應(yīng)用逐步回歸和Fisher判別方法對(duì)沉香的鑒別1)

賈東宇　伊松林　何正斌

(北京林業(yè)大學(xué)，北京，100083)

沉香是瑞香科白木香屬Aquilariasinensis(Lour.) Gilg植物受到傷害后分泌的產(chǎn)物[1]。林業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)LY/T 2904—2017《沉香》將其定義為沉香屬樹(shù)種在生長(zhǎng)過(guò)程中形成的由木質(zhì)部組織及其分泌物共同組成的天然混合物質(zhì)。沉香以其藥用價(jià)值和獨(dú)特的芳香氣味遠(yuǎn)近馳名，被用于中藥、制香、宗教等領(lǐng)域[2-5]。在東南亞、南亞等國(guó)家也稱(chēng)作Agarwood、Eaglewood、Gaharu、Jinko、Aloeswood、Pokok karas、Kalamabak等[5-6]。

奇楠(也叫棋楠)香味獨(dú)特，資源稀缺，是沉香中最名貴、價(jià)值最高的品種[7-8]。除奇楠以外的沉香，稱(chēng)之為普通沉香。普通沉香以其產(chǎn)地不同被分為兩類(lèi)，即惠安系沉香和星洲系沉香?；莅蚕党料惝a(chǎn)地包括中國(guó)、越南、柬埔寨、印度、泰國(guó)、老撾、緬甸等；星洲系沉香產(chǎn)區(qū)包括馬拉西亞、印尼和文萊等[9-10]。與星洲系沉香相比，惠安系沉香因其香味更受歡迎，所以售價(jià)更高[9-10]。3種沉香同為沉香，但是價(jià)格相差甚遠(yuǎn)。區(qū)分3種沉香需要豐富的經(jīng)驗(yàn)，沒(méi)有經(jīng)驗(yàn)的消費(fèi)者很容易將三者混淆。通常通過(guò)人工對(duì)奇楠、星洲系沉香和惠安系沉香進(jìn)行鑒別。人工鑒別的原理是品鑒沉香加熱后釋放出揮發(fā)性有機(jī)化合物(VOSs)的味道。由有經(jīng)驗(yàn)的品香師通過(guò)加熱或者點(diǎn)燃沉香(沉香片或者沉香精油)釋放出來(lái)的味道進(jìn)行品鑒區(qū)分。這種方法具有一定的局限性，表現(xiàn)在人工鑒定可能存在的主觀性引入的誤差、可重復(fù)性差、耗時(shí)，且對(duì)品香人員有經(jīng)驗(yàn)要求[9]。

沉香主要內(nèi)含物成分為倍半萜(52%)、色酮類(lèi)物質(zhì)(41%)和其他芳香化合物[4,11-13]。加熱后釋放出的VOCs主要為倍半萜和其他芳香族化合物。許多倍半萜物質(zhì)具有獨(dú)特的香味，導(dǎo)致沉香香味不同[5,14]。近年來(lái)通過(guò)GCMS方法對(duì)沉香成分的探索和鑒別研究備受學(xué)者關(guān)注[4-6,10,14-19]。然而，對(duì)奇楠、惠安系沉香和星洲系沉香的鑒別鮮有人探尋。本研究通過(guò)熱脫附-氣質(zhì)聯(lián)用法(TD-GCMS)結(jié)合逐步回歸法(SR)和Fisher判別分析(FDA)對(duì)沉香加熱后釋放的揮發(fā)性有機(jī)化合物(VOCs)成分進(jìn)行分析，目的在于模仿人工方法，實(shí)現(xiàn)對(duì)奇楠、惠安系沉香和星洲系沉香的鑒別，同時(shí)避免由人為主觀因素等引入的鑒定誤差。

1　材料與方法

1.1　材料與樣品制備

本研究共選取58個(gè)沉香樣品，其中16個(gè)奇楠樣品、27個(gè)惠安系沉香樣品和15個(gè)星洲系樣品。其中奇楠和惠安系沉香產(chǎn)于中國(guó)、越南、印度、泰國(guó)、柬埔寨等地，星洲系沉香產(chǎn)于印尼、馬來(lái)西亞、文萊、巴布亞新幾內(nèi)亞、蘇門(mén)答臘等地。本研究的所有樣品均由北京沉香協(xié)會(huì)提供，并經(jīng)過(guò)協(xié)會(huì)專(zhuān)家組鑒定分類(lèi)與實(shí)際相符。

