兜蘭炭疽病病原鑒定及其室內(nèi)防治藥劑篩選

徐波 宋鳳鳴 馮淑杰 張榮 劉海濤 曾宋君

摘要：【目的】對兜蘭炭疽病病原菌進(jìn)行鑒定，并進(jìn)行室內(nèi)防治藥劑篩選，為兜蘭炭疽病的大田防控提供參考依據(jù)?！痉椒ā坎杉哂械湫桶Y狀的兜蘭炭疽病標(biāo)本，以組織分離法進(jìn)行病原物分離培養(yǎng)，通過形態(tài)學(xué)觀察和rDNA-ITS序列分析對兜蘭炭疽病病原菌進(jìn)行鑒定；通過室內(nèi)溫度、光照控制和培養(yǎng)基中不同pH、碳源、氮源的差異試驗(yàn)確定病原菌菌絲生長、產(chǎn)孢量和孢子萌發(fā)條件等生物學(xué)特性；選用12種殺菌劑進(jìn)行兜蘭炭疽病病原菌室內(nèi)藥效試驗(yàn)，并對篩選出效果理想的藥劑進(jìn)行室內(nèi)毒力測定?！窘Y(jié)果】通過形態(tài)學(xué)觀察和rDNA-ITS序列分析，確定分離獲得的兜蘭炭疽病病原菌的無性態(tài)為半知菌類黑盤孢目刺盤孢屬膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）。膠孢炭疽菌菌絲生長和分生孢子萌發(fā)溫度為9～36 ℃，最適溫度27 ℃；產(chǎn)孢溫度12～36 ℃，最適溫度30 ℃。膠孢炭疽菌菌絲在55 ℃下處理20 min死亡，孢子在50 ℃下處理30 min或55 ℃下處理20 min死亡。菌絲生長和產(chǎn)孢的pH為2～13，最適為pH 8；分生孢子萌發(fā)的pH為2～12，最適為pH 7。連續(xù)光照有利于膠孢炭疽菌菌絲生長、產(chǎn)孢及分生孢子萌發(fā)。培養(yǎng)基中不同碳源和氮源對菌絲生長、產(chǎn)孢及分生孢子萌發(fā)具有顯著影響（P<0.05）。500 mg/L的惡霉靈、硫磺·甲硫靈、?！じｄ\和咪鮮胺錳鹽4種殺菌劑對膠孢炭疽菌菌絲抑制率和產(chǎn)孢抑制率均達(dá)100.00%，其中咪鮮胺錳鹽的毒力最強(qiáng)、反應(yīng)靈敏度最高，半最大效應(yīng)濃度（EC50）為0.09 mg/L?！窘Y(jié)論】引起兜蘭炭疽病的病原菌為膠孢炭疽菌（C. gloeosporioides）。咪鮮胺錳鹽、硫磺·甲硫靈、惡霉靈和?！じｄ\4種殺菌劑可在室內(nèi)有效防治兜蘭炭疽病，其中以500 mg/L咪鮮胺錳鹽的防治效果最佳。

關(guān)鍵詞： 兜蘭；炭疽??；病原鑒定；生物學(xué)特性；殺菌劑篩選

中圖分類號： S436.611 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：2095-1191（2018）02-0271-09

