轉(zhuǎn)BpCHS基因過量表達白樺葉片和韌皮部色素含量及植株表型分析1)

范志勇

(黑龍江省大慶市第四中學(xué)，大慶，163711)

姜晶　王芳　呂東林　顧宸瑞　　 李騰　　　　　　　　姜靜

(林木遺傳育種國家重點實驗室(東北林業(yè)大學(xué)))　　(遼寧林業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院)　　(林木遺傳育種國家重點實驗室(東北林業(yè)大學(xué)))

類黃酮化合物(flavonoids)普遍存在于高等植物的葉、莖、花、果實等各種器官組織中，是果實和花的主要色素。查耳酮合酶(chalcone synthase,CHS)是黃酮類物質(zhì)合成的第一個限速酶，該酶催化丙二酰CoA與對羥基苯丙烯酰CoA縮合生成四羥基查耳酮，查爾酮在查爾酮異構(gòu)酶的作用下生成許多黃烷酮類物質(zhì)，再由黃烷酮衍生出各種黃酮類、醇類、花色素苷類等次級代謝產(chǎn)物[1]。由此可知，CHS的作用非常重要，CHS基因的沉默、超表達或突變都將直接或間接影響花色素苷等黃酮類化合物的合成，進而導(dǎo)致植物花色或果實顏色變異[2-6]。迄今為止，已從桂花(Osmanthusfragrans)、葡萄(Vitisvinifera)、向日葵(HelianthusannuusL.)、越橘(Vacciniumspp．)等700多種植物中克隆獲得CHS基因[7-11]并在煙草(Nicotianabenthamiana)[9,12]、甘藍型油菜(BrassicanapusL.)[11]、洋桔梗(Eustomagrandiflorum)[13]、獼猴桃(Actinidiasinensis)[14]等植物中采用轉(zhuǎn)基因技術(shù)已獲得花色、果色變異的轉(zhuǎn)基因品種。

白樺(BetulaplatyphyllaSuk.)是我國東北及內(nèi)蒙古四省區(qū)主要分布的樹種之一,其姿態(tài)優(yōu)美、樹皮潔白，具有獨特的觀賞價值,被廣泛應(yīng)用于庭院觀賞和園林綠化[15]，人們采用基因工程育種的方法相繼對白樺進行了遺傳改良，分別獲得了同期縮短、木質(zhì)素含量降低、抗蟲及耐鹽性提高的轉(zhuǎn)基因白樺[16-19]。然而，有關(guān)BpCHS基因研究卻鮮見報道，本實驗以白樺合子胚為受體采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將BpCHS3導(dǎo)入白樺基因組中，通過對轉(zhuǎn)基因株系的生長表型觀察以及色素含量測定，探討白樺CHS3基因的功能。

1　材料與方法

轉(zhuǎn)基因受體為白樺(Betulaplatyphylla×B.pendula)種子，種子采自東北林業(yè)大學(xué)白樺強化種子園內(nèi)自由授粉的優(yōu)樹，將采摘的種子晾干，去除苞片及果梗等雜質(zhì)，分成若干小份，塑料袋塑封后置于冰箱-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

EHA105(pBpCH3)菌株為本實驗室保存。TaqDNA polymerase購自Fermentas公司；潮霉素(Hygromycin B)購自amresco公司；利福平(rifampicin，Rif)購自Sigma公司；頭孢霉素(Cefotaxime)購自Phyto Technology Laboratories公司。

白樺的遺傳轉(zhuǎn)化：采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的合子胚法進行遺傳轉(zhuǎn)化[17]。即將縱切后并經(jīng)過工程菌液侵染的白樺合子胚置于共培養(yǎng)基上(WPM+2.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA)暗培養(yǎng)48 h,隨后轉(zhuǎn)接至含選擇劑和抑菌劑的固體平板培養(yǎng)基上(WPM+2.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+200 mg/L Cef+50 mg/L Hyg)，(25±2)℃光照條件下進行選擇培養(yǎng)，20 d后在合子胚切口處可見陸續(xù)產(chǎn)生Hyg抗性愈傷組織，待抗性愈傷組織直徑為0.2 mm左右時將其切下，置于分化培養(yǎng)基上(WPM+0.8 mg/L 6-BA+0.02 mg/L NAA+0.5 mg/L GA3+200 mg/L Cef+50 mg/L Hyg)誘導(dǎo)分化不定芽，待不定芽長成叢生苗后選取生長健壯的無根苗接種于生根培養(yǎng)基(WPM+0.4 mg/L IBA+200 mg/Lcef)中進行生根培養(yǎng)。

