山西管涔山傳統(tǒng)食用菌白水皮蘑菇的DNA分子鑒定

劉 虹 ，李素玲 ，董淑英 ，楊 杰 ，許 晶 ，郭福貴

（1.山西省農業(yè)科學院食用菌研究所，山西太原 030031；2.忻州市科技局，山西忻州 034000；3.寧武縣農業(yè)委員會，山西寧武 036700）

白水皮是山西管涔山地區(qū)出產的一種白色、個體較小的特產蘑菇，每年夏、秋2季在華北云杉（Picea wilsonii Mast）和華北落葉松（紅杄）（Larix principis-rupprechtii Mayr）林內草地上生長，散生或群生，有時形成蘑菇圈，當?shù)匕傩詹墒巢⒆鳛橥撂禺a品出售已有數(shù)百年的歷史。當?shù)匕傩胀ǔ０压襟w肥大、香味濃郁的野蘑菇叫銀盤，而將菌肉較薄、香味較淡的種類叫水皮，白水皮即是當?shù)囟喾N水皮蘑菇之一。2017年秋季，當?shù)匕傩盏仡^出售鮮品價格約每千克20元人民幣左右，是價格較低的當?shù)匾吧秤镁弧?/p>

由于白水皮在當?shù)胤植己軓V，出產周期長（從夏季入伏到秋季均產），而且產量較大，因而被廣泛采收，是當?shù)匾吧秤镁畛Ｒ姷钠贩N之一。在此之前的相關文獻中[1-10]，沒有發(fā)現(xiàn)確切的山西管涔山白水皮蘑菇對應的學術名稱。

本研究首次采用ITS-DNA分子方法，對2017年采自山西管涔山林區(qū)的白水皮蘑菇進行了鑒定分析，結合子實體形態(tài)特征分析，確認其科學名稱為落葉杯傘（Clitocybe phyllophila（Pers.）Kumm.），該研究結果將為山西省野生食用菌資源的研究和開發(fā)提供科學依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

本研究依據(jù)的擔子果樣本于2017年7—8月采自山西省中北部管涔山一帶的華北落葉松（Larix principis-rupprechtii Mayr） 和 華 北 云 杉（Picea wilsonii Mast）林中草地上，其具體樣本信息列于表1。新鮮的擔子果標本經45℃烘干后保存于山西農業(yè)科學院食用菌研究所和首都師范大學標本館（BJTC）。

表1 研究用白水皮蘑菇樣本信息

1.2 試驗方法

1.2.1 形態(tài)學方法 對擔子果的宏觀特征在手持放大鏡和體視顯微鏡下進行觀察和描述，主要包括擔子果的形狀、大小、顏色、菌褶及菌柄特征等。

擔子果顯微結構特征觀察在山西省農科院食用菌研究所微生物實驗室光學顯微鏡下進行。首先采用手術刀進行徒手切片，以蒸餾水、3%KOH作為浮載劑制作水封片。用棉蘭（cotton blue）和梅氏試劑（Melzer）檢驗擔孢子壁有無喜蘭和淀粉質反應。

1.2.2 分子方法 DNA分子研究在北京首都師范大學生命科學學院微生物實驗室進行。用于本研究的樣本DNA提取、PCR以及測序方法等完全采用FAN等[11-12]研究塊菌屬物種所使用的方法。其他用于本研究比對的DNA序列下載自NCBI數(shù)據(jù)庫，本研究成功提取和測序的nrDNA-ITS序列采用BLAST軟件在NCBI上進行比對，比對結果中相似性高于97%的序列用于本研究分析。

2 結果與分析

2.1 DNA-ITS比對結果

表2 白水皮蘑菇樣本間ITS比對結果（BLAST） %

表3 白水皮蘑菇樣本（LH0702）ITS在NCBI上BLAST結果

本研究選用2017年7—8月間由作者及團隊成員采自管涔山的樣本4份用于提取和測序ITS-DNA片段。將上述結果在NCBI上用BLAST工具比對，結果列于表2，3。

從表2可以看出，本研究4份樣本之間ITS相似性均高于99%，可以確認這4份樣本屬于同一分類學物種。

2.2 分類學結果

依據(jù)采自管涔山地區(qū)4份樣本的形態(tài)學特征觀察，結合上述ITS分子比對結果，將這些樣本定名為落葉杯傘。以下描述依據(jù)本次自行采集的、產于山西省呂梁山脈北部管涔山段的樣本。