Abstract：【Objective】Anthracnose pathogen of Paphiopedilum was identified and indoor control chemicals were selected to provide theoretical basis for prevention and control of Paphiopedilum anthracnose. 【Method】The samples of Paphiopedilum with typical anthracnose symptoms were collected. The pathogen was isolated and cultured through tissue isolation. Anthracnose pathogen of Paphiopedilum was identified by morphological observation and rDNA-ITS sequence analysis. The biological characteristics such as pathogen mycelial growth， spore production and spore germination were determined by experiment including indoor temperature， illumination and culture media with different pH values， carbon and nitrogen sources. Sensitivity to 12 fungicides of anthracnose pathogen of Paphiopedilum was tested and then fungicides with fine effects were selected to conduct indoor toxicity test. 【Result】 Through morphological observation and rDNA-ITS sequence analysis， the anamorph of isolated anthracnose pathogen of Paphiopedilum was Colletotrichum gloeosporioides， belonging to Colletotrichum， Melanconiales， fungi imperfecti. The temperature for mycelial growth and conidial germination was 9 ℃ to 36 ℃， and the optimal temperature was 27 ℃. Sporulation temperature was 12-36 ℃， and the optimum temperature was 30 ℃. Lethal temperature for C. gloeosporioides mycelia was 55 ℃ maintaining for 20 min， and lethal temperature of conidia was 50 ℃ maintaining for 30 min or 55 ℃ maintaining for 20 min. pH range for both mycelial growth and sporulation was 2-13 and the optimum pH for the both was 8. pH range for conidial germination was 2-12 and the optimum one was 7. Continuous illumination was good for mycelial growth， sporulation and conidial germination. The carbon and nitrogen sources in media had significant difference on mycelial growth， sporulation and conidial germination（P<0.05）. Under the concentration 500 mg/L， hymexazol， sulfur·Jialiulin， Fufuxin and prochloraz-manganese chloride complex could effectively control mycelial growth and sporulation of anthracnose pathogen，the success rates were both 100.00%. Among the four fungicides， prochloraz had the strongest toxicity and reaction sensitivity， and its concentration for 50% of maximum effect（EC50） was 0.09 mg/L. 【Conclusion】The anthracnose pathogen of Paphiopedilum is Colletotrichum gloeosporioides. Hymexazol， sulfur·Jialiulin， Fufuxin and prochloraz can effectively control Paphiopedilum anthracnose， and prochloraz-manganese chloride complex with concentration of 500 mg/L has the best control effects.

Key words： Paphiopedilum； anthracnose； pathogen identification； biological characteristics； fungicide selection

0 引言

【研究意義】兜蘭（Paphiopedilum）是一種花型獨(dú)特、色彩絢麗的新潮花卉，近年來在我國發(fā)展迅速，但在華南地區(qū)兜蘭商品化栽培過程中較易發(fā)生炭疽病等病害，嚴(yán)重影響了兜蘭植株生長和觀賞價(jià)值，進(jìn)而制約兜蘭產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，因此迫切需要明確引起兜蘭炭疽病的病原菌及其生物學(xué)特性，并篩選出合適的藥劑進(jìn)行防治（曾宋君等，2010）?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】目前我國對兜蘭病害的研究較少，僅有兜蘭立枯病病原菌分離及頡抗菌防治試驗(yàn)（張志光等，1994）及本研究團(tuán)隊(duì)對兜蘭莖腐病病原鑒定及其生物學(xué)特性研究的報(bào)道（徐波等，2014）。炭疽病是兜蘭生產(chǎn)過程中的主要病害之一，主要危害兜蘭的葉片。蘭花炭疽病發(fā)病初期，葉片組織出現(xiàn)淺灰色至黑褐色區(qū)域，隨后壞死，壞死組織逐漸下陷，形成黑色圓形或近圓形凹陷病斑，周圍被黃色暈圈包圍；多個(gè)病斑常聚生成條帶狀，沿葉脈擴(kuò)展，病斑處易破碎；病害發(fā)生嚴(yán)重時(shí)常引起枯葉，甚至全株死亡（劉仲健等，2009）。在華南地區(qū)兜蘭栽培過程中發(fā)生過上述類似癥狀的病害，但未見詳細(xì)報(bào)道。國內(nèi)外已有一些蘭科植物和其他花卉炭疽病病原菌鑒定和室內(nèi)防治殺菌劑篩選的報(bào)道，其病原菌鑒定方法多采用形態(tài)顯微觀察與rDNA-ITS序列分析分子學(xué)鑒定相結(jié)合的方法，室內(nèi)防治殺菌劑的篩選多采用市場常用農(nóng)藥（Park et al.， 1996； 徐明全等，2005；林清洪等，2006； Prapagdee et al.， 2008；高洋等，2010；胡秀榮等，2010；姚錦愛等，2011；周平蘭等，2015）。【本研究切入點(diǎn)】目前，有關(guān)華南地區(qū)兜蘭栽培過程中炭疽病病原菌鑒定及室內(nèi)防治藥劑篩選方面的研究尚無文獻(xiàn)報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】從中國科學(xué)院華南植物園科研溫室采集具有典型炭疽病癥狀的兜蘭標(biāo)本，以組織分離法進(jìn)行病原物分離培養(yǎng)后，通過形態(tài)學(xué)觀察和rDNA-ITS序列分析鑒定兜蘭炭疽病病原菌，并在測定病原菌的生物學(xué)特性基礎(chǔ)上進(jìn)行室內(nèi)防治藥劑篩選試驗(yàn)，以期獲得防治兜蘭炭疽病病原菌的有效殺菌劑，為兜蘭炭疽病防治提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

