廣西巴馬小型豬SP1基因克隆測序及其真核表達載體的構(gòu)建

張廣杰 崔悅悅 邱慶慶 夏琴 李龍 司景磊 夏攀杰 鄒輝 蘭干球

摘要：【目的】克隆廣西巴馬小型豬特異性蛋白1（SP1）基因，并構(gòu)建其真核表達載體，為揭示其對豬生長發(fā)育的調(diào)控機理打下基礎(chǔ)?！痉椒ā坷肦T-PCR從廣西巴馬小型豬背最長肌組織中擴增SP1基因，采用DNASTAR、TMHMM等分別進行基因生物信息學分析；以pEGFP-N1質(zhì)粒構(gòu)建真核表達載體pEGFP-N1-SP1并轉(zhuǎn)染293T細胞，于轉(zhuǎn)染48 h后在倒置熒光顯微鏡下觀察并拍照。【結(jié)果】克隆獲得的廣西巴馬小型豬SP1基因與GenBank中野豬（Sus scrofa）的參考序列（XM_005652569.3）一致，未發(fā)現(xiàn)堿基突變位點；其編碼序列（CDS）全長2340 bp，編碼779個氨基酸。廣西巴馬小型豬SP1蛋白不存在跨膜結(jié)構(gòu)，也不存在信號肽，不屬于分泌型蛋白；其二級結(jié)構(gòu)中α-螺旋占17.84%，延伸鏈占21.31%，β-轉(zhuǎn)角占9.76%，無規(guī)則卷曲占51.09%。構(gòu)建的真核表達載體pEGFP-N1-SP1能成功轉(zhuǎn)染至293T細胞中并表達出綠色熒光蛋白?！窘Y(jié)論】廣西巴馬小型豬SP1基因CDS序列編碼蛋白主要參與細胞內(nèi)活動，而非外分泌型蛋白，以SP1基因構(gòu)建的真核表達載體pEGFP-N1-SP1能轉(zhuǎn)染293T細胞并成功表達，可直接用于后期SP1基因功能探索及干擾表達等研究。

