嗜酸芽孢桿菌普魯蘭酶在大腸桿菌中的表達(dá)及發(fā)酵優(yōu)化

楊向會 陳 晟 吳 敬

(1. 江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214122；2. 江南大學(xué)生物工程學(xué)院工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214122；3. 江南大學(xué)教育部食品安全國際合作聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214122)

普魯蘭酶是一種脫支酶，能夠?qū)Ｒ坏厮庵ф湹矸?或普魯蘭多糖等相關(guān)聚合物)中α-1,6-糖苷鍵[1]，所以普魯蘭酶在淀粉加工工業(yè)得到了廣泛的應(yīng)用。普魯蘭酶與淀粉水解酶(α-淀粉酶、β-淀粉酶)復(fù)配使用時(shí)，淀粉質(zhì)原料的利用率明顯提高，對節(jié)約成本和提高產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率有重要意義，因此普魯蘭酶是淀粉加工中不可或缺的非大宗關(guān)鍵酶制劑[2-3]。

早期國內(nèi)外有關(guān)普魯蘭酶的研究主要集中在菌株的篩選上[4-6]，許多產(chǎn)普魯蘭酶的微生物被發(fā)現(xiàn)，但由于多數(shù)的野生菌株發(fā)酵產(chǎn)普魯蘭酶的酶活較低，限制了其在工業(yè)上的應(yīng)用。因此，對野生菌來源的普魯蘭酶在工程菌中進(jìn)行異源表達(dá)，以提高蛋白表達(dá)量，成為目前研究主流。至今已從多種微生物中克隆出普魯蘭酶基因并對其進(jìn)行異源表達(dá)[7-8]，但重組后的普魯蘭酶表達(dá)仍存在產(chǎn)量低或不能有效分泌的問題。為解決此類問題，Duan等[9]通過分階段控制發(fā)酵溫度和添加甜菜堿的方法，使普魯蘭酶的可溶性表達(dá)量和胞外分泌得到顯著提高。Zou等[10]通過流加甘氨酸使普魯蘭酶的胞外酶活提高了22.6倍。來源于Bacillusacidopullulyticus的普魯蘭酶具有良好的酶學(xué)性質(zhì)(耐酸，耐熱)，最適溫度60 ℃，最適pH 5.0，可以和多種淀粉水解酶復(fù)配使用，能夠滿足淀粉工業(yè)應(yīng)用的要求。大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)具有蛋白表達(dá)水平高、易于高密度發(fā)酵等眾多優(yōu)點(diǎn)[11]，已有多達(dá)60%的重組蛋白在大腸桿菌系統(tǒng)中進(jìn)行表達(dá)[12]。

Chen等[13]在大腸桿菌中重組表達(dá)來源于Bacillusacidopullulyticus的普魯蘭酶，并在5 L發(fā)酵罐水平進(jìn)行發(fā)酵，在發(fā)酵溫度20 ℃條件下酶活達(dá)1 156 U/mL；其誘導(dǎo)溫度過低無法在工業(yè)上實(shí)現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)；針對此問題，本研究擬將Bacillusacidopullulyticus普魯蘭酶在大腸桿菌中進(jìn)行重組表達(dá)，并對重組菌進(jìn)行3 L發(fā)酵罐發(fā)酵優(yōu)化，在本研究中采用工業(yè)生產(chǎn)上可實(shí)現(xiàn)的發(fā)酵溫度25 ℃，大幅度提高了普魯蘭酶的表達(dá)量和胞外酶活，以期為普魯蘭酶的工業(yè)應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒

大腸桿菌E.coliJM 109和BL21(DE3)：本實(shí)驗(yàn)室保藏；

帶有NcoⅠ和Hind Ⅲ酶切位點(diǎn)的重組質(zhì)粒pET20b(+)-BapulA：由上海捷瑞公司合成，其中普魯蘭酶基因BapulA(GeneBank Accession No.Ax203843.1)來源于Bacillusacidopullulyticus。

1.1.2 培養(yǎng)基

搖瓶TB培養(yǎng)基：K2HPO4·3H2O 16.43 g/L，KH2PO42.31 g/L，酵母粉24 g/L，甘油5 g/L，蛋白胨12 g/L，甜菜堿2.4 g/L；