具有典型炭疽病癥狀的摩帝類兜蘭（Paphiopedilum Maudiae type）標(biāo)本來源于中國科學(xué)院華南植物園科研溫室。

1. 2 試驗(yàn)方法

1. 2. 1 病原菌分離培養(yǎng)及致病性測定 采用組織分離法對兜蘭炭疽病標(biāo)本進(jìn)行病原組織分離培養(yǎng)后進(jìn)行單孢純化培養(yǎng)，再選取具有代表性的菌株置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

人工接種前，將保存的病原菌移植到PDA培養(yǎng)基上25 ℃培養(yǎng)7 d。接種時(shí)，沿兜蘭葉片中部中脈兩側(cè)分別用梅花針刺傷或不刺傷，將直徑為5 mm的菌苔貼在傷口或無傷口處，以無病原菌的空白培養(yǎng)基為對照，接種后保濕24 h。每處理貼10個(gè)菌塊，3次重復(fù)，貼塊后每天觀察發(fā)病情況。對接種后出現(xiàn)明顯癥狀的葉片組織再次分離病原菌。

1. 2. 2 病原菌鑒定 參考有關(guān)文獻(xiàn)（Sutton，1992；吳文平等，1995；陸家云，1997）對確定為致病菌的菌株進(jìn)行形態(tài)鑒定。

采用CTAB法提取病原菌DNA，利用PCR擴(kuò)增rDNA-ITS序列，進(jìn)行病原菌分子鑒定。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后拍照。設(shè)計(jì)的引物為ITS1（5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'）和ITS4（5'-TCCT

CCGCTTATTGATATGC-3'），擴(kuò)增獲得的PCR產(chǎn)物由華大基因生物技術(shù)有限公司進(jìn)行純化與測序，將測序結(jié)果登陸www.ncbi.nlm.nlh.gov網(wǎng)站進(jìn)行BLAST比對，得到病原菌的rDNA-ITS鑒定結(jié)果。

1. 2. 3 病原菌生物學(xué)特性測定 參照方中達(dá)（2001）的方法進(jìn)行病原菌生物學(xué)特性測定。病原菌耐熱力測試時(shí)，把直徑5 mm的病原菌菌餅放在裝有5 mL無菌水的試管中，再將試管分別放入45、50、55和60 ℃的恒溫水浴鍋內(nèi)分別處理5、10、15、20、25和30 min后迅速冷卻，然后將菌餅置于PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)，6 d后觀察病原菌生長情況。有關(guān)溫度、光照和pH處理及不同碳源和氮源對病原菌菌絲生長、產(chǎn)孢量和孢子萌發(fā)影響的測定參考徐波等（2014）的方法。各試驗(yàn)均重復(fù)3次。