本研究針對(duì)沉香VOCs的釋放特性，對(duì)沉香進(jìn)行熱處理。全部樣品切成小片狀或者屑狀，經(jīng)過(guò)氣干后，磨成40目的沉香粉末。每個(gè)沉香樣品取粉末20 mg，分別置于頂空瓶擰緊，用氮?dú)庀礆?，加熱?60 ℃，保溫1 h。通過(guò)上述過(guò)程，沉香樣品受熱揮發(fā)的VOCs被收集于頂空瓶中。用Tenax管采集沉香VOCs，載氣為氦氣，流速6 mL/min，采集時(shí)間為50 min，用于GCMS檢驗(yàn)。

1.2　設(shè)備與參數(shù)

本研究采用TD-GCMS聯(lián)用設(shè)備，其中TD設(shè)備型號(hào)為T(mén)D MARKES Series 2；氣相色譜設(shè)備型號(hào)為Agilent 7890A；質(zhì)譜設(shè)備型號(hào)為Agilent 5975C；色譜柱型號(hào)為DM 726641A(50 m×320 μm×1 μm;325 ℃)。參數(shù)設(shè)置如下：傳輸線(xiàn)溫度180 ℃，解析溫度280 ℃，冷阱溫度-10 ℃，氦氣載氣80 mL/min；離子源溫度230 ℃，質(zhì)譜掃描范圍35～400。升溫程序：初溫40 ℃，保持1 min；以5 ℃/min的速率升到150 ℃，再以1 ℃/min的速率升到170 ℃，保持3 min；再以1 ℃/min的速率升到180 ℃，保持3 min；再以10 ℃/min的速率升到200 ℃；再以20 ℃/min的速率升到280 ℃，保持1 min。氦氣載氣3 mL/min，不分流。輸出最小峰面積為最大峰面積的1%，選擇NIST14質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)庫(kù)和搜索程序?yàn)橘|(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)。取相似度80%及以上的倍半萜及其他簡(jiǎn)單芳香化合物成分為分析對(duì)象。

1.3　逐步回歸法(SR)

逐步回歸法(SR)是對(duì)復(fù)雜數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分類(lèi)之前的一種處理方法[20]。采用有進(jìn)有出的算法，按照變量是否重要，逐步引入變量，同時(shí)考慮較早引入的變量會(huì)因新變量的引入喪失重要性，變得不再顯著，此時(shí)可以剔除，直至判別式中沒(méi)有不重要的變量需要剔除。本研究建立SR模型旨在逐步篩選出特征化學(xué)成分。遵循兩個(gè)原則：a、每次選擇Λ最小者進(jìn)入模型。首先選擇Λ最小進(jìn)入模型，然后重新計(jì)算未被選中的其他變量與選中變量的Λ統(tǒng)計(jì)量，剩余統(tǒng)計(jì)量最小者與已經(jīng)進(jìn)入模型的變量搭配進(jìn)入模型。b、當(dāng)F>Fαin或P<αin時(shí)進(jìn)入，當(dāng)F≤Fαout或P≥αout時(shí)剔除。本研究規(guī)定αin=0.05和αout=0.10。邊進(jìn)入邊剔除，一步一步以此類(lèi)推。

1.4　Fisher判別分析法(FDA)

Fisher判別分析(FDA)是一種用來(lái)分開(kāi)兩種或兩種以上的物體或事件的線(xiàn)性組合法[21-22]，是一個(gè)經(jīng)典的監(jiān)督學(xué)習(xí)方法。原理是利用降維的方法找到最好的D-1維平面，將一個(gè)D維空間分成兩個(gè)或更多子空間，定義為類(lèi)間方差與類(lèi)內(nèi)方差之比[23]。FDA是一種經(jīng)典的有監(jiān)督學(xué)習(xí)方法，常用于動(dòng)植物識(shí)別領(lǐng)域。本研究以SR篩選出的特征化合物為變量建立FDA模型，可更為精確地判定樣品歸屬。