發(fā)酵罐基礎(chǔ)培養(yǎng)基：KH2PO413.5 g/L，MgSO4·7H2O 1.4 g/L，(NH4)2HPO44.0 g/L，C6H8O7·H2O 1.7 g/L，工業(yè)酵母粉2 g/L，工業(yè)蛋白胨1 g/L，甘油8 g/L，微量金屬液10 mL，甜菜堿5 g/L；

發(fā)酵罐補(bǔ)料培養(yǎng)基：MgSO4·7H2O 18.35 g/L，工業(yè)酵母粉4.8 g/L，甘油600 g/L，工業(yè)蛋白胨2.4 g/L。

1.1.3 主要試劑

NcoⅠ和Hind Ⅲ：分子級，寶生物工程(大連)有限公司；

普魯蘭多糖：分析純，東京化成工業(yè)株式會社；

甘氨酸：分析純，國藥化學(xué)試劑有限公司。

1.1.4 主要儀器

發(fā)酵罐：BioFlo /celliGen115型，德國Eppendorf NBS公司；

高效液相色譜系統(tǒng)：安捷倫1200型，美國Agilent公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 搖瓶培養(yǎng) 將菌株從甘油管中接種于LB培養(yǎng)基中，在37 ℃，200 r/min下培養(yǎng)8 h。以5%的接種量轉(zhuǎn)接至50 mL TB培養(yǎng)基內(nèi)，在200 r/min，37 ℃下，OD600為1.0～1.2 時(shí)，加入0.05 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)，25 ℃培養(yǎng)48 h。

1.2.2 發(fā)酵罐培養(yǎng)

(1) 種子培養(yǎng)：將菌株從甘油管中接種至100 mL LB培養(yǎng)基中，37 ℃，200 r/min下培養(yǎng)8～9 h。

(2) 3 L發(fā)酵罐培養(yǎng)：將種子培養(yǎng)液按10%接種量接種至發(fā)酵罐中，加入終濃度為100 μg/mL的氨芐霉素，初始溫度設(shè)定為30 ℃或37 ℃，維持溶氧30%，通過補(bǔ)加氨水來維持pH為7.0。當(dāng)發(fā)酵罐中甘油耗盡，溶氧快速反彈時(shí)，開始流加補(bǔ)料培養(yǎng)基。當(dāng)OD600分別達(dá)到25，50，75時(shí)，降溫至25 ℃，此時(shí)調(diào)節(jié)pH 到6.2，同時(shí)以一定流速流加乳糖進(jìn)行誘導(dǎo)，期間用20%的磷酸和氨水控制pH為6.2。在發(fā)酵過程中，當(dāng)OD600達(dá)到15，45，75，105時(shí)，根據(jù)試驗(yàn)需要補(bǔ)加一定量的甘氨酸。

1.3 分析方法

1.3.1 普魯蘭酶酶活力的測定 將0.1 mL稀釋一定倍數(shù)的普魯蘭酶液(空白加高溫滅活的普魯蘭酶)加入到1.9 mL的普魯蘭多糖溶液中，60 ℃反應(yīng)10 min，加入3 mL的DNS溶液終止反應(yīng)后，在沸水中反應(yīng)7 min，加去離子水補(bǔ)足15 mL。在540 nm波長處測吸光值。普魯蘭酶酶活定義為：每分鐘生成1 μmol還原糖的酶量定義為一個(gè)酶活力單位。

1.3.2 甘氨酸含量的測定 將待測發(fā)酵液在12 000 r/min離心5 min，棄沉淀，在上清液中按1∶1的體積比加入100 g/L 的三氯乙酸。充分混勻后，在室溫下靜置2 h，12 000 r/min 下離心40 min，將離心后的上清液過濾，所得樣品即可用于高效液相(HPLC)檢測。

色譜條件：色譜柱Agilent Eclipse XDB-C18(250 mm × 4.6 mm)，柱溫40 ℃，流速0.8 mL/min，檢測器為紫外檢測器，檢測波長338 nm，洗脫方式為梯度洗脫。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組菌株的構(gòu)建與發(fā)酵

