫、低溫逆境脅迫處理發(fā)現(xiàn)，Sl-WRKY24在干旱、低鹽、低溫脅迫下表達(dá)受抑制。SlWRKY13、 SlWRKY31、 SlWRKY50、 SlWRKY62、SlWRKY63在3種脅迫處理中（SlWRKY50干旱處理除外），雖表達(dá)量變化存在差異，但表達(dá)量均先升后降。結(jié)果表明，這些基因可能參與番茄脅迫處理應(yīng)答反應(yīng)。證明WRKY基因家族與植物抗逆脅迫反應(yīng)關(guān)系密切。

選取SlWRKY50基因作功能驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)Sl-WRKY50在沉默番茄中通過非生物脅迫處理，表達(dá)量下降，說明TRV重組載體已成功轉(zhuǎn)入番茄幼苗，并在植株體內(nèi)復(fù)制表達(dá)，該基因參與脅迫應(yīng)答反應(yīng)。生理指標(biāo)是判斷植物耐逆重要指標(biāo)，脯氨酸含量越高，對逆境耐受性越強(qiáng)。植物處于逆境條件下時(shí)，細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生大量游離氨基酸[27]，超氧化物歧化酶是一種抗氧化酶，具有增強(qiáng)防御和清除活性氧功能，減弱細(xì)胞膜系統(tǒng)損傷，提高植物對逆境脅迫耐受性[28]。本研究中，低溫處理1 h后，沉默植株P(guān)ro和SOD含量明顯低于CK，說明植株沉默后，受低溫脅迫損傷較大。低溫處理時(shí)，細(xì)胞可加劇膜脂過氧化，產(chǎn)生大量MDA，其含量可說明膜系統(tǒng)受傷害程度及植物對逆境耐受能力[29]。該試驗(yàn)沉默植株MDA含量明顯高于相同條件下未沉默植株。推斷SlWRKY50基因沉默后，可降低溫度耐受性，說明SlWRKY50基因可能參與低溫脅迫應(yīng)答反應(yīng)。