本研究的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)使用SPSS19.0 software完成,所有配圖通過(guò)OriginPro 9.0 software繪制。

2　結(jié)果與分析

2.1　沉香的GCMS檢測(cè)成分

對(duì)58個(gè)沉香樣品進(jìn)行TD-GCMS分析。經(jīng)分析沉香樣品的VOSs成分共含有175種倍半萜及其他芳香化合物(序號(hào)V001-V175)(見(jiàn)表1)。

表1　175種化學(xué)成分及其參數(shù)

續(xù)(表1)

續(xù)(表1)

注：CAS號(hào)為美國(guó)化學(xué)會(huì)的美國(guó)化學(xué)文摘服務(wù)社化學(xué)物質(zhì)登錄號(hào)。

從表1可以看出，175種化學(xué)成分中，包含158種倍半萜及17種其他芳香化合物。175種化學(xué)成分對(duì)應(yīng)26個(gè)相對(duì)分子質(zhì)量，158種倍半萜共享9個(gè)相對(duì)分子質(zhì)量。其中相對(duì)分子質(zhì)量190.172、202.172、204.188、218.167、220.183、222.198、234.162均含有多個(gè)同分異構(gòu)體。

表2　3種沉香中倍半萜及其他芳香族化合物組成

結(jié)合表1、表2可以看出：

①3種沉香倍半萜成分相對(duì)總峰面積高于其他芳香族化合物成分，倍半萜成分種類(lèi)數(shù)量也高于其他芳香族化合物成分。特別是相對(duì)分子質(zhì)量為204.188、220.183、222.198的相對(duì)峰面積和化合物種類(lèi)都很豐富，說(shuō)明沉香種含有大量倍半萜，且多以同分異構(gòu)體形式存在。同分異構(gòu)體倍半萜可以作為鑒別沉香的重點(diǎn)考查成分。

②3種沉香的倍半萜相對(duì)總峰面積中，惠安系沉香最低(31.38%)，奇楠最高(45.89%)；其他芳香族化合物相對(duì)峰面積，星洲系沉香最高(15.40%)，另外兩種沉香基本持平。這些相對(duì)峰面積差異可以為鑒別3種沉香提供依據(jù)。

③研究表明沉香內(nèi)含物中，倍半萜約占到52%，在本研究方法及條件下，倍半萜成分檢出率約為61.2%～88.3%。前人研究證明在200 ℃以下時(shí)，倍半萜不裂解，因此本研究未檢出的倍半萜可能因?yàn)槭菧囟任催_(dá)到全部倍半萜成分的沸點(diǎn)。因此，建議若要提高倍半萜檢出率，可以在本研究方法基礎(chǔ)上適當(dāng)提高試驗(yàn)溫度。

2.2　逐步回歸分析

175種化合物對(duì)于建立判別分析模型及分析模型的應(yīng)用來(lái)說(shuō)過(guò)于繁雜，也會(huì)給實(shí)際計(jì)算和檢測(cè)帶來(lái)麻煩。SR結(jié)合判別分析作為有監(jiān)督分析方法常用于樣本的分類(lèi)，可以實(shí)現(xiàn)給定的樣本類(lèi)間最大分離[25-26]。本研究采用SR分析作為判別分析的前處理，對(duì)175種化合物進(jìn)行篩選，旨在鎖定數(shù)量較少的特征化合物，用于接下來(lái)建立判別模型。

依據(jù)58個(gè)樣品對(duì)應(yīng)的175個(gè)化合物及其相對(duì)峰面積，建立逐步分析模型。分別計(jì)算每個(gè)化合物的Λ、F和P。再根據(jù)P值剔除成分，邊進(jìn)入邊剔除，一步一步以此類(lèi)推。共篩選出34種特征化合物(以X1-X34表示)，其中包含8個(gè)相對(duì)分子質(zhì)量(見(jiàn)表3)，即134.073、136.089、202.172、204.188、218.167、220.183、222.198和234.162。其中134.073(C9H10O，4-甲氧基苯乙烯)和136.089(C9H12O，4-乙基苯甲醚)為其他芳香族化合物。其余6個(gè)相對(duì)分子質(zhì)量均為倍半萜物質(zhì)：202.172(C15H22，8個(gè)同分異構(gòu)體)、204.188(C15H24，15個(gè)同分異構(gòu)體)、218.167(C15H22O)、220.183(C15H24O)，222.198(C15H26O，6個(gè)同分異構(gòu)體)和234.162(C15H22O2)。