關(guān)鍵詞： 廣西巴馬小型豬；SP1基因；克?。徽婧吮磉_載體；生物學信息分析

中圖分類號： S828.89 文獻標志碼：A 文章編號：2095-1191（2018）02-0360-07

0 引言

【研究意義】特異性蛋白1（Specificity protein 1，SP1）于1983年首次被發(fā)現(xiàn)，與之后相繼發(fā)現(xiàn)的8種同類蛋白共同組成SP樣轉(zhuǎn)錄因子家族（SP1～SP9）。SP家族蛋白參與細胞增殖分化、細胞凋亡、胚胎發(fā)育、腫瘤形成等多種生命過程，是一類功能非常廣泛的轉(zhuǎn)錄因子（潘奇等，2007；王麗杰等，2008；熊琪等，2012；苗露，2014）。SP1是眾多基因的基本轉(zhuǎn)錄因子，參與多種基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，近年來有關(guān)SP1促進動物生產(chǎn)方面的研究越來越受到重視，因此，克隆SP1基因并進行生物信息學分析，對揭示SP1轉(zhuǎn)錄因子對動物基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機理具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】目前，有關(guān)SP1轉(zhuǎn)錄因子的研究主要集中在腫瘤、癌癥等方面。Jungert等（2007）在胰腺癌細胞遷移試驗中發(fā)現(xiàn)，SP1是TGF-β調(diào)控上皮細胞向間質(zhì)細胞轉(zhuǎn)換的關(guān)鍵影響因子，其功能主要通過波形蛋白的轉(zhuǎn)錄誘導來介導。Grande等（2012）通過胚胎癌細胞對順鉑試驗，發(fā)現(xiàn)SP1轉(zhuǎn)錄因子控制凋亡蛋白NOXA的表達。Luster等（2015）研究證實，破壞SP1位點可降低成纖維生長因子（FGF-4）基因在胚胎癌細胞中的表達量。林冬靜和何倩麗（2016）研究表明，SP1主要通過TGF-β、ERK、PI3K/Akt和Wnt/β-catenin等信號通路發(fā)揮作用，促進腫瘤細胞生長。Chen等（2017）研究發(fā)現(xiàn)，敲除SP1能顯著減弱TGF-β誘導PC3和HepG2細胞中NKG2DL上調(diào)表達，即SP1在TGF-β誘導的NKG2DL上調(diào)表達過程中發(fā)揮重要作用。Deng等（2017）研究發(fā)現(xiàn)，通過上調(diào)SP1基因表達，能促進結(jié)腸、直腸癌細胞的遷移和侵襲。Ye等（2017）也研究發(fā)現(xiàn)，SP1參與胃癌細胞中SHIP2基因的表達，SHIP2蛋白在受體內(nèi)吞降解過程中發(fā)揮重要作用，即SP1是腫瘤形成過程中的一個重要蛋白，降低其轉(zhuǎn)錄活性有助于降低癌細胞SHIP2基因的表達量。有關(guān)SP1在動物生產(chǎn)方面的研究，熊琪等（2012）研究表明，SP1轉(zhuǎn)錄因子表達抑制致使成肌細胞中SKIP啟動子活性顯著下降，即SP1可能通過順式作用元件GC-Box對成肌細胞分化過程中SKIP基因的轉(zhuǎn)錄激活起正向調(diào)控作用；郝光（2014）研究表明，SP1 mRNA在草魚的腸和鰓中表達最高，出膜前的表達量明顯高于出膜后，并證實適量外源谷氨酰胺二肽對草魚腸道中的SP1 mRNA表達起促進作用；李朋輝（2014）研究發(fā)現(xiàn)，SP1是豬肝羧酸酯酶基因（PLE1）轉(zhuǎn)錄的強激活因子，其單獨作用可有效上調(diào)該基因啟動子的活性；李龍等（2017）研究證實，SP1對廣西巴馬小型豬肉質(zhì)性狀相關(guān)基因ANK1啟動子具有明顯的促進轉(zhuǎn)錄作用?！颈狙芯壳腥朦c】至今，有關(guān)SP1調(diào)控豬生長方面的研究甚少，在廣西巴馬小型豬方面的研究則鮮見報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】以廣西巴馬小型豬為研究對象，克隆SP1基因并構(gòu)建其真核表達載體，利用在線生物信息學分析軟件對SP1基因序列進行生物學信息分析，為揭示其對豬生長發(fā)育的調(diào)控機理打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

廣西巴馬小型豬肌肉組織（背最長肌）、轉(zhuǎn)染的293T細胞和pEGFP-N1質(zhì)粒由廣西大學動物科學技術(shù)學院動物遺傳育種實驗室保存提供。大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞購自北京全式金生物技術(shù)有限公司，RNAiso Plus及反轉(zhuǎn)錄試劑盒6210A、高保真PCR擴增試劑盒、pMD18-T載體、Xho I和Kpn I快切酶購自TaKaRa公司，瓊脂糖凝膠購自Biowest公司，質(zhì)粒小提制備試劑盒購自GENEray公司，SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒購自生工生物工程（上海）股份有限公司，T4連接酶購自Promega公司，去內(nèi)毒提質(zhì)粒試劑盒購自O(shè)MEGA公司，細胞培養(yǎng)基購自Gibco公司，胎牛血清和轉(zhuǎn)染試劑盒購自LIFE公司，胰蛋白酶購自Hyclone公司。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 引物設(shè)計 通過NCBI網(wǎng)站的GenBank獲得豬SP1基因mRNA（XM_005652569.3）編碼序列（CDS），利用Oligo 7.0設(shè)計兩對引物（表1）。其中，SP1-F/SP1-R引物對用于擴增SP1基因；SP1-F-Xho I/SP1-R-Kpn I引物對在SP1-F/SP1-R引物兩端加上相應(yīng)的酶切位點（下劃線部分），用于擴增含酶切位點的目的片段及雙酶切鑒定。所有引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1. 2. 2 總RNA提取及檢測 按照RNAiso Plus使用說明提取廣西巴馬小型豬背最長肌組織總RNA，并利用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測提取效果。