將質(zhì)粒pET20b(+)-BapulA熱激轉(zhuǎn)化E.coliBL21(DE3)感受態(tài)，涂布于帶有氨芐霉素抗性的平板，挑選單菌落至10 mL LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)8 h提取質(zhì)粒，并用NcoⅠ和Hind Ⅲ進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證，結(jié)果見圖1。從圖1(a)可知，電泳條帶與理論值一致，表明重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主菌成功，得到重組菌E.coliBL21(DE3)/pET20b(+)-BapulA。將該菌株進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，培養(yǎng)48 h后取發(fā)酵液進(jìn)行離心、破壁。胞外上清和胞內(nèi)上清中的最高酶活分別為6.5，35.6 U/mL，最高總酶活為41.1 U/mL。將胞外上清、胞內(nèi)上清進(jìn)行蛋白電泳檢測[見圖1(b)]，條帶大小均與重組蛋白理論分子量(約102 kDa)一致，表明來源于Bacillusacidopullulyticus的普魯蘭酶在大腸桿菌中成功表達(dá)。

M. 蛋白Marker (200 kDa) 1. 胞外上清 2. 胞內(nèi)上清圖1 重組大腸桿菌的構(gòu)建和重組普魯蘭酶的SDS-PAGE

Figure 1 Construction of recombinantE.coliand SDS-PAGE analysis of recombinant pullulanase

2.2 生長階段溫度對重組菌生長和產(chǎn)酶的影響

在3 L發(fā)酵罐高密度發(fā)酵生產(chǎn)重組普魯蘭酶的過程中，本研究對重組菌生長階段分別采取不同的培養(yǎng)溫度以探究溫度對重組菌生長及產(chǎn)酶的影響，結(jié)果見圖2。重組菌生長階段的溫度分別為30，37 ℃，誘導(dǎo)溫度均為25 ℃。與起始發(fā)酵溫度37 ℃相比，起始發(fā)酵溫度在30 ℃條件下最終菌體生物量(OD600)略低，見圖2(a)。從圖2(b)～(d)可知，與生長階段溫度為37 ℃相比，在生長階段溫度為30 ℃條件下更有利于產(chǎn)酶，該條件下普魯蘭酶的最高胞內(nèi)酶活和胞外酶活分別達(dá)684.1，240.1 U/mL，最高總酶活為890.6 U/mL。據(jù)報(bào)道，pET-20b(+)質(zhì)粒在表達(dá)外源蛋白時(shí)往往伴隨著目的蛋白的本底表達(dá)[11]，重組大腸桿菌在較低溫度下的生長會通過減少形成無活性的包涵體來提高可溶性蛋白的比例[14]，而在較高的生長溫度下目的蛋白的本底表達(dá)會引起宿主細(xì)胞的應(yīng)激反應(yīng)，這種應(yīng)激反應(yīng)最終導(dǎo)致目的蛋白形成聚集體并在細(xì)胞內(nèi)積累，這對發(fā)酵后期菌體的產(chǎn)酶不利[11]。因此，在發(fā)酵過程中控制菌體的生長階段溫度為30 ℃。

2.3 誘導(dǎo)階段pH對重組菌生長和產(chǎn)酶的影響

大腸桿菌生長過程中，pH過高或者過低，都會導(dǎo)致菌體生長異常，需要控制pH范圍以保證菌體正常生長和產(chǎn)酶。因此，本研究在分別控制誘導(dǎo)階段pH為6.2，7.0的條件下，考察了pH對重組菌生長和產(chǎn)酶的影響，結(jié)果見圖3。

在重組菌的搖瓶發(fā)酵過程中，當(dāng)發(fā)酵液的pH>7.0時(shí)，普魯蘭酶的酶活力迅速下降，在48 h發(fā)酵結(jié)束后，酶活僅為3.2 U/mL[見圖3(a)]。若在發(fā)酵過程中，每隔一段時(shí)間，通過添加20%磷酸以維持發(fā)酵液的pH 在6.2～7.0，普魯蘭酶的活力會隨著發(fā)酵時(shí)間的延長而增加，普魯蘭酶的酶活最高達(dá)201.0 U/mL。重組普魯蘭酶的最適pH為5.0，當(dāng)pH過高時(shí)，重組酶酶活顯著下降[15]。從圖3(b)中可以看出，重組酶在室溫放置48 h后，pH 6.2下的該酶殘余酶活顯著高于pH 7.0的。綜上，發(fā)酵液pH維持在6.2最佳。

