DC-CIK生物治療后肺癌患者Pro-GRP和T淋巴細(xì)胞亞群對(duì)免疫功能評(píng)價(jià)的臨床意義

何麗杰，馮賀強(qiáng)，褚相南，呂玉洋，張賀平

（天津市第五中心醫(yī)院 檢驗(yàn)科，天津 300450）

肺癌是目前世界上發(fā)病率和致死率最高的惡性腫瘤之一[1]。世界衛(wèi)生組織發(fā)布的《World Cancer Report 2014》指出肺癌仍是最普遍和最致命的癌癥。在中國(guó)，隨著空氣污染等問(wèn)題的日趨嚴(yán)重，每年肺癌新發(fā)病例為67.6萬(wàn)，死亡病例為56.5萬(wàn)，均居世界各國(guó)肺癌發(fā)病率和死亡率的第1位。由于小細(xì)胞肺癌（small cell lung cancer, SCLC）臨床上表現(xiàn)為高度惡性，腫瘤增長(zhǎng)較快，早期即發(fā)生區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，約70%的肺癌患者在確診時(shí)已經(jīng)屬于晚期，大部分患者喪失手術(shù)機(jī)會(huì)，轉(zhuǎn)而接受常規(guī)的化療、放療，而放化療的不良藥物反應(yīng)和耐藥性讓很多患者難于接受。在過(guò)去的20年中，生物免疫治療被認(rèn)為是一種新的“綠色療法”逐漸受到關(guān)注，其治療的原理是體外擴(kuò)增效應(yīng)細(xì)胞（如NK細(xì)胞、DC細(xì)胞、CIK細(xì)胞等），通過(guò)回輸效應(yīng)細(xì)胞，刺激機(jī)體的免疫應(yīng)答，依賴(lài)效應(yīng)細(xì)胞本身的高殺傷活性及自體的免疫系統(tǒng)共同抗擊腫瘤細(xì)胞。DC-CIK治療被廣泛使用，因?yàn)樗鼘?duì)多種癌癥的高增殖率和細(xì)胞毒活性，簡(jiǎn)單而溫和的培養(yǎng)期，很少有不良反應(yīng)且提高患者滿(mǎn)意度和依從性[2]。

本實(shí)驗(yàn)基于DC-CIK生物治療的研究，通過(guò)收集肺癌患者未治療前和經(jīng)生物治療1個(gè)月后血，監(jiān)測(cè)治療前后免疫功能、腫瘤標(biāo)志物等的變化，探討DC-CIK細(xì)胞治療對(duì)肺癌患者的治療效果，明確其對(duì)肺癌患者免疫功能的影響。本研究將對(duì)肺癌患者的支持治療及改善生活質(zhì)量具有積極意義，可為臨床規(guī)范應(yīng)用DCCIK細(xì)胞治療肺癌提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2014年9月-2015年8月天津市第五中心醫(yī)院就診的肺癌患者45例，其中，男性31例，女性14例；年齡43～86歲，中位數(shù)62歲。所有患者均經(jīng)過(guò)病理學(xué)確診，其中小細(xì)胞肺癌（small cell lung cancer, SCLC）13例，非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）32例，所有患者均為首次來(lái)院就診，均無(wú)其他免疫相關(guān)性疾病，且不合并其他惡性腫瘤，檢測(cè)前未接受過(guò)放化療及免疫治療。對(duì)照組選取同時(shí)期健康體檢者40例，其中，男性22例，女性18例；年齡56～64歲，中位數(shù)60歲。放化療、生物治療前清晨空腹采集患者肘正中靜脈血5 ml，胃泌素釋放肽前體（Pro-gastrin-releasing peptide, Pro-GRP）采用分離膠促凝管，T淋巴細(xì)胞亞群及調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulatory T cell, Treg）采用EDTA-K2抗凝血，采血后立即送檢驗(yàn)科4 h內(nèi)檢測(cè)完畢。