1. 2. 3 RT-PCR擴增 根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒6210A使用說明反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，然后進行PCR擴增，其反應(yīng)體系20.00 μL：Taq Mix 10.00 μL、SP1-F/SP1-R各1.00 μL、cDNA 2.00 μL、ddH2O 6.00 μL。擴增程序：95 ℃預變性3 min；95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 150 s，進行35個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，按照SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒使用說明回收PCR產(chǎn)物。

1. 2. 4 挑取單克隆菌落 將獲得的PCR產(chǎn)物與pMD18-T載體進行連接過夜，然后轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞，涂布于含氨芐霉素（AMP+）的LA培養(yǎng)基上，37 ℃倒置培養(yǎng)12 h后挑取陽性單一菌落，經(jīng)含氨芐霉素的LA培養(yǎng)基擴大培養(yǎng)4 h，挑選陽性菌落送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1. 2. 5 生物信息學分析 測序結(jié)果使用DNASTAR進行比對分析，利用MegAlign構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹，通過ProtScale和TMHMM對SP1氨基酸序列的親/疏水性及跨膜結(jié)構(gòu)進行預測分析，并以SOPMA對SP1蛋白的二級結(jié)構(gòu)進行預測分析。

1. 2. 6 增加酶切位點及構(gòu)建真核表達載體 對測序結(jié)果正確的菌液進行質(zhì)粒提取，將提取的陽性質(zhì)粒再次進行PCR擴增，擴增引物為SP1-F-Xho I/SP1-R-Kpn I。獲得的PCR產(chǎn)物與pMD18-T載體連接，挑取回收陽性重組質(zhì)粒pMD18-T-SP1-Xho I/Kpn I，然后將其與pEGFP-N1質(zhì)粒同時進行Ank I和Xho I雙酶切，雙酶切結(jié)束后用1.0%瓊脂糖凝膠進行電泳，分別切取回收目的條帶和斷裂的pEGFP-N1質(zhì)粒條帶進行回收。將兩段PCR回收產(chǎn)物進行T4連接，然后轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞，取轉(zhuǎn)化菌液200.0 μL均勻涂抹于含卡那霉素（KAN+）的LA培養(yǎng)基上，37 ℃倒置培養(yǎng)15 h，然后挑斑擴大培養(yǎng)4 h，挑取陽性菌落送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序。測序結(jié)果正確的陽性菌液按去內(nèi)毒提質(zhì)粒試劑盒使用說明進行陽性菌落擴大培養(yǎng)及去內(nèi)毒提質(zhì)粒操作，以獲得真核表達載體pEGFP-N1-SP1。

1. 2. 7 細胞轉(zhuǎn)染 采用293T細胞進行轉(zhuǎn)染，以10%胎牛血清+90% DMEM培養(yǎng)基在直徑60 mm的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，待細胞生長至占培養(yǎng)皿底面積70%～80%時將細胞轉(zhuǎn)移至6孔平板中繼續(xù)培養(yǎng)。待6孔平板中的細胞生長至占所在孔底面積50%時進行換液，當細胞生長至占所在孔底面積60%～70%時進行轉(zhuǎn)染。按照轉(zhuǎn)染試劑盒使用說明進行操作，即每孔細胞加入真核表達載體1.0 μg、OPTI-MEM? 500.00 μL、Plus Reagent 1.00 μL和LTX Reagent 2.00 μL。轉(zhuǎn)染48 h后進行觀察拍照。

