子宮腔脫落細胞的DNA倍體分析技術應用于子宮內膜病變篩查的研究

華詔召　曾莉　曹俊巖

[摘要] 目的 探討子宮腔脫落細胞的DNA倍體分析技術應用于子宮內膜病變篩查的可行性及應用價值。 方法 選取2014年1月～2016年5月就診于貴陽中醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院疑似子宮內膜病變患者500例為研究對象，采集子宮腔脫落細胞標本，采用Feulgen染色和全自動DNA倍體分析系統分析患者DNA倍體情況，同時行分段診斷性刮宮術檢測，以分段診斷性刮宮術檢測結果為金標準，觀察DNA倍體分析對診斷子宮內膜病變的敏感性和特異性。 結果 分段診斷性刮宮術檢測發(fā)現，子宮內膜癌39例（78.0%），癌前病變98例（19.6%），子宮內膜量增生258例（51.6%），正常子宮內膜105例（21.0%）。子宮腔脫落細胞DNA倍體分析子宮內膜癌檢出率相似于病理檢查，差異無統計學意義（P > 0.05）；子宮腔脫落細胞DNA倍體分析癌前病變檢出率相似于病理檢查，差異無統計學意義（P > 0.05）。以病理活檢結果為金標準，DNA倍體分析篩查子宮內膜病變的敏感性、特異性、準確度分別為92.7%、83.8%、86.2%，DNA倍體分析篩查子宮內膜癌的敏感性、特異性、準確度分別為94.9%、67.7%、69.8%。 結論 DNA倍體分析對子宮內膜癌的篩選敏感性高，可用于子宮內膜病變的早期篩查，具有一定臨床推廣價值。

[關鍵詞] 子宮腔脫落細胞；DNA倍體分析；子宮內膜病變；篩查

[中圖分類號] R737.33 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2018）04（b）-0087-05

[Abstract] Objective To investigate the feasibility and application value of DNA quantitative analysis of uterine cavity exfoliated cells in screening endometrial lesions. Methods Five hundred patients with suspected endometrial lesions from January 2014 to May 2016 in the Second Affiliated Hospital of Guiyang Traditional Chinese Medicine College were selected as the research objects， specimens of uterine cavity exfoliated cells were collected， DNA ploidy was analyzed by Feulgen staining and automatic DNA quantitative analysis system， segmented diagnostic curettage was performed at the same time， the segmented diagnostic curettage results were the gold standard， the sensitivity and specificity of DNA quantitative analysis in diagnosis of endometrial lesions was observed. Results Segmental diagnostic curettage detection showed， 39 cases of endometrial carcinoma （78.0%）， 98 cases of precancerous lesion （19.6%）， 258 cases of endometrial hyperplasia （51.6%）， 105 cases of normal endometrium （21.0%）. The detection rate of endometrial carcinoma of DNA ploidy analysis of uterine cavity exfoliated cells was similar to pathological examination， the difference was not statistically significant （P > 0.05）. DNA ploidy analysis of exfoliated uterine cavity precancerous lesions were similar to the pathological examination， the difference was not statistically significant （P > 0.05）. With the pathological biopsy results as the gold standard， the sensitivity， specificity and accuracy of endometrial lesions DNA quantitative analysis were 92.7%， 83.8% and 86.2% respectively. The sensitivity， specificity and accuracy of DNA quantitative analysis in screening endometrial cancer were 94.9%， 67.7% and 69.8% respectively. Conclusion DNA quantitative analysis of endometrial cancer has high screening sensitivity， can be used for early screening of endometrial lesions， has a certain clinical value.

