索拉非尼對(duì)MHCC97-H肝癌細(xì)胞增殖、侵襲以及PRL-3蛋白表達(dá)的影響研究

馬盼，賈云宏

（1.錦州醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院，遼寧 錦州 121001；2.錦州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，遼寧 錦州 121001）

肝細(xì)胞癌進(jìn)展的特點(diǎn)是細(xì)胞異常分化快，快速浸潤(rùn)性生長(zhǎng)，轉(zhuǎn)移早，惡性程度高，預(yù)后差。盡管肝移植、手術(shù)切除或肝動(dòng)脈化療栓塞術(shù)（transcatheter arterial chemoembolization, TACE）治療可在一定程度上延緩病情的進(jìn)展，然而治療肝細(xì)胞癌的最大障礙仍然是侵襲和轉(zhuǎn)移，近年來(lái)研究[1]證實(shí)，肝再生磷酸酶3（phosphatases of regenerating liver 3, PRL-3）是一種與腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)的磷酸酶，它的過(guò)度表達(dá)增加癌細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)和侵襲。索拉非尼作為一種新型的分子靶向藥物在臨床實(shí)踐中已顯示出顯著的療效。索拉非尼能否下調(diào)肝癌細(xì)胞中PRL-3的表達(dá)，降低肝癌細(xì)胞的侵襲力鮮見(jiàn)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，本研究旨在探討索拉非尼對(duì)MHCC97-H肝癌細(xì)胞增殖抑制情況，對(duì)PRL-3蛋白表達(dá)水平的影響，以及對(duì)肝癌細(xì)胞侵襲力的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

MHCC97-H肝癌細(xì)胞株購(gòu)自上海細(xì)胞生物研究所，索拉非尼由德國(guó)拜耳公司生產(chǎn)，鼠抗人PRL-3多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Bio Legend公司，胰蛋白酶、四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）等均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 37℃，5% CO2飽和濕度，DMEM培養(yǎng)液中生長(zhǎng)，含有10%胚牛血清、青霉素100 u/ml及鏈霉素100 mg/L，消化傳代使用0.25%胰蛋白酶和0.02% EDTA液。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組 索拉非尼由100%二甲基亞砜（DMSO）溶解，實(shí)驗(yàn)組分別加入2、4、8和16 μmol/L的索拉非尼并且分別作用24、48和72 h以篩選最適合濃度和時(shí)間，對(duì)照組不加索拉非尼。

1.2.3 瑞氏-吉姆薩染色觀察細(xì)胞形態(tài) 準(zhǔn)備鋪有蓋玻片的6孔培養(yǎng)板以便于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種，同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照，加入FTY720，經(jīng)索拉非尼作用48 h，滴加無(wú)水乙醇風(fēng)干后加瑞氏吉姆薩染液染色30 s，PBS浸泡2 min，洗去染液，固定、晾干、封片和鏡檢拍照。

1.2.4 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制率 相同濃度MHCC97-H細(xì)胞懸液，實(shí)驗(yàn)組加2、4、8和16 μmol/L的索拉非尼。每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)24、48、72 h后每孔加入20 μl的MTT溶液，再培養(yǎng)4 h后終止，棄其上清后每孔加入DMSO溶液150 μl震蕩溶解10 min。在490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度（A）值。細(xì)胞增殖抑制率=（1-實(shí)驗(yàn)組吸光度值/對(duì)照組吸光度值）×100%。

1.2.5 Western blot檢測(cè)PRL-3蛋白表達(dá)的變化 收集經(jīng)處理48 h的對(duì)照組，2、4、8、16 μmol/L的索拉非尼各組細(xì)胞，經(jīng)裂解及離心后收集上清進(jìn)行蛋白定量；上樣緩沖液加入等量蛋白，煮沸、電泳及轉(zhuǎn)膜后加入PRL-3和β-action一抗4℃過(guò)夜，HRP標(biāo)記二抗孵育2 h，最后用ECL發(fā)光，X射線膠片進(jìn)行曝光、顯影、定影并應(yīng)用AlphaEase FC軟件分析圖像。