落葉杯傘為 Clitocybe phyllophila（Pers.）P.Kumm.，F(xiàn)ühr.Pilzk.（Zerbst）：122（1871）；其同物異名 有 ：Agaricus phyllophilus Pers.，Syn.meth.fung.（G?ttingen）2：457（1801）；Agaricus phyllophilus var.fuliginatus Pers.，Mycol.eur. （Erlanga）3：72（1828）；Clitocybe phyllophila f. difformis（Schumach.）Raithelh.，Metrodiana 1（1）：13（1970）；Omphalia phyllophila（Pers.）Quél.，Enchir.fung.（Paris）：22（1886）var.phyllophila；Omphalia phyllophila var.pithyophila（Secr.ex Fr.）Quél.，Enchir.fung.（Paris）：22（1886）；Omphalia phyllophila （Pers.） Quél.，Enchir.fung.（Paris）：22（1886）；Lepista phyllophila（Pers.） Harmaja，Karstenia 15：15 （1976）；Clitocybe phyllophila var.pseudonebularis （Raithelh.）Raithelh.，Metrodiana 1 （1）：12 （1970）；Clitocybe phyllophila var.tenuis Harmaja，Karstenia 10：88 （1969）；Clitocybe phyllophila var.fusispora Raithelh.，Metrodiana 1（1）：11（1970）；Clitocybe phyllophila f.sericea Raithelh.，Metrodiana 1（1）：13（1970）；Agaricus cerussatus Fr.，Syst.mycol.（Lundae）1：92（1821）；Agaricus cerussatus var.difformis（Schumach.）Fr.，Syst.mycol.（Lundae）1：93 （1821）；Clitocybe cerussata （Fr.） P.Kumm.，F(xiàn)ühr.Pilzk. （Zerbst）：122（1871）；Clitocybe cerussata var.difformis （Schumach.）P.Karst.，Bidr.K?nn.Finl.Nat.Folk 32：64（1879）；Clitocybe cerussata var.pithyophila（Fr.）J.E.Lange,Fl.Agaric.Danic.1：79 （1935）；Omphalia cerussata （Fr.） Quél.，Enchir.fung.（Paris）：22（1886）；Agaricus cerussatus var.obtextus（Lasch）Fr.，Epicr.syst.mycol.（Upsaliae）：62 （1838）；Omphalia cerussatavar.obtexta（Lasch）Quél.，Enchir.fung. （Paris）：22（1886）；A－garicus difformis Schumach.,Enum.pl.（Kjbenhavn）2：335 （1803）；Clitocybe difformis （Schumach.）Sacc.，Syll.fung.（Abellini） 5：154（1887）；Agaricus dilatatus Pers.，Mycol.eur. （Erlanga）3：115（1828）；Clitocybe dilatata P.Karst.，Hedwigia 28：363（1889）；Agaricus monstrosus Sowerby，Col.fig.Engl.Fung.Mushr.（London）3：tab.283（1800）；Clitocybe monstrosa Cooke，F(xiàn)orsch.PflKr.，Tokyo：53（1883）；Agaricus obtextus Lasch，Linnaea 3：378（1828）；Clitocybe obtexta （Lasch）Sacc.，Syll.fung. （Abellini）5：154（1887）；Agaricus pithyophilus Fr.，Epicr.syst.mycol.（Upsaliae）：62 （1838）；Clitocybe pithyophila（Fr.）Gillet，Hyménomycètes（Alen?on）：152（1874）

2.3 形態(tài)學結果

擔子果為小到中型（圖1），菌蓋初期扁半球形，光滑，無毛，邊緣稍內卷，后漸平展，中部平或稍下凹，邊緣整齊，老熟后或稍波浪狀，無條紋，干燥，純白色，中央部位顏色有時有點非常淡的淺黃褐色，直徑2～6 cm；菌肉白色，較?。痪薨咨?，干后肉褐色或米褐色，不等長，較密，直生或近延生；菌柄較細，圓柱狀或向下漸漸變細，2～8 cm長，0.3～0.8 cm粗，白色，常常水漬狀，表面近平滑，常見白底色和水漬色相間形成的縱向條紋，初期中實，后中空；擔孢子橢圓形，5～7 μm×3～4.5 μm，無色，表面光滑，非淀粉質。