1. 2. 4 室內(nèi)防治藥劑篩選試驗(yàn) 室內(nèi)防治藥劑篩選參考徐波等（2014）的方法。所用藥劑包括惡霉靈（70%可濕性粉劑，天津市綠亨化工有限公司）、硫磺·甲硫靈（70%可濕性粉劑，江蘇省南京惠宇農(nóng)化有限公司）、?！じｄ\（80%可濕性粉劑，青島海納生物科技有限公司）、咪鮮胺錳鹽（50%可濕性粉劑，江蘇輝豐農(nóng)化股份有限公司）、苯醚甲環(huán)唑（10%可濕性粉劑，陜西標(biāo)正作物科學(xué)有限公司）、肟菌酯（原藥含量95%，江蘇豐山集團(tuán)有SAS限公司）、多菌靈（50%可濕性粉劑，江蘇江陰福達(dá)農(nóng)化有限公司）、腈菌唑（40%可濕性粉劑，山東省聯(lián)合農(nóng)藥工業(yè)有限公司）、百菌清（75%可濕性粉劑，山東羅邦生物農(nóng)藥有限公司）、甲基托布津（70%可濕性粉劑，日本曹達(dá)株式會(huì)社）、代森錳鋅（80%可濕性粉劑，江西勁農(nóng)化工有限公司）和三唑酮（15%可濕性粉劑，江蘇劍牌農(nóng)化股份有限公司）等12種殺菌劑。配制濃度均為500 mg/L。各試驗(yàn)均重復(fù)3次。

1. 3 統(tǒng)計(jì)分析

運(yùn)用Excel 2010對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，采用SPSS 17.0進(jìn)行差異顯著性分析，利用SAS 9.4進(jìn)行線性回歸分析。

2 結(jié)果與分析

2. 1 致病性測定結(jié)果

以采用組織分離法從兜蘭炭疽病標(biāo)本中獲得的代表性菌株進(jìn)行人工接種，刺傷接種的葉片于接種4～5 d后開始出現(xiàn)組織壞死，其表現(xiàn)癥狀與自然發(fā)病癥狀基本相似（圖1）。從發(fā)病的葉片組織中可分離出相同的病菌，而無刺傷接種和對照均未出現(xiàn)病斑。表明從發(fā)病兜蘭葉片中分離獲得的病菌是導(dǎo)致兜蘭發(fā)生炭疽病的病原菌，而葉片傷口是病原菌的重要入侵途徑。

2. 2 病原菌鑒定結(jié)果

2. 2. 1 病原菌形態(tài)鑒定結(jié)果 由圖2可看出，在PDA培養(yǎng)基上，病原菌一般呈等徑輻射生長，菌落圓形，地毯狀平鋪，初期白色，然后逐漸變?yōu)殚蠙炀G，最終變?yōu)榛液谏?，后期偶有扇變；氣生菌絲由白色至灰白色，逐漸變?yōu)樯罨疑鯛罨蚪q狀。分生孢子梗無色、單胞，卵形、圓桶形或棍棒形，短小。分生孢子呈圓柱形或圓桶狀、單胞、無色、兩頭鈍圓，內(nèi)含2～3個(gè)油球，大小12.50～14.15 μm×3.5～5.5 μm。根據(jù)病原菌形態(tài)特征，參考Sutton（1992）、吳文平等（1995）、陸家云（1997）的描述，初步鑒定該病原菌為膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）。

2. 2. 2 病原菌分子鑒定結(jié)果 擴(kuò)增獲得的PCR產(chǎn)物（圖3）經(jīng)測序后，其測序結(jié)果在GenBank中進(jìn)行BLAST比對，發(fā)現(xiàn)兜蘭炭疽病病原菌的rDNA-ITS序列與C. gloeosporioides（HQ845106.1）具有99%的相似性。結(jié)合該菌的形態(tài)學(xué)觀察及分子生物學(xué)特性，確定兜蘭炭疽病病原菌的無性態(tài)為半知菌類黑盤孢目刺盤孢屬膠孢炭疽菌（C. gloeosporioides）。

2. 3 病原菌生物學(xué)特性

2. 3. 1 溫度對病原菌菌絲生長、產(chǎn)孢量和孢子萌發(fā)的影響 由圖4可知，膠孢炭疽菌菌絲在9～36 ℃內(nèi)均能生長，以27 ℃下的生長較快，在此溫度下培養(yǎng)6 d后菌落直徑為83.67 mm，大于其他11個(gè)處理。在9～27 ℃內(nèi)菌落直徑隨溫度升高而增大；在27～36 ℃內(nèi)菌落直徑隨溫度升高而減小。

