不同劑量右美托咪定預(yù)處理對大鼠體外循環(huán)肺損傷的影響

于承琨，謝　菲，何　苗，韓　明，竇雪嬌，張　琳，張　紅

(1.遵義醫(yī)學(xué)院 麻醉醫(yī)學(xué)院，貴州 遵義　563099；2.遵義市第一人民醫(yī)院 重癥醫(yī)學(xué)科，貴州 遵義　563000；3.成都大學(xué)附屬醫(yī)院 麻醉科，四川 成都　610081)

體外循環(huán)(cardiopulmonary bypass CPB)后患者幾乎均有不同程度的肺損傷[1]，嚴(yán)重的表現(xiàn)為呼吸窘迫綜合征乃至多器官功能衰竭，病死率可高達(dá)50%～70%[2]。CPB后肺損傷的主要因素之一為CPB誘發(fā)的全身性炎癥反應(yīng)[3]。右美托咪定是一種新型、高選擇性的α2腎上腺受體激動劑，具有鎮(zhèn)靜催眠、鎮(zhèn)痛、抗交感神經(jīng)、穩(wěn)定血流動力學(xué)等作用，已在臨床上廣泛應(yīng)用；研究發(fā)現(xiàn)右美托咪定可通過減輕炎癥反應(yīng)產(chǎn)生肺保護(hù)作用[4]。因此，本實(shí)驗(yàn)旨在大鼠CPB左肺缺血再灌注肺損傷模型中應(yīng)用不同劑量的右美托咪定預(yù)處理，探討其可能的保護(hù)作用，為拓展右美托咪定的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物及分組350～500 g成年健康雄性SD大鼠144只，由重慶第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院創(chuàng)傷外科研究所動物中心提供，許可證：SCXK(渝)2012-0005。大鼠隨機(jī)分6組,每組24只(每時間點(diǎn)8只)，即單純開胸組(T組)、單純轉(zhuǎn)機(jī)組(C組)、肺缺血再灌注組(IR組)、右美托咪定Ⅰ組(DexⅠ組)、右美托咪定Ⅱ組(DexⅡ組)和右美托咪定Ⅲ組(DexⅢ組)。T組只開胸，不做其他處理；C組只建立常規(guī)CPB；IR組只建立大鼠CPB左肺缺血再灌注損傷模型；DexⅠ組、DexⅡ組、DexⅢ組建立大鼠CPB左肺缺血再灌注損傷模型，在阻斷左肺門前10 min分別尾靜脈給予1.5、3、6 μg/kg右美托咪定，其余各組在阻斷左肺門前10 min靜脈給予等容量的生理鹽水。

1.2大鼠體外循環(huán)肺缺血再灌注損傷模型的建立各組動物均用1%戊巴比妥鈉50 mg/kg腹腔內(nèi)注射麻醉，分離右側(cè)股動脈、兩側(cè)股靜脈并穿刺置管，左股靜脈連接大鼠膜式氧合器(東莞科威醫(yī)療機(jī)械有限公司)，股動脈連接生物信號采集處理系統(tǒng)監(jiān)測大鼠生命體征，喉鏡明視下氣管插管連接呼吸機(jī)。肝素5 mg/kg由尾靜脈注射，待全身肝素化后經(jīng)股靜脈進(jìn)行靜脈端引流，右側(cè)頸總動脈連接BT100-2J蠕動泵，待激活全血凝固時間(Activated Clotting Time of whole blood ACT)大于480 s后開始轉(zhuǎn)機(jī)，并循10 min后經(jīng)左側(cè)第四肋間開胸；游離并夾閉左肺門45 min后，開放肺門，30 min后停止CPB，術(shù)中維持灌注流量在40mL/(kg·min)，平均動脈壓保持在50～65 mmHg。停機(jī)前使用魚精蛋白尾靜脈內(nèi)注射中和多余肝素，期間通過動脈血?dú)夥治鼋Y(jié)果維持實(shí)驗(yàn)動物的電解質(zhì)平衡以及內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)，停機(jī)1.5 h后結(jié)束本實(shí)驗(yàn)。