1.2 儀器與試劑

電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀Cobas E601（德國(guó)羅氏診斷有限公司），F(xiàn)C500流式細(xì)胞儀（美國(guó)貝克曼-庫(kù)爾特公司），血細(xì)胞分離機(jī)（美國(guó)FRESENIUS KABI公司），Pro-GRP、癌胚抗原（carcinoembryonic antigen,CEA）、神經(jīng)元特異性烯醇化酶（neuron-specific enolase, NSENSE）、細(xì)胞角蛋白19的可溶性片段（cytokeratin 19 fragment, CYFRA21-1）檢測(cè)試劑盒（德國(guó)羅氏診斷有限公司）。四色淋巴細(xì)胞亞群CD45-FITC/CD4-RD1/CE8-ECD/CD3-PC5、CD45-FITC/CD56-RD1/CD19-ECD/CD3-PC5、溶血素（OptiLyse C）Flow Count計(jì)數(shù)微球、0.01 mol PBS溶液、Immuntrol質(zhì)控血（美國(guó)貝克曼-庫(kù)爾特公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組

生物治療前Pro-GRP、T淋巴細(xì)胞亞群分3組，即對(duì)照組、SCLC組、NSCLC組。生物治療后分兩組，即SCLC組、NSCLC組。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 Pro-GRP、CEA、NSE及CYFRA21-1檢測(cè)在LIS系統(tǒng)輸入患者信息，受檢者外周血的Pro-GRP、CEA、NSE、CYFRA21-1按照儀器及試劑使用說(shuō)明書(shū)要求上機(jī)檢測(cè)，將結(jié)果分組記錄。

1.4.2 T淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè) 將樣本編號(hào)并錄入實(shí)驗(yàn)室信息系統(tǒng)（LIS），準(zhǔn)備與樣本相同數(shù)量流式細(xì)胞管并編號(hào)，在已編號(hào)流式細(xì)胞管中各加入10 μl四色抗體，渦旋混勻，室溫避光放置15～20 min；在已編號(hào)流式細(xì)胞管中用反向加樣法分別加入100 μl全血，取出試管，每管加入500 μl Opti Lyse C溶血素并立渦旋混勻2 s，20～25℃避光孵育10 min；在流式細(xì)胞管中加入500μl PBS，室溫平衡5 min；取出Flow-Count熒光微球，渦旋震蕩器勻10～12 s，以反向加樣法在各管中加入100 μl熒光微球（熒光微球的加樣量與樣本量一致），充分混勻，2 h內(nèi)上機(jī)檢測(cè)；登錄至LIS并復(fù)核轉(zhuǎn)錄是否正確。

1.4.3 Treg細(xì)胞檢測(cè) 取靜脈血100 μl加入已編號(hào)流式細(xì)胞管，分別加入CD4-PE標(biāo)記CD25-FITC標(biāo)記的熒光單克隆抗體20 μl，渦旋混勻，室溫避光放置15～20 min，加入細(xì)胞裂解液4 ml，渦旋混勻，室溫避光放置10 min待紅細(xì)胞完裂解，離心取上清，加入2 ml PBS洗滌2次，上機(jī)檢測(cè)。