膠孢炭疽菌在6、9和39 ℃條件下均沒有孢子產(chǎn)生，產(chǎn)孢溫度為12～36 ℃，最適溫度為30 ℃，在此溫度下培養(yǎng)6 d后產(chǎn)孢量為32.25×106個(gè)/皿，達(dá)最大值。在12～30 ℃內(nèi)產(chǎn)孢量隨溫度升高而增加；在30～36 ℃內(nèi)產(chǎn)孢量隨溫度升高而減少（圖4）。

由圖5可知，膠孢炭疽菌分生孢子在6、9和39 ℃條件下均不能萌發(fā)，其萌發(fā)溫度為12～36 ℃，最適溫度為27 ℃，在此溫度下培養(yǎng)12和24 h，萌發(fā)率分別為15.00%和55.00%（圖5）。

2. 3. 2 病原菌耐熱力測定結(jié)果 由表1可知，膠孢炭疽菌菌絲在水溫45 ℃條件下處理5～30 min、50 ℃條件下處理5～30 min或55 ℃條件下處理5～15 min仍可再生長。隨著處理時(shí)間的延長，對菌絲生長的抑制率逐步升高，在45和50 ℃條件下均以處理30 min效果最佳，抑制率分別為13.44%和32.21%，顯著高于其他處理（P<0.05，下同）。在55 ℃條件下處理20及20 min以上時(shí)菌絲不再生長，抑制率達(dá)100.00%。

由表2可知，膠孢炭疽菌在45 ℃條件下處理5～30 min、50 ℃條件下處理5～25 min或55 ℃條件下處理5～15 min仍能產(chǎn)生孢子，但隨著溫度的升高或處理時(shí)間的延長，對產(chǎn)孢的抑制率逐步升高；在50 ℃條件下處理30 min或55 ℃條件下處理20及20 min以上時(shí)均不能產(chǎn)生孢子。

2. 3. 3 pH對病原菌菌絲生長、產(chǎn)孢量和孢子萌發(fā)的影響 由圖6可知，膠孢炭疽菌菌絲在pH 2～13內(nèi)均可生長和產(chǎn)孢。菌絲生長和產(chǎn)孢的最適pH均為8，在此條件下培養(yǎng)6 d后菌落直徑為85.94 mm，產(chǎn)孢量為30.50×106個(gè)/皿。pH在2～8時(shí)培養(yǎng)6 d后的菌落直徑和產(chǎn)孢量均隨著pH升高而增大；pH在8～13時(shí)培養(yǎng)6 d后的菌落直徑和產(chǎn)孢量均隨著pH升高而減小。

從圖7可知，膠孢炭疽菌分生孢子在pH 13時(shí)不能萌發(fā)，在pH 2～12時(shí)可萌發(fā)，最適pH為7，在此條件下分生孢子培養(yǎng)12和24 h的萌發(fā)率分別為22.69%和44.33%。在pH 2～7內(nèi)孢子萌發(fā)率隨pH升高而升高，在pH 7～12內(nèi)則隨pH升高而降低。

2. 3. 4 光照對病原菌菌絲生長、產(chǎn)孢量和孢子萌發(fā)的影響 不同光照條件對膠孢炭疽菌菌絲生長、產(chǎn)孢和分生孢子萌發(fā)均有影響，連續(xù)光照（3000 lx日光燈）有利于菌絲生長、產(chǎn)孢和分生孢子萌發(fā)；全暗條件不利于菌絲生長、產(chǎn)孢和分生孢子萌發(fā)；而12 h光暗交替有利于菌絲生長和分生孢子萌發(fā)，但不利于產(chǎn)孢（表3）。

2. 3. 5 不同碳源對病原菌菌絲生長、產(chǎn)孢量和孢子萌發(fā)的影響 從表4可知，膠孢炭疽菌在6種供試碳源培養(yǎng)基上和無碳源（無菌水，CK）條件下均能生長和產(chǎn)孢，但無碳源條件下菌絲稀薄，緊貼培養(yǎng)基表面生長。分生孢子在無菌水及濃度為1%的6種供試碳源培養(yǎng)液中均能萌發(fā)。