PCR檢測：采用植物DNA提取試劑盒(天根生化科技(北京)有限公司)提取參試株系總DNA，根據(jù)BpCHS3 ORF兩端序列設(shè)計引物：

上游引物為：5′-CACCATGGTGTCCCCTGGAAACGCG-3′；下游引物為：5′-CGCAACTGGTGGGTGGAGCAC-3′，PCR反應(yīng)體系參考文獻[20]，PCR產(chǎn)物用1.0%的瓊脂糖凝膠檢測。

qRT-PCR檢測：采用植物總RNA提取試劑盒(北京百泰克生物技術(shù)有限公司)分別提取參試株系總RNA，RNA經(jīng)DNaseI(RNase free)消化后用Rever Tre Ace?qPCR RT Kit(東洋紡(上海)生物科技有限公司)進行逆轉(zhuǎn)錄。逆轉(zhuǎn)錄體系為RNA 1 μg、5×RT Buffer 2 μL、Primer Mix 0.5 μL、Enzyme Mix 0.5 μL，去離子水補足體積至10 μL。反應(yīng)程序為37 ℃ 15 min；98 ℃ 5 min。將反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物稀釋10倍，用作定量PCR的模板，同時以18S rRNA和tublin為內(nèi)參基因，對參試基因進行qRT-PCR分析。PCR反應(yīng)體系為2×SYBR Green Realtime PCR Master mix 10 μL(東洋紡(上海)生物科技有限公司)、模板2.5 μL、上游引物和下游引物(10 μmol·L-1)各0.5 μL、用去離子水補足體積20 μL。反應(yīng)程序為94 ℃ 30 s，94 ℃ 12 s、54 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，循環(huán)45次，80.0 ℃讀板1 s，收集熒光，繪制熔解曲線，溫度由55 ℃開始至99 ℃終止。在DNA Engine OpticonTM 2型實時定量PCR儀(Bio-Rad，USA)上完成qRT-PCR，各反應(yīng)均設(shè)3次重復(fù)，用2-ΔΔCt方法對試驗結(jié)果進行分析(表1)。

表1　qRT-PCR引物序列

轉(zhuǎn)基因植株生長性狀調(diào)查：將獲得的轉(zhuǎn)基因白樺繼代苗及WT苗接種于生根培養(yǎng)基中進行生根培養(yǎng)，待生根苗高在2～3 cm左右時開蓋煉苗，按文獻[20]進行煉苗及移栽，每個株系擴繁50株左右，待苗木1年生時，參試株系均選取高度一致的苗木30株，移至直徑25 cm、高度30 cm的營養(yǎng)缽中，2年生時進行苗高、地徑及側(cè)枝數(shù)等性狀的調(diào)查。

轉(zhuǎn)基因白樺樹皮顏色的調(diào)查：利用英國皇家園藝學(xué)會第6版比色卡(RHS2015)鑒定參試株系的莖桿顏色。

葉綠素與類胡蘿卜素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定：于7月中旬分別摘取參試株系的第4～5葉片，每個株系取3株樹的葉片，混樣后備用；同時截取第4葉開始至下方10 cm處的莖桿，每個株系也是截取3株樹的莖桿，用刀片輕輕刮取韌皮組織，混樣后備用。

將上述試材分別放于研缽中液氮研磨后，取0.1 g放于含有10 mLV(丙酮)∶V(乙醇)=2∶1混和液的三角瓶中浸提，三角瓶置于避光處室溫浸泡至無色，過濾后獲得提取液(各樣品重復(fù)3次)。

將上述提取液用V(丙酮)∶V(乙醇)=2∶1混合液稀釋5倍，置于比色皿中，采用722S可見分光光度計測定其在663、645、470 nm波長處的吸光值，根據(jù)公式求算色素質(zhì)量濃度：