1.4.4 DC-CIK細(xì)胞生物治療 血細(xì)胞分離機(jī)循環(huán)外周血4 000～5 000 ml，采集腫瘤患者外周血，循環(huán)4次，循環(huán)血量根據(jù)患者身高、體重等而定，采集外周血35 ml，單個(gè)核細(xì)胞數(shù)大約為1×108個(gè)，采血袋酒精消毒后，于傳遞窗送入細(xì)胞制備室（百萬(wàn)級(jí)GMP標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)間），進(jìn)行密度梯度離心，無(wú)菌制備PBMC，37℃孵育2～4 h，將懸浮細(xì)胞移出，貼壁細(xì)胞中，補(bǔ)充有1 000 u/ml粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF）和1 000 u/ml IL-4的培養(yǎng)基，37℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，第4天補(bǔ)充上述細(xì)胞因子，第6天加入攜帶多抗原Ad5型腺病毒，MOI=5，負(fù)載DC，第7天加入TNF-α，負(fù)載DC成熟，制備成DC疫苗。吸取懸浮細(xì)胞，用含INF-g的2%自體血清的完全培養(yǎng)基懸浮，調(diào)整細(xì)胞梯度至密度為2×106個(gè)/ml，接種于75 cm2培養(yǎng)瓶中，24 h后，向培養(yǎng)液中加入CD3單抗、重組人IL-2及重組人IL-1，誘導(dǎo)生成大量CIK細(xì)胞，每2天更換1次培養(yǎng)液，培養(yǎng)10～14 d后，根據(jù)細(xì)胞擴(kuò)增情況，收集CIK細(xì)胞并用生理鹽水洗滌2次。然后將細(xì)胞懸浮于含有20 g/L人血清清蛋白的100 ml生理鹽水中，并靜脈輸注給患者，細(xì)胞量每次＜1×1010個(gè)，活力＜95%，每周回輸1次共回輸3次，回輸前對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)液取樣進(jìn)行細(xì)菌、真菌、支原體和內(nèi)毒素檢測(cè)，回輸后以相同方法采集外周靜脈血檢測(cè)Pro-GRP和T淋巴細(xì)胞亞群。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，生物治療前后比較選用配對(duì)樣本t檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Pearson檢驗(yàn)，各組數(shù)據(jù)分別服從正態(tài)分布，且方差齊性，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Pro-GRP、CEA、NSE及CYFRA21-1在肺癌中的表達(dá)

Pro-GRP在SCLC組中高表達(dá)，有時(shí)甚至可高達(dá)5 000 pg/ml，對(duì)照組與SCLC組、NSCLC與SCLC組間Pro-GRP水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.304和-3.290，P =0.006），對(duì)照組與NSCLC組Pro-GRP水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-5.860，P =0.052）；Pro-GRP和NSE在SCLC組的表達(dá)高于NSCLC組，CYFRA21-1在NSCLC組的表達(dá)高于SCLC組，CEA在各組表達(dá)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表1。

2.2 DC-CIK生物治療前后Pro-GRP、T淋巴細(xì)胞亞群水平的比較

NSCLC組治療后CD3+、CD4+、CD4+/CD8+表達(dá)增高，CD8+、Treg細(xì)胞表達(dá)降低；而SCLC組治療后CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+表達(dá)增高。Treg細(xì)胞表達(dá)降低；兩組治療后的Pro-GRP水平與治療前比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05），均低于治療前。見(jiàn)表2。

2.3 DC-CIK生物治療前后兩組T淋巴細(xì)胞亞群的變化

DC-CIK細(xì)胞生物治療后NSCLC組CD8+淋巴細(xì)胞和Treg細(xì)胞較治療前降低，CD3+、CD4+淋巴細(xì)胞、CD4+/CD8+比值較治療前上升；SCLC組CD3+、CD4+、CD8+淋巴細(xì)胞數(shù)量較治療前均增加，Treg細(xì)胞兩組均較治療前降低。見(jiàn)圖1～5。

2.4 DC-CIK生物治療前后Pro-GRP與T淋巴細(xì)胞亞群相關(guān)性分析

SCLC組Pro-GRP治療前與CD3+、CD4+、CD8+、呈負(fù)相關(guān)，與Treg細(xì)胞呈正相關(guān)，治療后也存在相關(guān)性（P＜0.05）；在NSCLC組Pro-GRP與CD3+、CD4+、CD8+無(wú)相關(guān)，只與Treg細(xì)胞呈正相關(guān)。見(jiàn)表3。

表1 各組肺癌患者血清腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)水平的比較 （±s）

表1 各組肺癌患者血清腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)水平的比較 （±s）

注：?與對(duì)照組比較，P ＜0.05

組別Pro-GRP /（pg/ml）CEA/（ng/ml）NSE/（ng/ml）CYFR21-1/（ng/ml）對(duì)照組（n =40）34.93±16.082.93±1.368.66±2.081.57±0.75 SCLC組（n =13）1 943.71±208.53?13.49±2.7680.83±10.57?17.79±4.36 NSCLC組（n =32）47.69±24.1165.05±19.5117.79±4.3624.68±6.47?F值31.3202.48015.6753.123 P值0.0010.0910.0010.049