[Key words] Uterine cavity exfoliated cells； Image cytometry DNA ploidy； DNA quantitative analysis； Endometrial lesions； Screening

子宮內膜癌（endometrial cancer，EC）是發(fā)生于子宮內膜的一組上皮性惡性腫瘤，其死亡率居女性惡性腫瘤第二位，嚴重威脅女性生命健康[1]。目前子宮內膜癌的診斷主要借助診刮術進行組織學檢查，但其操作復雜，費用高，且存在病情長期監(jiān)控難、患者依從性差等問題[2]，因此亟需尋找一種質優(yōu)價廉、安全無痛、簡便易行、準確性高的子宮內膜病變篩查方法。脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）倍體分析技術通過定量檢測細胞核內染色體數目，并以此為依據判斷細胞的良惡性傾向[3]。在癌變和癌前病變細胞中，染色體常常發(fā)生非整倍體化，可作為診斷癌及癌前病變的特異性指征[4]。研究發(fā)現，細胞DNA定量分析技術可有效提高尿路上皮脫落細胞診斷尿路上皮癌的靈敏度和準確性[5]。陶偉等[6]應用DNA定量分析技術診斷肺癌的敏感度為69.2%，特異度為100.0%，與液基細胞學檢查聯合能顯著提高肺癌的陽性檢出率。本課題旨在探討子宮腔脫落細胞的DNA倍體分析應用于子宮內膜病變篩查中的可行性及應用價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2014年1月～2016年5月就診于貴陽中醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院（以下簡稱“我院”）疑似子宮內膜病變患者500例為研究對象，年齡30～79歲，平均（59.63±10.31）歲；絕經后患者392例。其中不明原因陰道流血者389例（389/500，77.80%），圍經期陰道異常排液者27例（27/500，5.40%）；絕經后陰道異常排液者11例（11/500，2.20%）；絕經后無臨床癥狀但經B超顯示宮腔內有不均質占位或子宮內膜厚度超過5 mm者（73/500，14.60%）。納入標準：①出現不明原因陰道異常出血或排液患者；②明確本研究內容并同意簽署知情同意書患者；③有3年及以上性生活史患者；④臨床資料完整患者。排除標準：①子宮頸病變引起陰道流血患者；②卵巢病變引起陰道流血患者；③陰道炎等病變引起陰道流血患者；④妊娠期婦女；⑤其他惡性腫瘤或嚴重全身性疾病患者；⑥中途退出刮宮術檢測患者。本研究經我院醫(yī)學倫理委員會批準通過。

1.2 研究方法

1.2.1 樣品采集及保存 DNA倍體分析樣品 于就診當日檢查并明確各受試者子宮位置和深度，采用SAP-I子宮內膜細胞采集器（北京賽普九洲科技公司）進入宮腔采集子宮腔脫落細胞，立即置于宮腔細胞保存液（北京賽普九洲科技公司）中，核對患者信息后貼好標簽，送至病理科檢驗DNA。病理檢測樣品：采集各受試者子宮腔脫落細胞的同時，行宮腔鏡診刮術采集患者宮頸管、宮腔組織標本，置于甲醛中固定，貼好標簽，送至病理科檢查。

1.2.2 組織病理學檢查 每位患者的子宮內膜組織切片經蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色后，經2位資深病理師閱片分析，按照2003年WHO診斷標準進行定性檢測[7]，分為以下4類：①未見子宮內膜病變，包括增生期子宮內膜、萎縮性子宮內膜、分泌期子宮內膜；②良性子宮內膜病變，包括子宮內膜炎、子宮內膜息肉、黏膜下肌瘤等；③不典型型子宮內膜增生，即癌前病變；④子宮內膜癌。以此診斷結果為金標準，進行對照診斷研究。

1.2.3 DNA定量分析檢測 將“1.2.1”中子宮腔脫落細胞懸液離心5 min，800 r/min，棄上清，重新懸浮下層細胞后，制備細胞薄片，采用福爾根（Feulgen）染色法進行染色、封片。采用Motic BA600-4全自動掃描顯微鏡（廈門麥克奧迪醫(yī)療診斷系統公司）對薄片進行掃描和檢測，以薄片中正常細胞作為參照，系統根據收集到的細胞核染色體分布、形態(tài)特征、局部特定特征等參數自動對受檢細胞進行分類和計數。其中DNA指數（DNA index，DI）可用來表示細胞中DNA含量：0.75≤DI<1.25，為DNA含量為2c的正常細胞；1.25≤DI≤2.50，為DNA含量為2c～5c的疑似病變細胞或增生細胞；DI>2.50，為DNA含量多于5c的病變細胞。參考DNA倍體分析對子宮頸癌的診斷標準[8]，進行分析，結果如下：①陰性病例：薄片內以正常細胞為主，未觀察到DI>2.50的病變細胞，且增生細胞比例低于5%；②可疑病例：觀察到1或2個DI>2.50的病變細胞或增生細胞比例在5%～10%之間；③陽性病例：觀察到3個或以上的病變細胞，或增生細胞比例>10%，其中分析結果為①和②的病例，均規(guī)定為DNA異倍體真陰性；③為DNA異倍體真陽性。所有DI>2.50的病變細胞均經資深病理師復核確認，以保證DNA定量分析檢測的準確性。