2 結(jié)果與分析

2. 1 總RNA提取效果

以1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的提取效果，結(jié)果（圖1）觀察到3條完整的條帶（28S、18S和5S），說明總RNA提取效果良好。

2. 2 RT-PCR擴增結(jié)果

以廣西巴馬小型豬肌肉組織總RNA為模板進行RT-PCR擴增，1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果顯示，在2400 bp附近出現(xiàn)單一明亮的目的條帶（圖2），與預期結(jié)果相符。陽性克隆菌液送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序，結(jié)果表明，廣西巴馬小型豬SP1基因CDS序列與GenBank中已發(fā)表的對應(yīng)堿基序列一致，表明成功克隆獲得廣西巴馬小型豬SP1基因序列。

2. 3 廣西巴馬小型豬SP1基因序列對比分析結(jié)果

經(jīng)DNASTAR比對分析發(fā)現(xiàn)，廣西巴馬小型豬SP1基因與GenBank中野豬（Sus scrofa）的XM_005652569.3序列完全一致（圖3），未發(fā)現(xiàn)堿基突變位點，其CDS序列全長2340 bp，編碼779個氨基酸?；赟P1基因序列，利用MegAlign構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹，結(jié)果顯示，廣西巴馬小型豬與野豬的親緣關(guān)系最近，先聚為一個分支（圖4），再與人類（Homo sapiens）和犬（Canis lupus familiaris）聚為一支；而與牛（Bos taurus）、山羊（Capra hircus）、猴（Macaca mulatta）和鼠（Rattus noregicus）的親緣關(guān)系較遠。

2. 4 廣西巴馬小型豬SP1蛋白生物信息學分析結(jié)果

利用TMHMM（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/）對廣西巴馬小型豬SP1蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)進行預測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其不存在跨膜結(jié)構(gòu)（圖5）。利用SignalP 4.1 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）對SP1蛋白進行信號肽預測，結(jié)果（圖6）表明，廣西巴馬小型豬SP1蛋白不存在信號肽，不屬于分泌型蛋白。利用ProtScale（http：//web.expasy.org/protscale/）對SP1蛋白進行親/疏水性預測，結(jié)果（圖7）顯示，廣西巴馬小型豬SP1蛋白N端有12個疏水性氨基酸，其后多為親水性氨基酸；C端多為疏水性氨基酸，偶有親水性氨基酸。其最大疏水值為1.978，位于第58位氨基酸處，最小疏水值為-3.200，分別位于第381和382位氨基酸處。以SOPMA（http：//npsapbil.ibcp.fr/cgi-bin/secpred-sopam.pl/）對廣西巴馬小型豬SP1蛋白二級結(jié)構(gòu)進行預測分析，結(jié)果（圖8）表明，有139個氨基酸構(gòu)成α-螺旋，占氨基酸總數(shù)的17.84%；166個氨基酸構(gòu)成延伸鏈，占氨基酸總數(shù)的21.31%；76個氨基酸構(gòu)成β-轉(zhuǎn)角，占氨基酸總數(shù)的9.76%；398個氨基酸構(gòu)成無規(guī)則卷曲，占氨基酸總數(shù)的51.09%。

2. 5 真核表達載體pEGFP-N1-SP1的鑒定結(jié)果

構(gòu)建的重組質(zhì)粒pMD18-T-SP1-Xho I/Kpn I經(jīng)Xho I和 Kpn I雙酶切鑒定，結(jié)果獲得大小分別為2800 bp的pMD18-T載體條帶和2400 bp左右的目的條帶（圖9），與預期結(jié)果相符，表明在目的片段兩端已成功加入酶切位點。對構(gòu)建的真核表達載體pEGFP-N1-SP1進行PCR驗證和雙酶切鑒定，其電泳結(jié)果顯示在2400 bp附近均出現(xiàn)單一明亮的目的條帶（圖10），表明真核表達載體pEGFP-N1-SP1中含有正確的廣西巴馬小型豬SP1基因序列。

