高山被孢霉淬滅方法及胞內(nèi)代謝產(chǎn)物的氣相色譜質(zhì)譜分析比較

劉 欣，傅寧華，張紅漫，紀(jì)曉俊，張 鑫，楊健健，黃 和

（1.南京工業(yè)大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院材料化學(xué)工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京210009；2.南京工業(yè)大學(xué)理學(xué)院，南京210009）

劉 欣1，傅寧華1，張紅漫2，紀(jì)曉俊1，張 鑫2，楊健健1，黃 和1

（1.南京工業(yè)大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院材料化學(xué)工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京210009；2.南京工業(yè)大學(xué)理學(xué)院，南京210009）

在花生四烯酸生產(chǎn)菌高山被孢霉代謝組學(xué)研究中，需利用胞內(nèi)代謝物的提取手段并基于氣相色譜-質(zhì)譜（GC?MS）分析方法對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)。比較了3種胞內(nèi)代謝物提取方法及不同色譜柱條件下GC?MS分析結(jié)果。研究表明：采用冷甲醇淬滅分別較液氮直接淬滅及真空過(guò)濾后，減少了胞內(nèi)代謝物的泄露并更好地實(shí)現(xiàn)了胞外及胞內(nèi)代謝物的分離。在對(duì)代謝物分析的比較中，極性色譜柱（DB?FFAP）檢出的代謝物僅為11種，主要為有機(jī)酸、醛類；而代謝物經(jīng)衍生化后采用非極性色譜柱（DB-5）共檢出32種化合物，主要為糖、糖苷及醇類。

花生四烯酸；高山被孢霉；代謝組學(xué)；代謝產(chǎn)物；取樣；GC?MS分析

花生四烯酸（arachidonic acid，ARA），即全順式5，8，11，14-二十碳四烯酸，是屬于ω-6系列的必需長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸（PUFAs），對(duì)促進(jìn)大腦功能和提高視網(wǎng)膜發(fā)育是不可或缺的物質(zhì)［1］。此外，ARA還具有降低血脂、增強(qiáng)免疫力、抗癌等功效，被廣泛應(yīng)用于功能保健、生物醫(yī)藥、化妝品及飼料添加劑等方面［2］。

高山被孢霉（Mortierella alpina）是生產(chǎn)ARA的重要工業(yè)菌株，利用代謝組學(xué)技術(shù)可以深入了解微生物代謝產(chǎn)物之間的相互關(guān)系［3］，對(duì)以高山被孢霉為代表的工業(yè)微生物進(jìn)行研究有利于進(jìn)一步認(rèn)識(shí)和改造它們。微生物代謝組學(xué)研究中，試樣的采集和代謝物分析是獲取代謝物組數(shù)據(jù)并進(jìn)行生物學(xué)解析的前提，對(duì)它們的方法進(jìn)行研究是十分必要的。

試樣采集過(guò)程為保持細(xì)胞收集時(shí)刻的生理狀態(tài)不發(fā)生改變，需要對(duì)細(xì)胞進(jìn)行快速取樣及淬滅。液氮淬滅技術(shù)作為一種標(biāo)準(zhǔn)方法常用于絲狀真菌及其他生物中［4］。此方法的優(yōu)點(diǎn)是淬滅代謝反應(yīng)迅速，且淬滅劑無(wú)極性、無(wú)殘留。但直接對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行淬滅后，得到的試樣包含了胞內(nèi)及胞外的所有代謝物。因此，淬滅前的分離是改進(jìn)此方法的重要環(huán)節(jié)。由于絲狀真菌的培養(yǎng)基具有高黏度、非均一且不易收集的特點(diǎn)［5］，通常采用真空過(guò)濾的方式分離［6］。此外，冷甲醇溶液（-45℃）也被廣泛用于細(xì)菌［7］、酵母［8］及絲狀真菌［5，9］的代謝反應(yīng)淬滅中，此方法具有較溫和的特點(diǎn)。筆者擬考察基于3種不同淬滅方法的取樣技術(shù)對(duì)于胞內(nèi)代謝物泄露的影響，為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。

氣相色譜-質(zhì)譜（GC?MS）系統(tǒng)在代謝物的分離與鑒定中起著關(guān)鍵作用。除儀器型號(hào)不同外，其主要的區(qū)別歸于色譜柱型號(hào)。對(duì)于非極性色譜柱DB-5而言，對(duì)試樣進(jìn)行分析前需要進(jìn)行柱前衍生化。而對(duì)于極性柱DB-FFAP而言，試樣無(wú)需衍生化就可以直接進(jìn)樣。同時(shí)基于Deans switch的GC?MS直接進(jìn)樣的方法，在DB-FFAP極性柱上可以實(shí)現(xiàn)對(duì)代謝物水溶液進(jìn)行直接分析的過(guò)程。筆者主要比較非極性DB-5及極性DB-FFAP 2種色譜柱對(duì)代謝物的分析能力，以獲得最適合用于M．a(chǎn)lpina胞內(nèi)代謝物的分析方法。