1.2.4 敏感性、特異性、準確度分析 以病理活檢結果為金標準，以檢測出子宮內膜病變?yōu)樵\斷陽性，計算出DNA倍體分析篩選子宮內膜病變的敏感性、特異性、準確度，敏感性=真陽性/病例組例數，特異性=真陰性/對照組例數，準確度=（真陰性+真陽性）/（對照組例數+病例組例數）。

1.3 統計學方法

采用SPSS 13.0統計學軟件進行數據分析，計數資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗，以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 子宮內膜組織病理學表現

正常子宮內膜組織子宮內膜形態(tài)規(guī)則（圖1 A），異常增生子宮內膜組織結構不規(guī)則（圖1 B），子宮內膜癌組織內膜形態(tài)極度不規(guī)則，出現大量腔隙（圖1 C）。

2.2 子宮腔脫落細胞DNA倍體分析結果

DNA倍體分析發(fā)現陰性病例子宮內膜組織中以DNA含量為2c的正常細胞為主，未見病變細胞，且增生細胞比例低于5%（圖2A）；可疑病例子宮內膜組織中出現大量DNA含量為2.5c～5c的疑似病變細胞或增生細胞，少見DNA含量≥5c的病變細胞（圖2B）；陽性病例子宮內膜組織中多為DNA含量為2.5c～5c的疑似病變細胞或增生細胞，DNA含量≥5c的病變細胞增多（圖2C）。

2.3 病理學檢測結果與子宮腔脫落細胞DNA倍體分析檢測結果的比較

子宮腔脫落細胞DNA倍體分析子宮內膜癌檢出率相似于病理檢查，差異無統計學意義（P > 0.05）；子宮腔脫落細胞DNA倍體分析癌前病變檢出率相似于病理檢查，差異無統計學意義（P > 0.05）；子宮腔脫落細胞DNA倍體分析子宮內膜良性增生檢出率低于病理檢查，差異有統計學意義（P < 0.05）；子宮腔脫落細胞DNA倍體分析正常子宮內膜檢出率低于病理檢查，差異有統計學意義（P < 0.05）。見表1。

2.4 子宮腔脫落細胞DNA倍體分析篩查子宮內膜病變及子宮內膜癌的診斷效率

以病理活檢結果為金標準，DNA倍體分析篩查子宮內膜病變的結果見表2。以病理檢查結果為癌前病變和子宮內膜癌作為子宮病變篩查陽性的標準，DNA倍體分析子宮內膜病變篩查的敏感性為92.7%，特異性為83.8%，準確度為86.2%。以病理檢查結果子宮內膜癌作為子宮內膜癌篩查陽性的標準，DNA倍體分析子宮內膜病變篩查的敏感性為94.9%，特異性為67.7%，準確度為69.8%。見表3。

3 討論

子宮內膜癌是發(fā)生于女性生殖器最常見的婦科惡性腫瘤之一，近年來其發(fā)病呈年輕化趨勢[9]。目前對子宮內膜癌的診治技術雖然已取得一定完善與進步，但子宮內膜癌仍然嚴重威脅女性的生命健康。早期患者預后好，晚期患者治療效果差，Ⅳ期患者存活率為5%～15%[10]，由此可見，提高子宮內膜癌早期診斷的精確性對改善患者預后十分重要。因此，必須對子宮內膜病變的早期篩查給予高度重視。