圖1為3種沉香對(duì)應(yīng)34種特征化合物的相對(duì)峰面積，其中橫坐標(biāo)為34種特征化合物，縱坐標(biāo)為對(duì)應(yīng)相對(duì)峰面積的平均值，奇楠為16個(gè)樣品平均相對(duì)峰面積，惠安系沉香為27個(gè)樣品相對(duì)峰面積，星洲系沉香為15個(gè)樣品平均相對(duì)峰面積。對(duì)比3種沉香中的34個(gè)特征化合物相對(duì)峰面積，可以看出：

①3種沉香特征化合物相對(duì)峰面積存在明顯差異，說(shuō)明34種特征化合物能作為區(qū)分3種沉香的依據(jù)。

②3種沉香的001460-73-7(222.198)、1000374-17-1(204.188)、117066-77-0(222.198)等倍半萜類(lèi)特征化合物相對(duì)峰面積均較高，說(shuō)明倍半萜在3種沉香內(nèi)均大量存在。

③3種沉香均含有其他芳香族化合物000637-69-4(C9H10O，4-甲氧基苯乙烯)，其中奇楠中相對(duì)峰面積最高，惠安系沉香和星洲系沉香中相對(duì)峰面積較低且基本持平。這說(shuō)明其他芳香族化合物可以作為鑒別奇楠的依據(jù)。

圖1　3種沉香34種特征化合物的相對(duì)峰面積

2.3　Fisher判別分析

2.3.1Fisher判別公式及重心坐標(biāo)計(jì)算

對(duì)58個(gè)沉香樣品及其34種特征化學(xué)成分建立模型，分為奇楠(j=1)、惠安系沉香(j=2)和星洲系沉香(j=3)3個(gè)總體。

其中，當(dāng)j=1時(shí)，X1代表奇楠，m=16，n=34；當(dāng)j=2時(shí)，X2代表惠安系沉香，m=27，n=34；當(dāng)j=3時(shí)，X3代表星洲系沉香，m=15，n=34。

各類(lèi)平均值計(jì)算公式：

(1)

總均值計(jì)算公式：

(2)

特征根數(shù)量=min(j-1,n)=min(2,34)=2，所以該模型具有兩個(gè)特征根，以及兩個(gè)判別方程。

為了方便計(jì)算和應(yīng)用，本研究選用非標(biāo)準(zhǔn)化判別函數(shù)，其Fisher判別函數(shù)定義為：

y=a′x+c

。

(3)

常數(shù)項(xiàng)計(jì)算公式為

(4)

Fisher判別函數(shù)系數(shù)及常數(shù)見(jiàn)表3，代入判別函數(shù)可以得到Fisher判別方程：

Y1=16.136×X1-19.772×X2+2.063×X3-0.431×X4+

187.72×X5+3.029×X6-4.202×X7-2.101×X8-

8.746×X9+7.097×X10+2.684×X11+4.727×X12+

11.256×X13+2.25×X14-2.343×X15+18.535×X16-

5.831×X17-2.597×X18+2.967×X19-210.297×X20-

65.473×X21+7.25×X22-242.104×X23-343.576×

X24+40.152×X25-5.476×X26+38.095×X27-1.703×

X28-1.712×X29-9.024×X30+4.493×X31+245.128×

X32+29.538×X33+1.279×X34-19.197。

(5)

Y2=-0.243×X1-9.84×X2+16.992×X3+0.239×X4+

10.162×X5+4.274×X6+0.178×X7-0.434×X8+

15.494×X9-18.678×X10+0.023×X11+1.456×

X12+0.733×X13-13.19×X14-0.302×X15+6.866×

X16+4.462×X17-0.775×X18+0.177×X19-32.506×

X20-13.481×X21+1.486×X22-21.823×X23+19.683×

X24+30.779×X25+0.974×X26-5.727×X27-6.239×

X28+0.008×X29+1.413×X30+0.243×X31-25.27×

X32+5.729×X33-0.157×X34-4.87。

(6)