2. 6 293T細胞轉(zhuǎn)染效果

相同條件下，分別以真核表達載體pEGFP-N1-SP1和pEGFP-N1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細胞，轉(zhuǎn)染48 h后于倒置熒光顯微鏡下進行觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)pEGFP-N1-SP1和pEGFP-N1轉(zhuǎn)染的293T細胞均可觀察到綠色熒光（圖11），但pEGFP-N1的轉(zhuǎn)染效果（熒光量及熒光強度）優(yōu)于pEGFP-N1-SP1，空白對照組未觀察到熒光，表明真核表達載體pEGFP-N1-SP1成功轉(zhuǎn)染至293T細胞中并表達出綠色熒光蛋白，進一步佐證真核表達載體pEGFP-N1-SP1構(gòu)建成功。

3 討論

目前，國內(nèi)外關(guān)于SP1的研究主要集中在腫瘤細胞產(chǎn)生和細胞凋亡方面。已有大量研究表明，在腫瘤發(fā)生時期SP1的表達水平較正常情況存在明顯差異，對腫瘤的發(fā)生可能起決定性作用（Black et al.，2001），在臨床醫(yī)學診斷方面已將SP1等轉(zhuǎn)錄因子作為腫瘤發(fā)生的一種示病癥狀予以利用（王麗杰等，2008）。由于SP1對細胞的增殖分化及基因轉(zhuǎn)錄方面具有重要調(diào)節(jié)作用，因此可利用插入或敲除SP1基因的方法上調(diào)或下調(diào)動物生產(chǎn)相關(guān)基因表達，其在動物生產(chǎn)方面的研究潛力非常巨大。熊琪等（2012）研究表明，利用RNA干擾技術(shù)抑制SP1基因表達，能有效促使豬成肌細胞中SKIP啟動子活性顯著下降，說明SP1轉(zhuǎn)錄因子對成肌細胞分化過程中SKIP基因的轉(zhuǎn)錄激活起正向調(diào)控作用。Zhang等（2016）研究表明，SP1通過結(jié)合到ROCK1啟動子區(qū)域而正向調(diào)節(jié)豬ROCK1基因轉(zhuǎn)錄，并影響其造血過程。

本研究成功克隆獲得廣西巴馬小型豬SP1基因，將其CDS序列克隆至pEGFP-N1質(zhì)粒中構(gòu)建了真核表達載體pEGFP-N1-SP1，通過轉(zhuǎn)染293T細胞發(fā)現(xiàn)真核表達載體pEGFP-N1-SP1可成功轉(zhuǎn)染293T細胞并表達出綠色熒光蛋白，即可直接用于后期SP1基因功能探索及干擾表達等研究，節(jié)省反復構(gòu)建載體的時間。測序結(jié)果表明，廣西巴馬小型豬SP1基因CDS序列全長2340 bp，編碼779個氨基酸，與野豬的親緣關(guān)系最近；其編碼SP1蛋白不存在跨膜結(jié)構(gòu)，也不存在信號肽，即SP1蛋白不屬于外分泌型蛋白，主要參與細胞內(nèi)活動，與苗露（2014）的研究結(jié)果一致。廣西巴馬小型豬SP1蛋白二級結(jié)構(gòu)預測結(jié)果顯示，以無規(guī)則卷曲為主要結(jié)構(gòu)元件，占51.09%，推測這些復雜氨基酸位點與其功能實現(xiàn)密切相關(guān)，但具體原理有待進一步探究。

4 結(jié)論

廣西巴馬小型豬SP1基因CDS序列與野豬的參考序列一致，其編碼蛋白主要參與細胞內(nèi)活動，而非外分泌型蛋白，以SP1基因構(gòu)建的真核表達載體pEGFP-N1-SP1能轉(zhuǎn)染293T細胞并成功表達，可直接用于后期SP1基因功能探索及干擾表達等研究。

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（責任編輯 蘭宗寶）