惡性腫瘤的發(fā)生源于組織細胞內遺傳物質的改變，癌變細胞中DNA倍體多出現異常，染色體數目增多，產生異倍體細胞[11-12]。DNA的異常變化常早于細胞形態(tài)學變化，因此測定DNA含量以預測腫瘤的發(fā)生可能優(yōu)于觀察細胞形態(tài)的變化。Xu等[13]發(fā)現，腫瘤較大、分化較高的晚期乳腺癌患者乳腺細胞發(fā)生DNA異倍體化的可能性更大，異倍體患者的臨床療效明顯弱于二倍體患者。Nishimura等[14]研究表明，胃癌組織中USP44高表達與DNADNA異倍化密切相關，與非整倍體胃癌患者無進展生存期和總體生存期密切相關。Mauland等[15]發(fā)現，DNA異倍化與子宮內膜癌患者年齡、FIGO分期和分級、ER/PR陰性以及生存率明顯相關，DNA異倍體化是ER/PR陰性子宮內膜癌患者低生存率、高淋巴結轉移率和高復發(fā)率的危險預測因子。本研究發(fā)現，正常子宮內膜組織中細胞內DNA含量為2c，異常子宮內膜組織中出現DNA含量為2.5c～5c的疑似病變細胞或增生細胞，并可見少量DNA含量>5c的病變細胞，癌變子宮內膜組織中多為DNA含量為2.5c～5c的細胞，且DNA含量>5c的細胞增多。提示細胞內DNA倍體的改變與子宮內膜癌發(fā)生發(fā)展有關。

細胞DNA倍體分析可在組織細胞未發(fā)生明顯形態(tài)學改變前檢測出病變細胞，實現早期診斷。Dayal等[16]發(fā)現，DNA定量分析可增加p53、HER2等對乳腺癌的預測價值，與患者預后有關。Fadhil等[17]發(fā)現DNA定量分析可有效預測結直腸癌的發(fā)生。甘密密等[18]發(fā)現DNA異倍體細胞數目與宮頸病變程度正相關。本研究發(fā)現，在確診子宮內膜癌病例中，37例為DNA異倍體陽性，癌前病變中，90例為DNA異倍體陽性，子宮腔脫落細胞DNA倍體分析癌前病變檢出率相似于病理檢查，其篩查子宮內膜病變的敏感性為92.7%，特異性為83.8%，準確度為86.2%，與楊寶華等[19]應用DNA定量分析技術篩查子宮內膜病變的結果基本一致。表明DNA定量倍體分析具有可重復性和客觀性，可應用于子宮內膜病變的篩選。進一步分析發(fā)現，子宮腔脫落細胞DNA倍體分析子宮內膜癌檢出率相似于病理檢查，其篩查子宮內膜癌的敏感性高達94.9%，特異性和準確度分別為67.7%和69.8%。提示DNA倍體分析可有效篩查出子宮內膜癌高?；颊?，從而有針對性地進行組織活檢。

本研究中有2例子宮內膜癌患者未檢測出DNA異倍體陽性，回顧性分析患者的臨床資料發(fā)現，漏診患者均表現出絕經期陰道不規(guī)則出血癥狀，由于子宮內膜癌的發(fā)生、發(fā)展是一個由子宮內膜良性增生到不規(guī)則增生再到癌變的連續(xù)惡化過程[20]，任意階段病變均可能導致陰道不規(guī)則流血的發(fā)生。另外，有時腫瘤的發(fā)生不涉及DNA倍體的變化，推測漏診患者可能是二倍體腫瘤。而DNA倍體分析只能檢測出DNA倍體發(fā)生變化的腫瘤患者，無法檢測出二倍體腫瘤患者，因此，對可疑病例須結合診斷性刮宮術進行組織病理學檢測，以提高DNA倍體分析篩選子宮內膜癌的準確性。

綜上所述，子宮腔脫落細胞DNA倍體分析技術安全易行，敏感性高，且具有可重復性，可應用于子宮內膜病變尤其是子宮內膜癌的篩查，具有重要的應用價值。但本研究所選病例局限于貴州地區(qū)，且數據量較小，尚需要擴大研究范圍，增加病例數目進一步驗證。

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（收稿日期：2017-12-12 本文編輯：任 念）