6種供試碳源培養(yǎng)基培養(yǎng)中，葡萄糖、麥芽糖、果糖、甘露醇和可溶性淀粉對膠孢炭疽菌菌絲生長均起促進(jìn)作用，其中葡萄糖最有利于該菌菌絲生長，其培養(yǎng)的菌株菌落直徑顯著高于其他碳源培養(yǎng)基培養(yǎng)的菌落直徑，其次是果糖和麥芽糖，而乳糖則會(huì)抑制菌絲生長。6種供試碳源培養(yǎng)基中，最有利于膠孢炭疽菌產(chǎn)孢的是麥芽糖，其培養(yǎng)的菌株產(chǎn)孢量著高于其他碳源培養(yǎng)基的產(chǎn)孢量，其次是葡萄糖，而乳糖會(huì)抑制產(chǎn)孢。最有利于分生孢子萌發(fā)的是葡萄糖和可溶性淀粉，二者的孢子萌發(fā)率顯著高于其他碳源培養(yǎng)基的孢子萌發(fā)率，而果糖、乳糖、麥芽糖和甘露醇均會(huì)抑制分生孢子萌發(fā)，其中果糖最不利于分生孢子萌發(fā)。

2. 3. 6 不同氮源對病原菌菌絲生長、產(chǎn)孢量和孢子萌發(fā)的影響 從表5可知，膠孢炭疽菌菌絲在無氮源（無菌水，CK）條件下和6種供試氮源培養(yǎng)基上均能生長，其中硝酸鉀、亞硝酸鈉、硝酸銨和脲均能促進(jìn)膠孢炭疽菌菌絲生長，最有利于膠孢炭疽菌菌絲生長的是硝酸鉀，其培養(yǎng)的菌株菌落直徑顯著高于其他氮源培養(yǎng)基培養(yǎng)的菌落直徑，其次是硝酸銨，而賴氨酸和氯化銨會(huì)抑制菌絲生長。膠孢炭疽菌在氮源為氯化銨的培養(yǎng)基上不能產(chǎn)孢，在其余5種供試氮源和對照培養(yǎng)基上均能產(chǎn)孢，其中，以亞硝酸鈉、硝酸銨和脲為氮源的培養(yǎng)基上產(chǎn)孢量顯著高于對照，亞硝酸鈉最有利于產(chǎn)孢，其次是脲。膠孢炭疽菌分生孢子在無菌水中和濃度為1%的6種供試氮源培養(yǎng)基中均能萌發(fā)，其中硝酸鉀、亞硝酸鈉、硝酸銨和氯化銨均能促進(jìn)分生孢子萌發(fā)，最有利于分生孢子萌發(fā)的是氯化銨，其次是硝酸銨。

2. 4 不同殺菌劑對病原菌的室內(nèi)防效

2. 4. 1 不同殺菌劑對病原菌菌絲生長和產(chǎn)孢量的抑制效果 從表6可知，惡霉靈、硫磺·甲硫靈、?！じｄ\和咪鮮胺錳鹽4種殺菌劑能完全抑制膠孢炭疽菌菌絲生長及孢子產(chǎn)生，菌絲抑制率和產(chǎn)孢抑制率均達(dá)100.00%，是防治兜蘭炭疽病的理想藥劑。苯醚甲環(huán)唑和肟菌酯對膠孢炭疽菌菌絲的抑制率在80.00%以上，且產(chǎn)孢抑制率均達(dá)100.00%，即這2種殺菌劑也適合用于防治兜蘭炭疽病。

2. 4. 2 不同殺菌劑對病原菌的毒力 進(jìn)行咪鮮胺錳鹽、肟菌酯、?！じｄ\和惡霉靈4種殺菌劑對膠孢炭疽菌室內(nèi)毒力測定，結(jié)果（表7）顯示，4種供試殺菌劑的抑菌機(jī)率值y和殺菌劑質(zhì)量濃度轉(zhuǎn)換成的對數(shù)值x的相關(guān)系數(shù)（r）均在0.9500000以上，說明供試殺菌劑的毒力回歸方程均有效。