表2 DC-CIK細(xì)胞治療前后Pro-GRP、T淋巴細(xì)胞亞群水平的比較 （±s）

表2 DC-CIK細(xì)胞治療前后Pro-GRP、T淋巴細(xì)胞亞群水平的比較 （±s）

組別CD3+ /%CD4+ /%CD8+ /%CD4+/ CD8+Treg/%Pro-GRP/（pg/ml）NSCLC組（n =32）治療前59.6±3.631.7±2.827.3±3.61.2±0.215.0±3.947.69±24.11治療后62.3±3.835.8±2.623.8±1.91.5±0.111.7±4.037.13±15.23 t值10.43112.516-3.1097.120-6.132-3.915 P值0.0010.0010.0040.0010.0010.032 SCLC組（n =13）治療前49.4±12.125.8±5.923.8±6.21.1±0.19.0±1.21 943.71±208.53治療后59.2±9.930.9±5.428.4±4.91.2±0.17.6±1.1430.23±67.14 t值4.6995.1983.9511.213-8.153-3.911 P值0.0010.0010.0020.0410.0010.001

圖1 SCLC組治療前后T淋巴細(xì)胞亞群比較

圖2 NSCLC組治療前后T淋巴細(xì)胞亞群比較

圖3 NSCLC組治療前后T淋巴細(xì)胞比

圖4 SCLC組治療前后T淋巴細(xì)胞比

圖5 兩組治療前后Pro-GR水平比較

表3 DC-CIK生物治療前后Pro-GRP與T淋巴細(xì)胞亞群相關(guān)系數(shù)

3 討論

肺癌是一種原發(fā)于肺、氣管及支氣管的惡性腫瘤。惡性腫瘤患者普遍存在免疫功能低下，免疫細(xì)胞不能有效識(shí)別、排斥和殺滅腫瘤細(xì)胞，T淋巴細(xì)胞及亞群是機(jī)體關(guān)鍵性免疫活性細(xì)胞，在免疫監(jiān)視、殺傷靶細(xì)胞及免疫調(diào)節(jié)方面具有極重要的作用[3]。當(dāng)肺癌患者T淋巴細(xì)胞及其亞群數(shù)量發(fā)生變化或CD4+/CD8+細(xì)胞比值異常時(shí)，可視為免疫調(diào)節(jié)功能紊亂。

CD3+細(xì)胞反映機(jī)體總的細(xì)胞免疫狀態(tài)，一般為CD4+與CD8+細(xì)胞數(shù)之和。肺癌患者免疫功能紊亂或低下，細(xì)胞免疫功能處于抑制狀態(tài)，CD3+細(xì)胞減低。本研究顯示，DC-CIK細(xì)胞回輸生物治療后，患者體內(nèi)的淋巴細(xì)胞亞群發(fā)生明顯變化，CD3+、CD4+、CD4+/CD8+較治療前上升，DC-CIK生物治療增加IFN-g、IL-2細(xì)胞因子的分泌，促進(jìn)CD4+的分化和增殖，CD4+淋巴細(xì)胞輔助誘導(dǎo)其他淋巴因子抑制腫瘤細(xì)胞增生[4]，分泌IL-2、IFN-g、TNF-β等細(xì)胞因子殺傷腫瘤細(xì)胞，激活巨噬細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞抑制腫瘤基因表達(dá)，以達(dá)到抑制腫瘤病毒的繁殖，使腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)停滯，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[5]來(lái)調(diào)節(jié)機(jī)體其他免疫細(xì)胞的功能。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，NSCLC組SCLC組CD3+、CD4+、CD4+/CD8+治療前后的比較，表達(dá)增高證明DC-CIK免疫治療調(diào)節(jié)患者的免疫功能，提高患者的抗腫瘤免疫水平，恢復(fù)肺癌患者的免疫監(jiān)視功能。