從搖瓶發(fā)酵結(jié)果可以看出，誘導(dǎo)階段發(fā)酵液的pH顯著影響重組菌產(chǎn)酶，因此在重組菌3 L發(fā)酵罐發(fā)酵過程中需對誘導(dǎo)階段的pH進(jìn)行優(yōu)化。與誘導(dǎo)階段發(fā)酵液pH為7.0時(shí)相比，pH為6.2，盡管菌體生物量有所降低[見圖3(c)]，但是在該條件下普魯蘭酶最高胞內(nèi)酶活[見圖3(d)]、胞外酶活[見圖3(e)]和總酶活[見圖3(f)]分別是pH 7.0 條件下的1.12，17.65，1.40倍。

2.4 乳糖流加速率對重組菌生長和產(chǎn)酶的影響

鑒于乳糖誘導(dǎo)強(qiáng)度對目的蛋白表達(dá)有重要影響，本研究對乳糖流加速率進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果見圖4。從圖4(a)可知，當(dāng)乳糖流加速度為0.2，0.4 g/(L·h)時(shí)，最高菌體濃度(OD600)分別為129，120；而當(dāng)乳糖流加速率為0.6 g/(L·h)時(shí)，菌體濃度(OD600)顯著降低，說明低誘導(dǎo)強(qiáng)度對重組菌生長影響較小，而較高的誘導(dǎo)強(qiáng)度則可能由于代謝壓力大而導(dǎo)致菌體濃度降低。由圖4(b)～(d)可以看出，乳糖的流加速率對重組菌產(chǎn)酶也有顯著影響，誘導(dǎo)強(qiáng)度過低或過高都不利于產(chǎn)酶，最佳的乳糖流加速率是0.4 g/(L·h)，在此條件下，普魯蘭酶的最高胞內(nèi)酶活和胞外酶活分別達(dá)到684.1，240.1 U/mL，總酶活達(dá)到890.6 U/mL。

圖3 pH對重組菌生長和產(chǎn)酶的影響以及室溫下重組普魯蘭酶的pH穩(wěn)定性Figure 3 Effect of pH on OD600 and pullulanase production in induction stage and pH stability of recombinant pullulanase at room temperature

2.5 誘導(dǎo)時(shí)間對重組菌生長和產(chǎn)酶的影響

誘導(dǎo)時(shí)間也是影響大腸桿菌表達(dá)重組蛋白的條件之一，合適的誘導(dǎo)時(shí)間既可使菌體高效生長，又不影響目的蛋白的產(chǎn)量[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，盡管在菌體OD600為15時(shí)，向發(fā)酵液中加入7.5 g/L甘氨酸，但是胞外分泌效率依然較低。因此，分別在菌體濃度OD600達(dá)到25，50，75時(shí)開始誘導(dǎo)，考察了誘導(dǎo)時(shí)間對重組菌生長和產(chǎn)酶的影響，結(jié)果見圖5。

從圖5可知，當(dāng)誘導(dǎo)OD600為25，50時(shí)，重組菌最終生物量均較低，而當(dāng)誘導(dǎo)OD600為75時(shí)，菌體濃度顯著提高。在重組菌產(chǎn)酶過程中，誘導(dǎo)OD600為25時(shí)，菌體產(chǎn)酶最低，可能是菌體濃度較低時(shí)誘導(dǎo)易導(dǎo)致菌體過早產(chǎn)酶，因而不利于菌體的良好生長，最終影響產(chǎn)酶，重組酶酶活偏低。當(dāng)誘導(dǎo)OD600為50時(shí)，重組普魯蘭酶的最高胞內(nèi)酶活和胞外酶活分別為684.1，240.1 U/mL，總酶活達(dá)到890.6 U/mL；在誘導(dǎo)OD600為75時(shí)，重組酶酶活下降，可能是在菌體濃度過高時(shí)誘導(dǎo)，菌體的細(xì)胞膜通透性變差，不利于目的蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)。綜合菌體生長和產(chǎn)酶情況，最佳誘導(dǎo)時(shí)間為OD600達(dá)到50時(shí)。