1.3指標(biāo)檢測各組分別在CPB前(T1)、開放左肺門后(T2)、實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(T3)時點(diǎn)取股動脈血進(jìn)行血?dú)夥治觯鶕?jù)血?dú)夥治鼋Y(jié)果計算氧合指數(shù)(OI)和呼吸指數(shù)(RI)，其中OI= PaO2/FiO2，RI=P(A-a)O2/PaO2。動脈血3 000 rpm離心10 min取血漿，采用ELISA法測定血漿TNF-α和IL-1β、IL-6水平；取左肺分兩份分別于液氮和福爾馬林中保存。一份左肺組織經(jīng)福爾馬林固定后用HE染色光鏡觀察形態(tài)學(xué)變化，TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡情況(嚴(yán)格按照說明書操作)，在光鏡下觀察染色呈黃褐色為陽性細(xì)胞。隨機(jī)選取5個高倍視野(10×40)，利用image-pro plus6.0進(jìn)行圖象分析并記錄凋亡指數(shù)(A)和陽性細(xì)胞顯色強(qiáng)度(B)，按照免疫組化評分(IHS)=A×B進(jìn)行評估，其結(jié)果反映了組織細(xì)胞的凋亡程度，評分越高凋亡程度越重。另一份左肺組織進(jìn)行勻漿、離心、吸取上清測定TNF-α和IL-8、IL-6水平(嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說明書操作)。

2　結(jié)果

2.1各組大鼠氧合指數(shù)(OI)及呼吸指數(shù)(RI)的變化各組不同時點(diǎn)比較：T組各時點(diǎn)OI、RI未見明顯改變(P>0.05)；其余各組各時間點(diǎn)OI：T1>T2>T3(P<0.05)，RI變化則相反。

各組間相同時點(diǎn)比較：T1時點(diǎn)，各組大鼠間OI、RI無明顯差異(P>0.05)；不同時點(diǎn)組內(nèi)及組間比較： T2、T3時點(diǎn)，與T組比較，C、IR、DexⅠ、DexⅡ、DexⅢ組OI顯著減低(P<0.05)，C組OI又明顯高于IR、DexⅠ、DexⅡ、DexⅢ組(P<0.05)，RI變化則相反。IR、DexⅠ、DexⅡ、DexⅢ組之間OI、RI無明顯差異(P>0.05，見表1～2)。

組別T1T2T3TCIRDex IDex IIDex III462.38±29.92457.07±37.36466.66±42.99471.73±36.94468.02±25.92473.52±21.13447.41±43.31　　354.81±43.14#◆　235.95±68.73#◆★249.53±58.28#◆★261.35±61.58#◆★242.21±68.91#◆★434.46±38.29　　302.45±74.55#※◆　175.68±63.09#※◆★187.59±63.69#※◆★179.92±70.21#※◆★173.58±68.01#※◆★

與T1比，#P<0.05；與T2比，※P<0.05；與T組比，◆P<0.05；與C組比，★P<0.05。

組別T1T2T3TCIRDex IDex IIDex III0.461±0.0610.444±0.0660.451±0.1350.465±0.0710.454±0.0360.449±0.5170.529±0.146　　0.971±0.040#◆　1.712±0.708#◆★1.732±0.712#◆★1.719±0.248#◆★1.761±0.734#◆★0.569±0.135　　1.567±0.539#※◆　2.555±0.728#※◆★2.644±0.573#※◆★2.643±0.543#※◆★2.638±0.611#※◆★

與T1比，#P<0.05；與T2比，※P<0.05；與T組比，◆P<0.05；與C組比，★P<0.05。

2.2各組大鼠肺組織形態(tài)學(xué)變化T1時點(diǎn)：各組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)清晰、完整，肺泡壁完整，肺泡腔內(nèi)無明顯出血及炎性滲出。T2時點(diǎn)：T組肺組織結(jié)構(gòu)清晰，其余各組肺組織結(jié)構(gòu)稍紊亂可見紅細(xì)胞滲出及少量炎性水腫液。T3時點(diǎn)：T組肺組織結(jié)構(gòu)較清晰，可見少量紅細(xì)胞滲出及炎性滲出；C組肺組織結(jié)構(gòu)尚清晰，可見部分肺泡壁斷裂和肺泡腔塌陷，炎性細(xì)胞及紅細(xì)胞浸潤，肺組織損傷程度較IR、DexⅠ、DexⅡ、DexⅢ組明顯減輕；IR、DexⅠ、DexⅡ、DexⅢ組肺組織結(jié)構(gòu)紊亂，肺泡壁嚴(yán)重斷裂，肺泡腔塌陷且有大量水腫液，可見紅細(xì)胞及炎性細(xì)胞大量浸潤(見圖1)。