葉綠素a=12.7DO663-2.69DO645；

葉綠素b=22.9DO645-4.68DO663；

總?cè)~綠素(a+b)=20.2DO645+8.02DO663；

類胡蘿卜素=8.73DO470+2.11DO663-9.06DO645。

根據(jù)公式求算色素質(zhì)量分?jǐn)?shù)=[色素質(zhì)量濃度×提取液體積×稀釋倍數(shù)]/樣品鮮質(zhì)量。公式中DO663、DO645和DO470分別為葉綠素提取液在663、645和470 nm下的吸光值。提取方法參照文獻[21]和[22]。

花青素質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定：根據(jù)文獻[23]方法稱取1 g待測試材，剪碎后置于燒杯中，加入10 mL的0.1 mol/L HCL，將燒杯口封好后置于溫箱32 ℃浸提4 h后過濾，即為待測溶液。用1 mL比色皿，在721分光光度計上于530 nm處讀取吸光度(A)，以0.1 mol/L HCL溶液為空白對照。

取純度95%的花青素樣品20 mg及0.1 mol/L HCl溶液20 mL配制0.95 g/L的0.1 mol/L HCL標(biāo)準(zhǔn)溶液。在721分光光度計上于530 nm處讀取標(biāo)準(zhǔn)溶液吸光度，以吸光度(A)=0.1時的花青素為1個單位進行單位換算，標(biāo)準(zhǔn)溶液花青素質(zhì)量分?jǐn)?shù)為平均20個單位，則每單位對應(yīng)花青素0.475 mg，將上述測定的花青素單位乘以0.475，即為測定的花青素質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

2　結(jié)果與分析

2.1　過表達BpCHS3白樺的獲得與分子檢測

采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)目的基因載體轉(zhuǎn)化白樺成熟合子胚，經(jīng)50 mg/L Hyg篩選獲得抗性繼代苗，將繼代苗分別接種于生根培養(yǎng)基中，待長出3～4片葉時，切取葉片繼續(xù)在50 mg/L Hyg培養(yǎng)基中進行二次篩選，試驗共計獲得15個轉(zhuǎn)化子，分別命名為OE1、OE2、…、OE15(圖1)。

分別對獲得的抗性株系進行PCR檢測，即以轉(zhuǎn)基因白樺總DNA為模板,以pBpCHS3質(zhì)粒載體為陽性對照，野生型白樺(WT)為陰性對照，采用BpCHS3基因ORF兩端序列為引物進行PCR擴增(圖2)，結(jié)果顯示：陽性pBpCHS3質(zhì)粒及4個轉(zhuǎn)基因株系在1 100 bp左右處有擴增譜帶，該條帶為白樺基因組整合的1 170 bp的BpCHS3cDNA,而WT及4個轉(zhuǎn)基因株系在2 000 bp左右處也出現(xiàn)一條擴增譜帶，該譜帶是白樺基因組中具有535 bp內(nèi)含子的1 705 bpBpCHS3基因序列，檢測結(jié)果說明，35S啟動子驅(qū)動的BpCHS3 cDNA序列已整合到白樺基因中。

M.DL2000；泳道1為pBpCHS3質(zhì)粒；泳道2為水；泳道3為WT株系；泳道4～7為轉(zhuǎn)基因株系(OE1、OE2、OE4、OE6)。

分別選擇5個轉(zhuǎn)基因株系進行qRT-PCR檢測，結(jié)果顯示：5個轉(zhuǎn)基因株系的BpCHS3基因表達量相對WT株系均呈現(xiàn)上調(diào)表達，但BpCHS3上調(diào)幅度不盡相同(表2)，雖然OE10株系BpCHS3上調(diào)表達量最低，但BpCHS3的表達量也高于WT株系的15倍；試驗表明，轉(zhuǎn)基因株系中BpCHS3基因在mRNA水平能夠過量表達。

表2　轉(zhuǎn)基因株系BpCHS3基因qRT-PCR分析

注：表中數(shù)據(jù)為“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”。

2.2　過表達BpCHS3白樺表型觀察及生長特性

分別對1年生及2年生移栽的苗木觀察發(fā)現(xiàn)(圖3、圖4)：與野生型WT株系比較，轉(zhuǎn)基因白樺葉片綠色變淺，樹皮顏色也發(fā)生明顯變化，BpCHS3過表達株系的莖桿呈現(xiàn)淺黃綠(RHS2015 199B)，將樹皮剝離后發(fā)現(xiàn)，樹皮為灰白色(RHS2015 156A)，且透光(圖4中D)，因此，莖桿的淺黃綠是韌皮組織透過灰白色樹皮而呈現(xiàn)的顏色(圖4中E)；WT株系樹皮為褐色(RHS2015 165A)，由于其不透光，故此，WT的莖桿也為褐色(圖4中B、C)。