1 材料與方法

1.1 菌種

經(jīng)紫外誘變后獲得的高山被孢霉ME-1（Mortierella alpina ME-1）菌株在馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）斜面上于4℃條件下保藏，每3個(gè)月進(jìn)行轉(zhuǎn)接。

1.2 培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件

取已培養(yǎng)好的新鮮斜面菌種，用無(wú)菌水洗下菌絲，接種于種子培養(yǎng)基中（g／L）：葡萄糖30，酵母膏5.0，KH2PO43.0。轉(zhuǎn)速120 r／min，25℃培養(yǎng)48～72 h。待種子生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期轉(zhuǎn)接5 mL種子液至50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中（g／L）：葡萄糖80，酵母膏6.0，KH2PO44.0，NaNO33.0，MgSO4·7H2O 1.0，pH 6.0～8.0。培養(yǎng)條件為轉(zhuǎn)速120 r／min，溫度23℃，發(fā)酵7 d，于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期取樣（約96 h）。

1.3 淬滅方法

1.3.1 液氮直接淬滅

5 mL發(fā)酵液直接投入裝有50 mL液氮的研磨缽中迅速淬滅。淬滅后于-50℃、2 kPa真空度條件下凍干除去發(fā)酵液中的水分（FreeZone Plus 2.5 L、低壓凍系統(tǒng)，美國(guó)Labconco公司），干菌體用于胞內(nèi)代謝產(chǎn)物提取。

1.3.2 真空過(guò)濾后于液氮中淬滅并研磨

5 mL發(fā)酵液通過(guò)直徑60 mm的濾紙（孔徑5 μm）于真空抽濾裝置中迅速過(guò)濾除去發(fā)酵液，同時(shí)采用去離子水清洗菌絲細(xì)胞。過(guò)濾后的菌體直接迅速地投入裝有25 mL液氮的研磨缽中迅速淬滅，并伴隨快速持續(xù)的機(jī)械研磨，直至被研成粉末，菌粉用于胞內(nèi)代謝產(chǎn)物提取。

1.3.3 甲醇淬滅

5 mL發(fā)酵液直接投入-40℃的25 mL甲醇溶液中（體積分?jǐn)?shù)60%，含10 mmol／L 4-羥乙基哌嗪乙磺酸（HEPES），pH＝7.0）?；旌衔镉? 000 r／min、-10℃條件下離心3 min，菌體沉淀物用于胞內(nèi)代謝物提取。

1.4 提取方法

細(xì)胞淬滅后得到的上述干菌體、菌體沉淀及菌粉于1 mL含60 mmol／L HEPES緩沖液的乙醇溶液中（體積分?jǐn)?shù)75%，80℃）提取3 min后于10 000 r／min，-10℃條件下離線2 min，收集上清液用于代謝產(chǎn)物的檢測(cè)。

1.5 GC?MS檢測(cè)方法

1.5.1 基于DB-FFAP色譜柱的分析方法

氣質(zhì)色譜儀，5975C MSD／7890A GC（Agilent公司）。進(jìn)樣體積1μL，分流比，10∶1，石英毛細(xì)管色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25μm，DB-FFAP，Agilent公司）；進(jìn)樣口溫度，250℃。升溫程序?yàn)槌跏紲囟?0℃，以5℃／min升溫至140℃，以8℃／min升溫至180℃，保持10 min，最后以5℃／min升溫至230℃，并保持6 min。質(zhì)譜條件為傳輸線溫度，250℃；離子源溫度，230℃；電子轟擊模式，EI 70 eV。四級(jí)桿質(zhì)量分析器溫度，150℃；采集質(zhì)量數(shù)范圍為30～500 amu。He為載氣，采用橫流模式，流速1.5 mL／min載氣。溶劑延遲，3 min。基于Deans Switch系統(tǒng)，在特定時(shí)間將部分色譜柱流出試樣進(jìn)入TCD檢測(cè)器而不通過(guò)MS。Deans Switch切割起始時(shí)間4.10 min，結(jié)束時(shí)間7.00 min。TCD檢測(cè)器溫度，220℃。