4種殺菌劑咪鮮胺錳鹽、肟菌酯、?！じｄ\和惡霉靈的半最大效應(yīng)濃度（EC50）分別為0.09、1.98、9.77和15.92 mg/L，說明咪鮮胺錳鹽對炭疽病病原菌的毒力最強(qiáng)，惡霉靈對該菌的毒力最弱（表7）。

從表7可知，咪鮮胺錳鹽、?！じｄ\、惡霉靈和肟菌酯的毒力回歸方程的斜率分別為2.770901、0.361001、0.198393和0.151925，以咪鮮胺錳鹽的斜率最大，綜合咪鮮胺錳鹽對膠孢炭疽菌的EC50最小，說明膠孢炭疽菌對咪鮮胺錳鹽的反應(yīng)靈敏度最高。

3 討論

炭疽病是蘭花栽培過程中的常見病害（徐明全等，2005），其病原菌主要為膠孢炭疽菌（C. gloeosporioides）（Park et al.，1996； 徐明全等，2005； Prapagdee et al.， 2008；高洋等，2010；姚錦愛等，2011）和蘭科刺盤孢菌（C. orchidearum）（姚圣梅和姜曉明，1997）。本研究首次從華南地區(qū)的兜蘭炭疽病標(biāo)本中分離鑒定出其病原菌的無性態(tài)為膠孢炭疽菌，該菌菌絲生長及分生孢子萌發(fā)的溫度為9～36 ℃，最適溫度均為27 ℃，產(chǎn)孢溫度為12～36 ℃，最適溫度為30 ℃，喜中高溫環(huán)境，與高洋等（2010）對墨蘭炭疽病菌生物學(xué)特性研究結(jié)果相近，但與姚錦愛等（2011）對建蘭炭疽病菌生物學(xué)特性研究結(jié)果存在明顯差異，可能與兜蘭和墨蘭炭疽病菌均來自于華南地區(qū)，而建蘭炭疽病菌來自福建有關(guān)。但兜蘭與墨蘭炭疽病菌的生物學(xué)特性略有差異，可能是膠孢炭疽菌在不同的寄主材料中具有不同的生態(tài)適應(yīng)性。

目前尚無兜蘭膠孢炭疽菌致死溫度的文獻(xiàn)報(bào)道。本研究結(jié)果表明，兜蘭膠孢炭疽菌菌絲在55 ℃下處理20 min死亡，孢子在50 ℃下處理30 min或55 ℃下處理20 min死亡，故采用水浴55 ℃處理20 min兜蘭膠孢炭疽菌，其菌絲和分生孢子即可同時(shí)死亡，此溫度可作為基質(zhì)消毒的參考依據(jù)。

本研究在葡萄糖、果糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇和可溶性淀粉6種碳源中，只有乳糖對兜蘭膠孢炭疽菌菌絲生長、產(chǎn)孢及分生孢子萌發(fā)均起抑制作用。但譚舒心（2009）的研究結(jié)果顯示乳糖能促進(jìn)蜘蛛蘭褐斑病膠孢炭疽菌菌絲生長和產(chǎn)孢，姚錦愛等（2011）也研究發(fā)現(xiàn)乳糖能促進(jìn)建蘭炭疽病膠孢炭疽菌菌絲生長；而汪濤（2007）的研究結(jié)果顯示乳糖對百合炭疽菌的菌絲生長和產(chǎn)孢影響不顯著，張海珊（2008）的研究結(jié)果認(rèn)為乳糖對麥冬炭疽菌菌落生長影響不顯著，但能促進(jìn)產(chǎn)孢。引起這些差異的原因可能是膠孢炭疽菌適應(yīng)生存環(huán)境的結(jié)果，但具體原因尚需進(jìn)一步研究。