3 討論

從本次采集的產于山西管涔山的白水皮蘑菇提取的ITS-DNA片段在NCBI上用BLAST比對結果顯示，與本研究樣本相似度高于97%（同時滿足查詢覆蓋值大于90%），并且有具體物種名稱的序列有15條，涉及杯傘屬Clitocybe和香蘑屬Lepista共8個物種名稱。從現(xiàn)代DNA分子系統(tǒng)學角度分析，這15條序列應該是同一分類學物種。這8個物種名稱中，香蘑屬Lepista名下有Lepista sordida，Lepista irinoides和Lepista irina var.motana等3個名稱。將這3個名稱基于的幾條序列與有關專業(yè)論述中所引證的上述物種（或其近緣物種）序列用BLAST比對，結果顯示，ITS相似度均低于94%，明顯不是同種或近緣物種；從形態(tài)上看，盡管或多或少有點相似，管涔山的白水皮蘑菇與這3個物種的形態(tài)學特征明顯不同[2，10，13]，由此可以推斷，這 3 個名稱在這里的出現(xiàn)可能源于所依據(jù)樣本的錯誤鑒定。其他5個物種名稱均為杯傘屬Clitocybe，包括Clitocybe cerussata，Clitocybe phyllophila，Clitocybe odora，Clitocybe subditopoda 和 Clitocybe fragrans，其中，Clitocybe cerussata是 Clitocybe phyllophila的異名[13]。在這些序列中，4條Clitocybe cerussata和Clitocybe phyllophila名下的序列源自最近的專業(yè)研究分析Clitocybe，Lepista以及相關類群系統(tǒng)分類的論文[13-14]。因此，有理由相信，這4條歐洲序列來自真正的Clitocybe phyllophila。在此基礎上，可以反推 Clitocybe odora，Clitocybe subditopoda 和 Clitocybe fragrans或源于錯誤的樣本鑒定，或可能與Clitocybe phyllophila為同一物種。從形態(tài)學特征來分析，管涔山白水皮最為接近的種類就是Clitocybe phyllophila。

綜上所述，結合形態(tài)學特征和DNA分子分析，認定產于山西省管涔山的白水皮蘑菇學名為最早報道于歐洲的落葉杯傘[10]，以前也叫白杯傘[2]，其拉丁學名為 Clitocybe phyllophila（Pers.）P.Kumm.。本研究結果是山西省第1次記錄該物種。我國已有記載的分布區(qū)有吉林、內蒙古、青海、四川、云南，但是NCBI中沒有該種名下中國序列，然而，3條在Lepista sordida名下來自中國但沒有表明具體產地的序列（JQ293095，JQ293096，LT716070）應該源于本種。

然而，盡管DNA分子和形態(tài)學分析支持山西管涔山白水皮蘑菇與歐洲落葉杯傘為同一分類學物種，但是存在于山西北部管涔山地區(qū)的白水皮蘑菇與文獻中該物種記載的最大不同是：白水皮蘑菇是管涔山一帶百姓采集食用了至少上百年的傳統(tǒng)野生食用菌，從未有過食用后中毒報告，而落葉杯傘在作者查閱的歐美和我國文獻中均記載為毒菌[2，10，15-18]。已有報道顯示，從落葉杯傘子實體中提取到了毒蠅堿（muscarin）[16-17]，國外也有中毒案例的報道，主要表現(xiàn)為毒蠅堿綜合癥[16]。而我國有關文獻中雖然將其列為毒菌，但沒有看到中毒報告或案例[18]。

管涔山當?shù)匕傩帐秤蒙缴系乃蟹N類的野蘑菇之前，都要用開水煮沸幾分鐘，這也許是去除某些蘑菇毒性的有效方法之一。但是據(jù)有關報道，加熱煮食不會影響毒蠅堿的活性[18]，因此，目前尚無法解釋這個在世界其他地區(qū)公認為有毒的蘑菇在管涔山地區(qū)為什么沒有毒性反應，或者這種蘑菇在管涔山地區(qū)已經演化成落葉杯傘Clitocybe phyllophila的一個無毒的區(qū)域種群（local population），很顯然，關于這個神秘的蘑菇還有很多謎團有待解開。

志謝：曹晉忠博士對本文提供有價值的意見，首都師范大學研究生閆向遠、黃凱兵、陳萌、李婷、徐語言參加標本采集及部分實驗工作，在此一并感謝。