1.5.2 基于DB-5色譜柱的柱前衍生化及分析方法

100μL提取物于N2濃縮儀中干燥。干燥后的試樣加入50μL甲氧基銨鹽酸鹽（20 mg／mL的吡啶溶液），于40℃條件下反應(yīng)80 min，其后加入80μL N-甲基-N-（三甲基硅氧烷）三氟乙酰胺（MSTFA），40℃條件下反應(yīng)80 min。

衍生化后的試樣用于GC?MS分析檢測(cè)。進(jìn)樣體積1μL，不分流進(jìn)樣。石英毛細(xì)管色譜柱（30 m× 0.25 mm×0.25μm，DB-5MS，Agilent公司）；進(jìn)樣口溫度，250℃。升溫程序?yàn)槌跏紲囟?0℃，保持2 min，以5℃／min升至300℃，保持3 min。質(zhì)譜條件為傳輸線與離子源溫度280℃，電子轟擊模式，IE 70 eV。采集質(zhì)量數(shù)范圍為50～600 m／z。He為載氣，采用橫流模式，流速1 mL／min［10］。

2 結(jié)果與討論

2.1 淬滅方法對(duì)代謝產(chǎn)物泄漏的影響

由于NADPH、NADH、丙酮酸（pyruvate）、葡萄糖-6-磷酸（G6P）、NADP、NAD以及ATP的快速降解速率，因此它們常作為不穩(wěn)定的代謝物代表被用于考察采樣技術(shù)對(duì)代謝產(chǎn)物的泄漏情況［5，11］。代謝物的胞外含量占總量的百分比定義為代謝物的胞外相對(duì)含量。其中采用液氮對(duì)發(fā)酵液直接進(jìn)行淬滅可以得到胞內(nèi)及胞外代謝產(chǎn)物的總量，通過(guò)檢測(cè)發(fā)酵液上清中代謝物含量，計(jì)算得到代謝物的胞外相對(duì)含量，反映了淬滅前原始的胞外代謝產(chǎn)物信息，并將其作為對(duì)照；采用真空過(guò)濾后于液氮中淬滅的方法是通過(guò)檢測(cè)濾液中代謝物含量與其和胞內(nèi)代謝物之和的比值得到代謝物的相對(duì)含量；而采用甲醇淬滅的方法則通過(guò)淬火后混合物上清中代謝物的含量與其和胞內(nèi)代謝物之和的比值得到代謝物的相對(duì)含量。本文中筆者通過(guò)后2種淬滅方法計(jì)算得到代謝物的胞外相對(duì)含量與對(duì)照的差異，從而比較它們對(duì)胞內(nèi)代謝物泄露的影響。考察不同淬滅方法對(duì)M．a(chǎn)lpina胞內(nèi)代謝產(chǎn)物泄漏的影響，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 淬滅方法對(duì)M．a(chǎn)lpina胞內(nèi)代謝產(chǎn)物泄漏的影響Fig.1 Effects of different quenchingmethods on the leakage of intracellular metabolites in M．a(chǎn)lpina

由圖1可知：采用甲醇淬滅及過(guò)濾后液氮淬滅2種采樣技術(shù)時(shí)，NAD和NADP幾乎不會(huì)從細(xì)胞中泄漏出來(lái)。與對(duì)照相比，過(guò)濾后于液氮中淬滅的方法導(dǎo)致NADPH、G6P和NADH的胞外相對(duì)泄漏量分別為44.7%、21.3%和16.2%，差異十分顯著。這可能由于真空過(guò)濾時(shí)細(xì)胞內(nèi)外的巨大壓力差對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生脅迫從而導(dǎo)致代謝產(chǎn)物的大量泄漏。雖然這一方法從整體的淬火過(guò)程處理來(lái)看與MS相比耗時(shí)短、過(guò)程簡(jiǎn)單，但從代謝產(chǎn)物的完整性和穩(wěn)定性上來(lái)看并不是最好的。而采用甲醇淬滅時(shí)胞外代謝物的相對(duì)含量與對(duì)照相比相差范圍在-5.8%～21.9%。由此，采用甲醇淬滅的方法所產(chǎn)生的泄漏相對(duì)較小，可以作為M．a(chǎn)lpina于天然培養(yǎng)基條件下進(jìn)行代謝反應(yīng)淬滅的最佳方法。

2.2 基于DB?FFAP質(zhì)譜柱的代謝產(chǎn)物檢測(cè)

表1為M．a(chǎn)lpina胞內(nèi)代謝產(chǎn)物經(jīng)極性質(zhì)譜柱DB?FFAP分離后檢測(cè)出的代謝產(chǎn)物結(jié)果。由表1可知：經(jīng)分析檢測(cè)出的代謝產(chǎn)物總數(shù)為11個(gè)，其中包括有機(jī)酸、酮類、醛類及醇類等極性化合物。