A:T組; B:C組; C:IR組; D:DEX I組; E:DEX II組; F:DEX III組，HE×100。圖1　T3時肺組織形態(tài)學(xué)改變

2.3各組大鼠肺組織細(xì)胞凋亡及免疫組化評分T1時點(diǎn)：各組大鼠肺組織出現(xiàn)少量棕色凋亡細(xì)胞，染色強(qiáng)度也較低。T2時點(diǎn)：各組大鼠肺組織凋亡細(xì)胞數(shù)目逐漸增多，染色強(qiáng)度也逐漸加深。T3時點(diǎn)：T組出現(xiàn)少量染色較深的陽性細(xì)胞，C、IR、DexⅠ、DexⅡ、DexⅢ組均出現(xiàn)大量的深染陽性細(xì)胞，IR、DexⅠ、DexⅡ、DexⅢ組尤甚并形成凋亡細(xì)胞群，凋亡程度明顯高于T、C組，證明該模型成功建立。

免疫組化評分(IHS)：各組內(nèi)比較不同時點(diǎn)：T組各時點(diǎn)肺組織IHS無明顯變化；T3時點(diǎn)C、IR、DexⅠ、DexⅡ、DexⅢ組IHS均升高(P<0.05)；與T2比較，T3時點(diǎn)C、IR、DexⅠ、DexⅡ、DexⅢ組IHS明顯升高(P<0.05)。各組間相同時點(diǎn)比較：T1、T2時點(diǎn)各組IHS無明顯差異(P>0.05)；T3時點(diǎn)，IR、DexⅠ、DexⅡ、DexⅢ組IHS高于C組(P<0.05)并且均明顯高于T組(P<0.05)，IR、DexⅠ、DexⅡ、DexⅢ組IHS無明顯差異(P>0.05)(見表3、圖2)。

表3各組大鼠不同時點(diǎn)肺組織細(xì)胞凋亡IHS

組別T1T2T3TCIRDex IDex IIDex III2.00±0.631.83±0.752.00±0.551.83±0.752.05±0.722.00±0.582.67±0.823.12±0.413.12±0.753.33±0.823.08±0.623.08±0.733.33±0.52　　5.33±1.03▲※●7.50±1.76▲※●#8.67±0.52▲※●#8.58±1.22▲※●#8.67±0.52▲※●#

與T1比較，▲P<0.05；與T2比較，※P<0.05；與T組比較，●P<0.05；與C組比，#P<0.05。

A:T組; B:C組; C:IR組; D:DEX I組; E:DEX II組; F:DEX III組，SP×400。圖2　各組大鼠T3時染色

2.4各組大鼠肺組織和血漿TNF-α、IL-1β、IL-6含量變化各組大鼠肺組織和血漿TNF-α、IL-1β、IL-6含量變化趨勢一致。由于CPB血液稀釋的影響，TNF-α、IL-1β、IL-6血漿含量的數(shù)值需進(jìn)行校正，校正值=實(shí)測值×轉(zhuǎn)機(jī)前血細(xì)胞比積(Hct)值/實(shí)際Hct值。

各組大鼠不同時點(diǎn)比較：T組各時點(diǎn)肺組織及血漿TNF-α、IL-1β、IL-6含量無明顯改變(P>0.05)；隨著時間的延長TNF-α、IL-1β、IL-6在肺組織和血漿中的含量明顯增加，即TNF-α、IL-1β、IL-6含量T1最少，T2次之、T3最多(P<0.05)。

各組大鼠相同時點(diǎn)比較：T1時點(diǎn)各組大鼠肺組織和血漿TNF-α、IL-1β、IL-6含量無明顯差異(P<0.05)；T2、T3時點(diǎn)：TNF-α、IL-1β、IL-6含量T組最少，C組次之，IR、DexⅠ、DexⅡ、DexⅢ組含量最高(P<0.05)，IR、DexⅠ、DexⅡ、DexⅢ組之間含量無明顯差異(P>0.05) (見圖3～5) 。