1.2.6 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn) 制備細(xì)胞懸液消化并且收集16 μmol/L的索拉非尼組細(xì)胞及對(duì)照組，調(diào)整細(xì)胞密度至5×104個(gè)/ml選取100 μl加入經(jīng)Matrigel包被的Transwell小室。放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)48 h后取出棄去培養(yǎng)液，用棉簽擦去基質(zhì)膠和上室內(nèi)未穿膜的細(xì)胞，經(jīng)固定漂洗后給予0.1%結(jié)晶紫染色，PBS洗3遍。400倍顯微鏡下隨機(jī)觀察及計(jì)數(shù)5個(gè)視野細(xì)胞。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較采用重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)的方差分析和單因素方差分析，在方差分析有意義的基礎(chǔ)上，采用LSD-t進(jìn)行兩兩比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 索拉非尼對(duì)MHCC97-H細(xì)胞的抑制作用

不同濃度的索拉非尼作用于MHCC97-H肝癌細(xì)胞24、48和72 h的細(xì)胞增殖抑制率比較，采用重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)的方差分析，結(jié)果：①不同濃度索拉非尼的細(xì)胞增殖抑制率有差異（F=147.352，P=0.000）；②不同作用時(shí)間下細(xì)胞增殖抑制率有差異（F=214.016，P=0.000）；③不同濃度索拉非尼細(xì)胞增殖抑制率變化趨勢(shì)有差異（F=157.263，P=0.000）（見(jiàn)表1和圖1）。在本實(shí)驗(yàn)的幾組濃度中篩選出索拉非尼進(jìn)一步研究作用時(shí)間和濃度分別為48 h和16 μmol/L。

表1 索拉非尼對(duì)MHCC97-H細(xì)胞的抑制作用（%，±s）

表1 索拉非尼對(duì)MHCC97-H細(xì)胞的抑制作用（%，±s）

組別24 h48 h72 h 2 μmol/L17.56±2.6828.21±2.9331.55±3.12 4 μmol/L26.38±3.1937.96±3.3140.05±3.40 8 μmol/L32.09±3.4753.67±3.5655.32±3.76 16 μmol/L47.08±3.6963.88±3.8964.56±3.95

圖1 索拉非尼對(duì)MHCC97-H細(xì)胞的抑制作用

2.2 細(xì)胞形態(tài)

光鏡下對(duì)照組細(xì)胞無(wú)核碎裂及溶解（見(jiàn)圖2A），經(jīng)16 μmol/L索拉非尼作用48 h后可觀察大部分細(xì)胞發(fā)生凋亡，染色質(zhì)固縮、胞核碎裂及凋亡小體等典型的凋亡形態(tài)（見(jiàn)圖2B）。

圖2 MHCC97-H細(xì)胞形態(tài)圖（瑞氏-吉姆薩染色×200）

2.3 PRL-3的蛋白表達(dá)

各組PRL-3表達(dá)的水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=394.769，P=0.000）。對(duì)照組中可見(jiàn)PRL-3條帶較粗，較強(qiáng)（見(jiàn)圖3），與對(duì)照組比較，2、4、8、16 μmol/L組中PRL-3灰 度 均 降 低（t=2.550、5.903、8.957和11.884，P=0.034、0.000、0.000和0.000）；與2 μmol/L組比較，4、8、16 μmol/L組中PRL-3灰度均降低（t=3.606、7.340和11.057，P=0.007、0.000和0.000）；與4 μmol/L組比較，8、16 μmol/L組中PRL-3灰度均降低（t=5.367和11.500，均P=0.000）；與8 μmol/L組比較，16 μmol/L組中PRL-3灰度降低（t=6.822，P=0.000）。濃度越高PRL-3蛋白表達(dá)量下降越明顯。見(jiàn)圖3和表2。

2.4 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果

細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，經(jīng)16 μmol/L索拉非尼作用48 h后，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組在穿過(guò)Transwell膜的肝癌細(xì)胞數(shù)進(jìn)行比較，采用t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=9.613，P=0.000），處理組穿膜細(xì)胞數(shù)低于對(duì)照組。見(jiàn)圖4。

圖3 不同濃度索拉非尼對(duì)PRL-3蛋白表達(dá)的影響

表2 經(jīng)索拉非尼作用后的PRL-3蛋白表達(dá)