2.3 基于DB-5質(zhì)譜柱的代謝產(chǎn)物檢測(cè)

表2為M．a(chǎn)lpina胞內(nèi)代謝產(chǎn)物經(jīng)非極性柱DB-5分離后的檢測(cè)結(jié)果。由表2可知，總檢出代謝物個(gè)數(shù)為32，主要為糖類、糖苷類及醇類代謝產(chǎn)物。

表1 基于DB?FFAP色譜的3組平行實(shí)驗(yàn)中重現(xiàn)的代謝產(chǎn)物Table 1 Reproduciblemetabolites of three sets of parallel experiments based on DB?FFAP column

表2 DB-5分離得到的代謝產(chǎn)物檢出情況Table 2 Detection ofmetabolites isolated by DB?5 column

表2 （續(xù)表）

表3為極性色譜柱及非極性色譜柱對(duì)代謝產(chǎn)物的分析比較結(jié)果。由表3可知：極性色譜柱DB FFAP在無(wú)衍生化條件下有利于酮類、醛類等極性的代謝產(chǎn)物的分析；而基于非極性柱（DB 5）的分析代謝產(chǎn)物經(jīng)衍生化后具有更好的穩(wěn)定性和揮發(fā)性適合于糖類、糖苷類、醇類等帶有羥基的化合物的氣相色譜的檢測(cè)，因此在實(shí)際試樣分析中對(duì)于以全部代謝物為目標(biāo)的分析需同時(shí)采用2種柱子，對(duì)于特定目標(biāo)的代謝產(chǎn)物應(yīng)采用不同特性的色譜柱進(jìn)行分析。

表3 代謝產(chǎn)物總檢出情況Table 3 Total amount of detected metabolites

3 結(jié) 論

在對(duì)M．a(chǎn)lpina胞內(nèi)代謝物采集方法中，甲醇淬滅方法產(chǎn)生的代謝物泄露比真空過(guò)濾后再于液氮中淬滅的結(jié)果要低。對(duì)于極性的代謝產(chǎn)物可以無(wú)需衍生化采用極性的質(zhì)譜柱直接實(shí)現(xiàn)分離；而對(duì)于難揮發(fā)的糖類、糖苷類等化合物的檢測(cè)較適合經(jīng)衍生化后通過(guò)非極性質(zhì)譜柱分離。對(duì)于同一生物試樣采用不同極性的色譜柱可以實(shí)現(xiàn)不同種類化合物的定性檢測(cè)。因此根據(jù)目標(biāo)需求可以采用單一色譜柱或兩種色譜柱進(jìn)行分析。

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Com parison of sam pling method of intracellular metabolites in Mortierella alpina and the analysis of themetabolites by GC?MS

LIU Xin1，F(xiàn)U Ninghua1，ZHANG Hongman2，JIXiaojun1，ZHANG Xin2，YANG Jianjian1，HUANG He1

（1.State Key Laboratory of Materials?Oriented Chemical Engineering，College of Biotechnology and Pharmaceutical Engineering，Nanjing University of Technology，Nanjing 210009；2.College of Sciences，Nanjing University of Technology，Nanjing 10009）

In the metabolomics study on arachidonic acid production by Mortierella alpina，sampling method of intracellular metabolites and their detection based on GC?MS analysis are needed.The comparisons of three samplingmethods and GC?MS analysis results in two chromatographic columnswere carried out.The results showed that cold methanol quenching caused lessmetabolites leakage and more effective separation of extra?and intracellular metabolites than direct quenching in liquid nitrogen and vacuum filtration followed by quenching in liquid nitrogen.In the comparison of analysis ofmetabolites，only 11 metabolites were determined by polar column（DB?FFAP），including organic acids and aldehydes.However，32 metabolites were determined by non polar column（DB?5），including sugars，glycosides，and alcohols.

arachidonic acid；Mortierella alpina；metabolomics；metabolites；sampling；GC?MS analysis

S182

A

1672-3678（2013）06-0063-05

10.3969／j.issn.1672-3678.2013.06.013

2012-09-29

國(guó)家自然科學(xué)基金（21176124）；國(guó)家自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目（20936002）；國(guó)家科技支撐計(jì)劃（2011BAD23B03）；江蘇省高校優(yōu)勢(shì)學(xué)科建設(shè)工程

劉 欣（1983—），女，吉林長(zhǎng)春人，博士研究生，研究方向：微生物發(fā)酵與代謝工程；黃 和（聯(lián)系人）：教授，E?mail：biotech＠njut. edu.cn