A.生長發(fā)育中的白樺；B.停止生長的白樺；C.WT(左)及轉(zhuǎn)基因白樺莖桿(右)；D.WT莖的顏色為Moderate Brown(RHS2015 165A)；E.BpCHS3過表達株系莖桿的顏色為Light Olive Brown(RHS2015 199 B)。

苗高及地徑調(diào)查顯示，轉(zhuǎn)基因株系與WT的生長量差異不顯著，而在側(cè)枝生長方面表現(xiàn)不同，1年生的轉(zhuǎn)基因白樺各株系均有側(cè)枝生長，而WT株系未見側(cè)枝形成(圖3中B)，2年生時WT株系雖然出現(xiàn)側(cè)枝(表3)，但在側(cè)枝數(shù)量方面顯著少于轉(zhuǎn)基因株系(p<0.01)，調(diào)查的5個轉(zhuǎn)基因株系平均側(cè)枝數(shù)為22.87個，而WT僅為18.63個。

2.3　轉(zhuǎn)基因白樺光合色素及花青素質(zhì)量分?jǐn)?shù)的比較

為了探明BpCHS3過表達白樺組織細胞中花青素含量發(fā)生怎樣變化？明確轉(zhuǎn)基因白樺葉片綠色變淺，樹皮莖桿呈現(xiàn)淺黃綠色與光合色素的關(guān)系。試驗選取OE1、OE2、OE4等3個轉(zhuǎn)基因株系及WT株系，分別測定葉片及韌皮組織的葉綠素、類胡蘿卜素和花青素質(zhì)量分?jǐn)?shù)，結(jié)果顯示：葉片組織中轉(zhuǎn)基因株系的光合色素及花青素質(zhì)量分?jǐn)?shù)均顯著低于WT株系(P<0.01)，轉(zhuǎn)基因株系總?cè)~綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)均值低于WT的13.68%(表4)，花青素相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)均值低于WT的45.99%；韌皮組織中轉(zhuǎn)基因株系的光合色素質(zhì)量分?jǐn)?shù)均高于WT，但只有OE1和OE2株系達到顯著水平(P<0.01)，3個轉(zhuǎn)基因株系總?cè)~綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)均值高于WT株系的88.16%(表5)，而轉(zhuǎn)基因株系韌皮組織中的花青素相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)與WT株系差異不顯著(表6)。

表3　2年生轉(zhuǎn)基因白樺苗高、地徑及側(cè)枝數(shù)比較

注：表中數(shù)據(jù)為“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”；WT為對照株系，OE為BpCHS3過表達株系；同列不同字母表示差異極顯著(P<0.01)。

A.WT及轉(zhuǎn)基因白樺莖桿；B.剝離的樹皮(實體顯微鏡拍照，×0.8)(greyed-white group)(RHS2015 156A)；C.箭頭標(biāo)記的上方為剝離樹皮后露出的韌皮部、下方為沒有剝離樹皮莖桿；D.剝離的樹皮(實體顯微鏡拍照，×0.8)(greyed-white group)(RHS2015 156A)；E.箭頭標(biāo)記的上方為剝離樹皮后露出的韌皮部、下方為沒有剝離樹皮莖桿。

2.4　轉(zhuǎn)基因株系的BpCHS基因的表達特性

為了明確轉(zhuǎn)白樺CHS3過量表達株系中BpCHS家族成員的表達特性，試驗根據(jù)前期紫雨樺轉(zhuǎn)錄組分析，以擬南芥查耳酮合酶(CHS，AT5G13930.1)作為輸入序列，與白樺基因組進行BLASTP比對，在白樺基因組中找到BpCHS1、BpCHS2、BpCHS3等3條CHS基因全長序列[24-25]，轉(zhuǎn)基因白樺的qRT-PCR分析發(fā)現(xiàn)，相對WT株系3個轉(zhuǎn)基因株系中的BpCHS1基因均呈下調(diào)表達，3個轉(zhuǎn)基因株系的表達量均值僅為WT的64.59%，而BpCHS2基因除OE1株系外，其他2個轉(zhuǎn)基因株系也呈現(xiàn)下調(diào)表達(表7)。