圖4 索拉非尼抑制MHCC97-H肝癌細(xì)胞的體外侵襲能力

3 討論

3.1 肝癌的研究現(xiàn)狀

早期肝癌患者無(wú)明顯的癥狀，缺乏適當(dāng)?shù)谋O(jiān)測(cè)和篩選制度，大多數(shù)患者錯(cuò)過(guò)了最好的手術(shù)或肝移植機(jī)會(huì)。肝癌對(duì)放療和化療不敏感，其預(yù)后相對(duì)較差，主要是由于侵襲和轉(zhuǎn)移引起的快速進(jìn)展。細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)是一個(gè)復(fù)雜的多因素蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)，其中信息被有效地通過(guò)上游因子的激活傳遞，并轉(zhuǎn)移到下游效應(yīng)[2]。癌基因的異常表達(dá)是腫瘤形成、侵襲和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵。如果涉及腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的基因被確定，分子生物學(xué)技術(shù)可糾正它們的表達(dá)水平，肝癌的侵襲和轉(zhuǎn)移可以減少，從而延緩該疾病的進(jìn)展。在分子靶向治療的時(shí)代，確定預(yù)測(cè)的生物標(biāo)志物是個(gè)性化醫(yī)學(xué)成功實(shí)施的關(guān)鍵。隨著對(duì)肝癌腫瘤異質(zhì)性意義的進(jìn)一步了解，腫瘤標(biāo)志物的生物學(xué)特性可能是肝癌個(gè)性化靶向治療成功發(fā)展的一條途徑。隨著生物信息學(xué)技術(shù)的發(fā)展和完善，從細(xì)胞分子層面闡述腫瘤的作用機(jī)制，為分子靶向治療奠定了理論基礎(chǔ)。

通過(guò)識(shí)別異種腫瘤相關(guān)分子的驅(qū)動(dòng)程序，分子靶向?yàn)槟[瘤細(xì)胞的治療提供可觀的效果。識(shí)別腫瘤血管生成的作用改變以往對(duì)腫瘤的局限認(rèn)識(shí)，新的分子靶向治療藥物的出現(xiàn)使得癌癥的治療取得革命性的進(jìn)步[3]。目前有各種特定的和有效的單目標(biāo)/單基因藥物，但他們的成本是相當(dāng)昂貴的。此外，使用多個(gè)有針對(duì)性的靶向藥物，將不可避免地增加患者的身體負(fù)荷和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。因此，尋找高效能的多靶向藥物已成為治療癌癥患者的首要目標(biāo)[4]。隨著醫(yī)療技術(shù)的進(jìn)步，針對(duì)基因、受體和激酶的藥物已在臨床上應(yīng)用，并在一定程度上為許多腫瘤的治療提供巨大的前景。采用分子標(biāo)記或者腫瘤生物標(biāo)志物來(lái)理解這種高度侵襲性的作用機(jī)制，可以預(yù)測(cè)腫瘤的預(yù)后，為開(kāi)發(fā)新的治療方法提供重要的基礎(chǔ)研究。近年來(lái)開(kāi)發(fā)的藥物靶向基因和激酶受體應(yīng)用于臨床，推進(jìn)癌癥的治療到一個(gè)前所未有的新階段[5]。

3.2 索拉非尼在治療肝癌方面的應(yīng)用

肝癌靶向治療的關(guān)鍵是干擾腫瘤血管生成，目前所有新的藥物用于治療晚期肝細(xì)胞癌的療效以索拉非尼最為顯著[6]。索拉非尼能抑制PI3K/Akt、Ras/MAPK等通路，這將防止多藥耐藥途徑，有更高的療效和較低的不良反應(yīng)[7-9]。一些研究還測(cè)試TACE聯(lián)合索拉非尼在肝癌伴門(mén)靜脈癌栓治療的安全性和有效性[10]，聯(lián)合治療肝癌可進(jìn)一步提高療效[11]。索拉非尼在Raf/絲裂原活化蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)中起關(guān)鍵作用[12]，調(diào)節(jié)ERK激酶信號(hào)通路，從而降低Cyclin D1的表達(dá)和細(xì)胞周期阻滯。索拉非尼還可通過(guò)抑制酪氨酸激酶受體[13]抑制腫瘤血管生成，導(dǎo)致腫瘤組織缺血壞死。此外，索拉非尼也能通過(guò)MAPK依賴的機(jī)制抑制其活性，增加腫瘤細(xì)胞凋亡的內(nèi)在途徑[14]。索拉非尼是多激酶的血管生成抑制劑，它已成為晚期肝細(xì)胞癌的標(biāo)準(zhǔn)治療[15]。盡管索拉非尼可以抑制腫瘤細(xì)胞通過(guò)多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，但沒(méi)有相關(guān)研究驗(yàn)證是否能有針對(duì)性地抑制PRL-3通路。