2.6 分批加入甘氨酸對重組菌生長和產(chǎn)酶的影響

雖然通過以上多個(gè)條件的優(yōu)化，普魯蘭酶的表達(dá)量得到了大幅度提高，但是大部分蛋白都位于周質(zhì)空間，并未分泌到胞外?？赡苁怯捎趐ET-20b(+)載體上的PelB信號肽主要用于外源蛋白在周質(zhì)空間的積累，難以到達(dá)胞外；或者所用條件不利于重組酶分泌[7]。為了提高胞外表達(dá)水平，需要研究增強(qiáng)胞外分泌的方法，本研究嘗試加入甘氨酸以提高胞外酶活。文獻(xiàn)[17]報(bào)道，在培養(yǎng)基中添加一定濃度甘氨酸有助于普魯蘭酶的胞外分泌，而高濃度(>5 g/L)的甘氨酸則會抑制菌體生長。因此，通過分批加入適量的甘氨酸以維持發(fā)酵液中的甘氨酸濃度在1～5 g/L，可能達(dá)到既不影響菌體生長，又能促進(jìn)目的蛋白胞外分泌的目的。甘氨酸優(yōu)化的具體策略如下：① 在菌體濃度OD600依次達(dá)到15，45，75時(shí)分別加入濃度為1.5 g/L的甘氨酸，菌體濃度OD600達(dá)到105時(shí)，再加入濃度為3 g/L的甘氨酸；② 在菌體濃度OD600依次達(dá)到15，45，75時(shí)分別加入濃度為2.5 g/L的甘氨酸，菌體濃度OD600達(dá)到105時(shí)，再加入濃度為5 g/L的甘氨酸；③ 在菌體濃度OD600依次達(dá)到15，45，75時(shí)分別加入濃度為4 g/L的甘氨酸，菌體濃度OD600達(dá)到105時(shí)，再加入濃度為8 g/L的甘氨酸，結(jié)果見圖6。

圖4 乳糖流加速度對重組菌生長和產(chǎn)酶的影響Figure 4 Effect of lactose flow rates on OD600 and pullulanase production

圖5 誘導(dǎo)時(shí)間對重組菌生長和產(chǎn)酶的影響Figure 5 Effect of induced point on OD600 and pullulanase production

從圖6 可知，與策略②和策略③相比，在策略①的條件下，菌體濃度和胞內(nèi)酶活、胞外酶活以及總酶活均為最高。在此策略下加入到發(fā)酵液中的甘氨酸濃度較低，在之后的短時(shí)間內(nèi)甘氨酸即被耗盡[見圖6(e)]，表明加入低濃度的甘氨酸可在不影響重組菌生長的同時(shí)促進(jìn)重組酶的胞外分泌；最終最高胞外酶活和胞內(nèi)酶活分別達(dá)到659.0，1 331.2 U/mL，最高總酶活為1 910.1 U/mL。甘氨酸能使細(xì)胞膜的通透性增強(qiáng)，有效促進(jìn)目的蛋白分泌，但較高濃度的甘氨酸易導(dǎo)致菌體生長受到抑制，菌體濃度和產(chǎn)酶也隨之降低。研究結(jié)果表明，分批加入適宜濃度的甘氨酸可有效促進(jìn)普魯蘭酶的胞外分泌，從而提高普魯蘭酶的可溶性表達(dá)，因此，采用策略①來提高重組普魯蘭酶可溶性表達(dá)和胞外分泌是可行的。

3 結(jié)論

本研究的目的是在3 L發(fā)酵罐水平上提高重組菌E.coliBL 21(DE3)/ pET20b(+)-BapulA的普魯蘭酶的表達(dá)量和胞外分泌。重組蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)會受到多因素的影響，如發(fā)酵過程中的溫度、pH和誘導(dǎo)濃度等。經(jīng)過以上策略的優(yōu)化，重組普魯蘭酶的最高總酶活達(dá)到1 910.1 U/mL，與搖瓶最高總酶活相比，提高了9.5倍。在后續(xù)研究中，還可通過選擇其他表達(dá)載體，以減少重組酶本底表達(dá)；或者優(yōu)化信號肽，以期獲得高效的重組蛋白胞外分泌效率，為普魯蘭酶的工業(yè)應(yīng)用提供依據(jù)。

圖6 甘氨酸濃度對重組菌生長產(chǎn)酶的影響以及發(fā)酵液中甘氨酸殘余濃度Figure 6 Effect of glycine concentration on OD600 and pullulanase production and glycine residues in fermentation broth