與T1比，# P<0.05；與T2比，※P<0.05；與T組比，◆P<0.05；與C組比，★P<0.05。圖3　肺組織、血漿TNF-α含量

與T1比，#P<0.05；與T2比，※P<0.05；與T組比，◆P<0.05；與C組比，★P<0.05。圖4　肺組織、血漿IL-1β含量

與T1比，#P<0.05；與T2比，※P<0.05；與T組比，◆P<0.05；與C組比，★P<0.05。圖5　肺組織、血漿IL-6含量

3　討論

體外循環(huán)后的肺損傷及肺保護(hù)研究一直是人們關(guān)注的熱點(diǎn)，其中CPB后誘發(fā)的全身炎癥反應(yīng)是導(dǎo)致肺損傷的機(jī)制之一。本實(shí)驗(yàn)建立心臟不停跳的大鼠CPB，排除了心臟停跳對肺組織的影響，很大程度上模擬了CPB非生理循環(huán)狀態(tài)的肺損傷。期間阻斷左肺門45 min，模擬了肺缺血再灌注損傷。缺血組肺功能及光鏡結(jié)果證明模型成功建立，模型的成功建立有助于CPB后肺保護(hù)的實(shí)驗(yàn)研究。研究發(fā)現(xiàn)[5]，在犬CPB模型中隨著肺組織TNF-α含量增加，肺組織結(jié)構(gòu)破壞，最終導(dǎo)致肺功能下降。IL-1β是早期出現(xiàn)的炎細(xì)胞因子，可與TNF-α協(xié)同激活核轉(zhuǎn)錄因子-κB (NF-κB)產(chǎn)生細(xì)胞因子，參與啟動炎性反應(yīng)；IL-6被認(rèn)為是嚴(yán)重急性肺損傷的標(biāo)志。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與體外循環(huán)前比較，CPB后單純CPB組(C組)、左肺缺血再灌注損傷組(IR組)，大鼠OI顯著降低，而RI則明顯升高；同時隨著時間的延長，肺組織、血漿中TNF-α、IL-1β、IL-6含量逐漸升高，同時肺功能降低，細(xì)胞凋亡數(shù)及IHS明顯增加，單純開胸組(T組)則無明顯變化；表明CPB后炎癥因子數(shù)目增加可能是細(xì)胞凋亡及肺損傷的主要因素，這與Kearney等[6]研究結(jié)果相符。

隨著右美托咪定相關(guān)研究的進(jìn)展，其器官保護(hù)作用也得到了越來越多學(xué)者的肯定。研究發(fā)現(xiàn)[7]：使用右美托咪定有效減輕了肺缺血再灌注損傷模型中的肺損傷，具有肺保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)選擇人的臨床等效劑量經(jīng)靜脈分別泵注1.5、3、6μg/kg的右美托咪定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，DexⅠ、DexⅡ、DexⅢ組各組間比較及與IR組的比較，肺組織和血漿中TNF-α、IL-1β、IL-6含量均無明顯差異，肺功能指標(biāo)、肺組織病理改變及細(xì)胞凋亡程度也無明顯改善，說明右美托咪定預(yù)處理對CPB肺損傷沒有明顯的保護(hù)作用，與相關(guān)報道結(jié)果不符。分析可能原因?yàn)椋孩儆颐劳羞涠ńo藥方式不同：有研究表明，過度的應(yīng)激反應(yīng)可能是引起急性肺損傷的重要機(jī)制之一[8]。CPB的非生理性灌注加之手術(shù)創(chuàng)傷會產(chǎn)生強(qiáng)烈的應(yīng)激反應(yīng)，且隨時間增加應(yīng)激反應(yīng)越重，可導(dǎo)致各器官功能障礙。右美托咪定分布半衰期約為6 min，清除半衰期2 h，而時量相關(guān)半衰期隨輸注時間增加顯著延長，本實(shí)驗(yàn)僅在開胸前10 min進(jìn)行右美托咪定預(yù)處理，時間短可能無法完全抑制CPB引起的應(yīng)激反應(yīng)，對大鼠肺損傷無明顯改善作用。②右美托咪定的劑量可能不足：有研究發(fā)現(xiàn)，右美托咪定的抗炎作用具有劑量依賴性，大劑量抗炎作用強(qiáng)[9-10]。在呼吸機(jī)誘導(dǎo)的大鼠肺損傷模型中[11]，臨床相關(guān)劑量的右美托咪定沒有顯著減輕肺損傷，而10倍于臨床劑量時可顯著減輕肺損傷。本實(shí)驗(yàn)選擇的是臨床相關(guān)劑量，因此推測，右美托咪定對大鼠CPB肺組織無明顯的保護(hù)作用可能與選擇的劑量偏小有關(guān)，但具體原因還需進(jìn)一步研究證實(shí)。