3.3 PRL-3與腫瘤轉(zhuǎn)移的相關(guān)性

PRL-3是蛋白酪氨酸磷酸酶PRL亞組的一員，積極參與蛋白酪氨酸激酶信號(hào)通路的許多基本生理過(guò)程，調(diào)節(jié)多種酶的作用過(guò)程。越來(lái)越多的證據(jù)表明，PRL-3參與卵巢癌、胃癌、乳腺等[16-17]多種腫瘤細(xì)胞的增殖、生長(zhǎng)調(diào)節(jié)、轉(zhuǎn)移和侵襲。PRL-3被證明是腫瘤復(fù)發(fā)與多種人類癌癥患者預(yù)后的有用指標(biāo)。PRL-3在腫瘤血管生成及腫瘤侵襲性肝癌中起著關(guān)鍵的作用[18]，調(diào)節(jié)MMP-2、MMP-9和E-cadherin在肝癌中的功能。抑制PRL-3也降低IL-6誘導(dǎo)STAT3的磷酸化，從而調(diào)節(jié)機(jī)體自身的免疫狀態(tài)。最近一些研究[19]表明，PRL-3能夠控制多個(gè)信號(hào)通路，包括PI3K/Akt、Ras/MAPK和CSK/Src途徑，是細(xì)胞周期和細(xì)胞遷移的關(guān)鍵。PRL-3的高表達(dá)加速肝癌細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致更差的預(yù)后。PRL-3也被證明在PI3K/Akt活性主要負(fù)調(diào)節(jié)蛋白表達(dá)水平增加，同時(shí)下調(diào)Akt的活化，降低磷酸酶和張力蛋白同源物。PRL-3能通過(guò)自分泌分泌腫瘤壞死因子-α和白細(xì)胞介素6，激活NF-κB信號(hào)通路，引起機(jī)體免疫系統(tǒng)的破壞和激發(fā)炎癥反應(yīng)[20]。PRL-3已成為腫瘤轉(zhuǎn)移的重要標(biāo)志物之一[21]。探索PRL-3作為藥物分子靶標(biāo)抑制肝癌細(xì)胞侵襲與轉(zhuǎn)移已成為一種目前熱門(mén)課題。雖然大多數(shù)的腫瘤可以從單一的腫瘤細(xì)胞進(jìn)化克隆，但所有的惡性腫瘤是遺傳不穩(wěn)定，導(dǎo)致顯著的生化異質(zhì)性。雖然PRL-3是1個(gè)理想的分子靶點(diǎn)，其效用仍然不能令人滿意，主要由于腫瘤治療的特異性和敏感性鑒定缺乏。

3.4 本研究的意義和局限性

本研究發(fā)現(xiàn)本次實(shí)驗(yàn)最佳干預(yù)索拉非尼濃度為16 μmol/L，最佳干預(yù)時(shí)間為48 h。索拉非尼作用后肝癌細(xì)胞出現(xiàn)典型的核碎裂及細(xì)胞凋亡形態(tài)；MHCC97-H細(xì)胞經(jīng)索拉非尼作用后PRL-3蛋白量下調(diào)，侵襲力受到明顯抑制，索拉非尼對(duì)肝癌細(xì)胞的抑制作用表現(xiàn)出一定的時(shí)間和劑量效應(yīng)關(guān)系。索拉非尼可作用于多靶點(diǎn)，可能通過(guò)下調(diào)PRL-3蛋白從而減少肝癌細(xì)胞的侵襲，并誘導(dǎo)其凋亡。PI3K/Akt、Ras/MAPK等是索拉非尼和PRL-3調(diào)控的共同通路，此通路的抑制以及肝癌細(xì)胞侵襲力的下降可能是下調(diào)PRL-3蛋白，其作用機(jī)制需要進(jìn)一步的探索。

綜上所述，PRL-3是肝轉(zhuǎn)移的重要調(diào)節(jié)因子，索拉非尼可下調(diào)PRL-3蛋白的表達(dá)從而減少肝癌細(xì)胞的侵襲，本研究為實(shí)現(xiàn)索拉非尼的工藝改進(jìn)和集多靶點(diǎn)為一體奠定理論基礎(chǔ)。