表4　轉(zhuǎn)基因株系韌葉片組織中葉綠素及類胡蘿卜素質(zhì)量分?jǐn)?shù)比較mg·g-1

注：表中數(shù)據(jù)為“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”；同列不同字母表示差異極顯著(P<0.01)。

表5　轉(zhuǎn)基因株系韌皮部葉綠素及類胡蘿卜素質(zhì)量分?jǐn)?shù)比較　mg·g-1

注：表中數(shù)據(jù)為“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”；同列不同字母表示差異極顯著(P<0.01)。

表6　轉(zhuǎn)基因株系葉片與韌皮部中花青素質(zhì)量分?jǐn)?shù)比較　mg·g-1

注：表中數(shù)據(jù)為“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”；同列不同字母表示差異極顯著(P<0.01)。

表7　BpCHS3過表達白樺葉片中CHS1及CHS2的相對表達量

注：表中數(shù)據(jù)為“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”。

3　結(jié)論與討論

利用花色素代謝的結(jié)構(gòu)基因和調(diào)節(jié)基因,對觀賞植物的色彩進行改良具有十分廣泛的前景，其中查耳酮合酶基因(CHS)在植物花色分子設(shè)計育種方面報道較多，例如運用RNAi技術(shù)抑制煙草、紫色矮牽牛等植物的CHS基因的表達，可導(dǎo)致花青素含量不同程度的降低，花色產(chǎn)生變異，甚至產(chǎn)生白色花朵[26]。白樺為高大喬木，童期較長，野外條件下17～20 a才能開花結(jié)實[27]，白樺CHS3過表達能否影響花色需要后續(xù)觀察。因此，試驗僅對轉(zhuǎn)基因白樺表型、花青素及光合色素質(zhì)量分?jǐn)?shù)進行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因白樺樹皮為無色(圖4中D)，側(cè)枝增多，轉(zhuǎn)基因白樺葉片總?cè)~綠素及類胡蘿卜素質(zhì)量分?jǐn)?shù)均值分別低于WT株系的13.68%、36.15%(表4)。有研究表明，CHS基因的過量表達或抑制表達轉(zhuǎn)基因植物的種皮及莖桿顏色變淺，葉片組織葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)降低，轉(zhuǎn)CHS煙草及甘藍型黑籽油菜的的側(cè)枝數(shù)量也發(fā)生改變[11，28-29]。白樺CHS3過表達株系生長表現(xiàn)與前人的研究結(jié)果非常相似。

對轉(zhuǎn)基因白樺的花青素質(zhì)量分?jǐn)?shù)分析發(fā)現(xiàn)，其含量不但沒有提高，反而顯著降低，質(zhì)量分?jǐn)?shù)最低的OE2株系僅為WT株系的57.27%(表6)，認為在轉(zhuǎn)基因白樺中發(fā)生了CHS的共抑制現(xiàn)象，即引入的CHS基因能夠阻斷花色苷的合成。共抑制現(xiàn)象是20世紀(jì)90年代初Nappli et al在進行矮牽牛(Petuniahybrida)過量表達CHS基因時，首次提出了CHS基因間存在共抑制現(xiàn)象，隨后人們相繼發(fā)現(xiàn)了矮牽牛中與色素合成有關(guān)的一些基因轉(zhuǎn)基因后會發(fā)生共抑制現(xiàn)象，其中CHS基因的研究較多[11，28-29]。然而讓我們困惑不解的是qRT-PCR結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)基因株系BpCHS3表達量卻顯著上調(diào)，均值高于WT株系59.76倍(表2)，試驗又對白樺中僅有的另外2條BpCHS表達量進行分析，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因株系中的BpCHS1和BpCHS2均呈下調(diào)表達(OE1株系除外)，故此，推測BpCHS3的過量表達，未對BpCHS3產(chǎn)生共抑制，但可能對另外2個CHS家族成員(2個家族成員與CHS3具有70%左右的同源性)產(chǎn)生了共抑制現(xiàn)象，這種推測還需后續(xù)實驗進一步的驗證。

白樺CHS3的過量表達為何導(dǎo)致葉片光合色素合成量的減少，葉綠素、類胡蘿卜素及花青素之間是通過怎樣的代謝途徑相互影響，CHS通過共抑制如何影響側(cè)枝數(shù)量及樹皮著色等問題還有待進一步揭示。