關(guān)于氮源對膠孢炭疽菌菌絲生長的影響報(bào)道主要集中于硝酸銨、氯化銨、硝酸鉀和脲等。本研究結(jié)果顯示，氯化銨抑制兜蘭膠孢炭疽菌菌絲生長，硝酸銨和硝酸鉀促進(jìn)菌絲生長，與譚舒心（2009）對蜘蛛蘭褐斑病病原菌的試驗(yàn)結(jié)果一致，但姚錦愛等（2011）研究發(fā)現(xiàn)，硝酸銨和氯化銨均能促進(jìn)建蘭炭疽病病原菌菌絲生長，硝酸鉀則抑制菌絲生長。林清洪等（2006）研究發(fā)現(xiàn)，脲和硝酸銨均能抑制鶴望蘭炭疽病菌產(chǎn)孢，與本研究脲和硝酸銨均能促進(jìn)兜蘭膠孢炭疽菌產(chǎn)孢的結(jié)果相反，其原因可能與寄主不同有關(guān)系，但具體原因也需進(jìn)一步研究。

在對兜蘭炭疽病殺菌劑藥效試驗(yàn)中，雖然與已報(bào)道的炭疽病種類不同，但同種殺菌劑的防效結(jié)果大致相同。林清洪等（2006）對鶴望蘭炭疽病殺菌劑藥效研究結(jié)果表明，50%咪鮮胺3種濃度對病原菌的抑制率均為100.0%；50%多菌靈3種濃度對病原菌的抑制率分別為99.0%、92.4%和88.2%；70%代森錳鋅和75%百菌清對病原菌的抑菌效果最差。檀根甲（2009）針對采后蘋果炭疽菌的藥劑試驗(yàn)結(jié)果顯示，苯醚甲環(huán)唑的效果最好，EC50為0.115 mg/L，代森錳鋅的效果最差。胡秀榮等（2010）進(jìn)行了7種殺菌劑對柑橘炭疽病菌的室內(nèi)毒力測定，結(jié)果表明咪鮮胺的毒力最強(qiáng)，EC50為0.0741 mg/L。王麗等（2016）測定了三唑類殺菌劑對蘋果炭疽病菌的室內(nèi)毒力，結(jié)果表明，苯醚甲環(huán)唑?qū)μO果炭疽病菌的EC50為0.7200 mg/L，2014和2015年的田間藥效試驗(yàn)結(jié)果表明，10%苯醚甲環(huán)唑WG對炭疽病的防效較好，分別為82.20%和83.53%。本研究中不同殺菌劑對兜蘭膠孢炭疽菌的防效試驗(yàn)結(jié)果顯示，大多數(shù)已報(bào)道的殺菌劑均能有效抵制兜蘭膠孢炭疽菌菌絲生長和產(chǎn)孢，其中咪鮮胺錳鹽能完全抑制菌絲生長和產(chǎn)孢，EC50為0.09 mg/L；苯醚甲環(huán)唑的菌絲抑制率和產(chǎn)孢抑制率分別為86.43%和100.00%，多菌靈的分別為74.42%和95.21%；代森錳鋅和百菌清的抑菌效果較差。因此，在防治兜蘭炭疽病時(shí)，咪鮮胺錳鹽是最值得推薦的殺菌劑，其次是硫磺·甲硫靈、惡霉靈、?！じｄ\和肟菌酯等。為利用本研究成果，還需在兜蘭溫室栽培過程中對兜蘭炭疽病進(jìn)行接種和防治試驗(yàn)，下一步需利用已篩選出的殺菌劑進(jìn)行藥效驗(yàn)證并在溫室栽培過程中對兜蘭炭疽病進(jìn)行有效防控。

4 結(jié)論

在華南地區(qū)引起兜蘭炭疽病的病原菌為膠孢炭疽菌（C. gloeosporioides），咪鮮胺錳鹽、硫磺·甲硫靈、惡霉靈和?！じｄ\等4種殺菌劑可在室內(nèi)有效防治兜蘭炭疽病，其中以500 mg/L咪鮮胺錳鹽的效果最佳。

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（責(zé)任編輯 麻小燕）