其中Y1和Y2分別為Fisher判別方程(公式5和公式6)的值。

值得一提的是，F(xiàn)isher判別模型并未給出分類(lèi)法，本實(shí)施例中選取不加權(quán)法計(jì)算各組重心。公式為

(7)

同理可計(jì)算其他兩組。奇楠的重心坐標(biāo)D1為(-6.742,8.263)；惠安系沉香的重心坐標(biāo)D2為(-18.233，-3.930)；星洲系沉香的重心坐標(biāo)D3為(40.011，-1.739)。

2.3.2Fisher判別模型的評(píng)價(jià)

λ的方差計(jì)算：

λ1的方差=613.032/(613.032+28.268)=95.592%；

λ2的方差=28.268/(613.032+28.268)=4.408%。

Λ統(tǒng)計(jì)量的計(jì)算：

自由度的計(jì)算公式：

dk=(n-k+1)(j-k)。

(8)

d1=(n-k+1)(j-k)=(34-1+1)(3-1)=68；d2=(n-k+1)(j-k)=(34-2+1)(3-2)=33

卡方的計(jì)算公式：

(9)

表3　3類(lèi)沉香Fisher判別函數(shù)系數(shù)、特征化學(xué)成分及其CAS號(hào)

表4　FDA的特征值

表5　FDA的Λ統(tǒng)計(jì)量

圖2　58個(gè)沉香樣品的Fisher判別方程值

由表4所述FDA模型的描述可知，判別函數(shù)的特征根為(613.032和28.268)，兩個(gè)特征根累計(jì)解釋了100%的方差，相關(guān)系數(shù)分別為0.999和0.983；表5是Λ統(tǒng)計(jì)量，用于描述Fisher判別模型的判別能力，可以看出判別函數(shù)的判別能力顯著(P=0)；圖2是以58個(gè)樣品的Fisher判別方程的值(Y1和Y2)作圖，可以看出3種沉香被有效區(qū)分開(kāi)。這表明該Fisher判別方程效果顯著，該模型適用于奇楠、惠安系沉香和星洲系沉香3種沉香的鑒別。

值得指出的是FDA可以用于對(duì)未知樣品的類(lèi)別鑒別。采用與本研究相同的試驗(yàn)方法及條件對(duì)未知樣品進(jìn)行試驗(yàn)，分別計(jì)算出34種特征化合物對(duì)應(yīng)的相對(duì)峰面積，代入公式5和公式6中，求出未知樣品的坐標(biāo)(Y1，Y2)，與3種沉香的重心坐標(biāo)進(jìn)行比較，距離相近的即為該未知樣品的類(lèi)別。

3　結(jié)論

3種沉香樣本在160 ℃加熱1 h后，均釋放出VOCs，其主要成分為倍半萜和其他芳香族化合物。其中相對(duì)分子質(zhì)量為204.188(C15H24)、220.183(C15H24O)和222.198(C15H26O)的倍半萜在沉香樣本中以同分異構(gòu)體形式大量存在。

在本研究方法及條件下，倍半萜成分檢出率約為61.2%～88.3%，建議若要提高倍半萜檢出率，可以在本研究方法基礎(chǔ)上適當(dāng)提高試驗(yàn)溫度。

對(duì)160 ℃熱處理沉香釋放出的VOCs用TD-GCMS結(jié)合SR進(jìn)行分析，可以得到34種特征化合物，這些特征化合物可以用于對(duì)奇楠、惠安系沉香和星洲系沉香的鑒別。

用FDA法，可以對(duì)奇楠、惠安系沉香和星洲系沉香進(jìn)行鑒別。研究結(jié)果證明FDA對(duì)樣品中沉香類(lèi)別的鑒別切實(shí)有效。FDA得到判別方程和重心坐標(biāo)可以用對(duì)與未知沉香的鑒別。具體方法是將未知類(lèi)別的沉香樣品代入判別方程，其結(jié)果與3種沉香的重心坐標(biāo)進(jìn)行比較，距離相近的即為該未知樣品的類(lèi)別。

用TD-GCMS結(jié)合SR和FDA對(duì)沉香VOCs成分分析，進(jìn)而鑒別3種沉香的類(lèi)別是可行的。用該方法可以代替人工分類(lèi)，可以避免人工測(cè)試引入的誤差。