抑制T細(xì)胞CD8+通過(guò)分泌IL-4、IL-5、IL-10、IL-13等細(xì)胞因子，直接對(duì)抗原呈遞細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞毒效應(yīng)，通過(guò)獨(dú)特型網(wǎng)絡(luò)抑制B細(xì)胞產(chǎn)生抗體[6]，本實(shí)驗(yàn)顯示，NSCLC組CD8+細(xì)胞在生物治療前后的比較結(jié)果下降，證明DC-CIK細(xì)胞抑制CD8+細(xì)胞的負(fù)向調(diào)節(jié)，CD8+細(xì)胞數(shù)量減少有利于抑制腫瘤持續(xù)增長(zhǎng)[7]，但是在SCLC組CD8+在生物治療后上升，兩組比較有差異，可能原因CD8+細(xì)胞根據(jù)是否表達(dá)CD28分為毒性T細(xì)胞和抑制T細(xì)胞，前者具有細(xì)胞毒性功能，后者具有免疫抑制功能[8]，這使得CD8+細(xì)胞具有雙相調(diào)節(jié)功能，兩者的相互作用在NSCLC和SCLC表達(dá)有差異，并且SCLC腫瘤惡性程度較高，廣泛浸潤(rùn)導(dǎo)致免疫監(jiān)視功能停滯，T淋巴細(xì)胞已基本喪失免疫功能，無(wú)法快速恢復(fù)至正常水平，導(dǎo)致兩者在CD8+細(xì)胞表達(dá)有差異，具體原因還需要進(jìn)一步的研究。

當(dāng)腫瘤發(fā)生免疫逃避時(shí)，Treg細(xì)胞通過(guò)分泌IL-6和IL-17細(xì)胞因子，誘導(dǎo)STAT3轉(zhuǎn)錄因子的活化，從而抑制CD4+和CD8+細(xì)胞及DC細(xì)胞的活化和增殖，DC-CIK生物治療前后NSCLC組與SCLC組Treg細(xì)胞較治療前下降，說(shuō)明DC-CIK生物治療降低Treg細(xì)胞表達(dá)、逆轉(zhuǎn)Treg細(xì)胞對(duì)腫瘤患者的免疫抑制作用，從而增強(qiáng)患者免疫識(shí)別和殺傷功能。

本研究采用電化學(xué)發(fā)光方法檢測(cè)Pro-GRP，實(shí)驗(yàn)顯示Pro-GRP和NSE在SCLC組高于NSCLC組，早期的實(shí)驗(yàn)報(bào)道證明Pro-GRP在SCLC組中具有高表達(dá)[9]，Pro-GRP對(duì)SCLC診斷的特異性和敏感性高于NSE[10-11]。本實(shí)驗(yàn)也證明Pro-GRP可以作為一種特異的SCLC腫瘤標(biāo)志物，在患者未經(jīng)治療前顯示出較高的水平，治療后呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，在SCLC組降低更加明顯。SCLC組Pro-GRP治療前與T淋巴細(xì)胞亞群呈負(fù)相關(guān)，與Treg細(xì)胞呈正相關(guān)，即Pro-GRP越高T淋巴細(xì)胞亞群數(shù)值越低，說(shuō)明SCLC患者的Pro-GRP越高其免疫調(diào)節(jié)功能越差，免疫抑制越強(qiáng)，而在NSCLC組并無(wú)相關(guān)性，研究證明Pro-GRP可以作為SCLC患者免疫功能的臨床評(píng)價(jià)指標(biāo)，在治療過(guò)程Pro-GRP的下降可以提示患者免疫功能變化，還需要擴(kuò)大標(biāo)本量，進(jìn)行更深一步的研究。

綜上所述，DC-CIK生物治療增強(qiáng)患者特異性殺傷腫瘤的能力，提高機(jī)體的免疫監(jiān)視功能，抑制腫瘤免疫逃逸，改善患者的免疫功能。DC-CIK生物治療提高傳統(tǒng)化療肺癌患者的療效，增強(qiáng)抗腫瘤效果[12-15]。然而，DC-CIK療法是目前不用于肺癌常規(guī)治療，主要因?yàn)榧?xì)胞療法需要個(gè)體化成本較高，因此，降低DCCIK療法的成本使其將來(lái)可提供給更多的患者。