廣西北海蔗區(qū)甘蔗白條病發(fā)生情況調(diào)查

韋金菊 魏春燕 宋修鵬 覃振強(qiáng) 譚宏偉 張榮華 龐天 王倫旺 劉璐 李楊瑞

摘要：【目的】對廣西北海蔗區(qū)疑似發(fā)生甘蔗白條病的樣本進(jìn)行PCR檢測鑒定，明確甘蔗白條病在廣西北海的發(fā)生情況，為甘蔗白條病的防控提供科學(xué)依據(jù)。【方法】2016年11月，在廣西北海合浦縣、銀海區(qū)和鐵山港區(qū)采集疑似甘蔗白條病樣本372份，涉及19個(gè)甘蔗品種/系，采用甘蔗白條病病原白條黃單胞菌[Xanthomonas albilineans（Ashby）Dowson]特異引物XAF1和XAR1對采集樣本的DNA進(jìn)行PCR檢測。對部分有陽性條帶的PCR產(chǎn)物進(jìn)行切膠回收，并送樣測序，然后在NCBI上進(jìn)行BLAST比對分析?！窘Y(jié)果】所采集的372份樣本中，有78份樣本擴(kuò)增出目的條帶，陽性檢出率為20.97%；19個(gè)甘蔗品種中，有13個(gè)品種檢測出陽性條帶，檢出率為68.42%，其中白葉病檢出率較高的是柳城07-95、桂糖46號、桂糖42號和柳城07-536，檢出率分別為75.00%、68.75%、48.15%和33.33%。部分陽性條帶經(jīng)克隆后測序，在NCBI上進(jìn)行BLAST比對分析，發(fā)現(xiàn)其與廣西白條病分離物KY315212.1的同源性為99%，表明它們均屬于甘蔗白條病基因片段序列?！窘Y(jié)論】甘蔗白條病已在廣西北海蔗區(qū)發(fā)生危害，今后需加強(qiáng)檢疫工作，防止從疫區(qū)調(diào)運(yùn)感病蔗種，以控制病害進(jìn)一步擴(kuò)散蔓延。

關(guān)鍵詞： 甘蔗白條??；調(diào)查；PCR檢測；廣西北海

中圖分類號： S412 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：2095-1191（2018）02-0264-07

Abstract：【Objective】Sugarcane with suspected leaf scald disease in Beihai sugarcane fields in Guangxi were identified by PCR test to determine whether the disease occurs in Beihai， Guangxi， and to provide scientific basis for the control of sugarcane leaf scald. 【Method】In November， 2016， 372 sugarcane samples with suspected leaf scald disease in Hepu County， Yinhai District and Tieshangang District of Beihai， Guangxi were collected， which belonged to 19 varie-ties/lines. PCR test was conducted on DNA of the samples collected using specific primers XAF1 and XAR1 of Xanthomonas albilineans（Ashby） Dowson（pathogeny of sugarcane leaf scald）. PCR products with positive bands were reco-vered and sequenced， than BLAST comparison of the results were conducted in NCBI. 【Result】In the 372 samples， there were 78 samples amplified target bands with positive detection rate being 20.97%. Out of 19 sugarcane varieties， 13 ones had target band with positive detection rate being 68.42%. The sugarcane varieties with high positive detection rate of sugar-cane leaf scaldwere Liucheng 07-95（75.00%），Guitang 46（68.75%），Guitang 42（48.15%）， Liucheng 07-536（33.33%）. Partial positive bands were cloned and sequenced， then BLAST comparison of their sequences were conducted in NCBI. The results showed that they had 99% homology with the Guangxi leaf scald disease isolate KY315212.1， which confirmed that they belonged to leaf scald disease gene fragment sequences. 【Conclusion】Sugarcane leaf scald disease occurs in Beihai， Guangxi. Therefore， quarantine must be strengthened and diseased sugarcane cannot be transported from infected area to prevent the further spread of the disease.

Key words： sugarcane leaf scald； investigation； PCR test； Beihai， Guangxi

0 引言

【研究意義】甘蔗白條?。⊿ugarcane leaf scald）又名甘蔗葉灼病，是一種細(xì)菌性維管束病害，由白條黃單胞菌[Xanthomonas albilineans（Ashby） Dowson]引起（Rott and Davis， 2000）。該菌菌落在蔗糖和蛋白胨培養(yǎng)基上為黃色和淡黃色，革蘭氏染色反應(yīng)陰性，極生單根鞭毛。病害可通過種苗、砍蔗工具等傳播蔓延（Birch， 2001），美國、柬埔寨、越南和墨西哥等60多個(gè)國家和地區(qū)已有甘蔗白條病發(fā)生的報(bào)道（Davis et al.，1994； Hoy and Grisham，1994； Rott et al.， 1994； Pan et al.，1997）。甘蔗白條病分急性型和慢性型兩種，慢性型主要為害甘蔗葉片，葉片上產(chǎn)生白色至乳黃色長條紋，后期病葉從葉尖至葉緣逐漸干枯至全葉枯萎，似被沸水燙過，葉灼病由此得名；病株節(jié)間變短，葉形短直，易長出白條紋的側(cè)芽和分蘗。急性型癥狀主要表現(xiàn)為整株甘蔗凋萎而死，通常一叢甘蔗中有1～2條患病而其他蔗株表現(xiàn)正常。甘蔗白條病常在耐病品種中潛伏而不表現(xiàn)癥狀，或癥狀表現(xiàn)不明顯，當(dāng)品種更換為不耐病品種時(shí)，該病可能會(huì)突然形成流行性病害，對甘蔗產(chǎn)量和糖分產(chǎn)生嚴(yán)重影響（Hoy and Grisham，1994）。因此，必須重視和加強(qiáng)對該病害的檢疫及預(yù)防工作，確保廣西甘蔗食糖安全和糖業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。【前人研究進(jìn)展】國內(nèi)外對甘蔗白條病的研究主要集中在病害檢測、發(fā)病機(jī)理及病原毒素研究方面。已有研究表明，白條黃單胞毒素和細(xì)胞壁降解酶（CWDEs）均有可能是甘蔗白條病的致病因子（Roper et al.， 2007； Chatterjee et al.，2008； Perez-Donoso et al.，2010； Rott et al.，2011）。甘蔗白條病黃單胞菌的高致病性菌株GPEPC73已獲得基因組全序列，大小約3.8 M，比其他黃單胞菌菌株的基因組（約5.0 M）小（Pieretti et al.，2012）。目前國內(nèi)對甘蔗白條病的研究較少，主要集中在病原檢疫檢測（李文鳳等，2016）及病害調(diào)查方面。在廣東（黃鴻能，1993）、海南（熊國如等，2010）和福建（李瑞美，2016）等蔗區(qū)均曾報(bào)道發(fā)生甘蔗白條病。2016年，李文鳳等（2017）在廣西發(fā)現(xiàn)甘蔗白條病，并利用白條黃單胞菌特異引物XAF和XAR對樣品DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得大小約600 bp的特異片斷，經(jīng)對部分特異片段回收測序，BLAST檢索結(jié)果表明所得片段序列與GenBank中登錄的白條黃單胞菌raxB1基因的核苷酸序列同源性為100%?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】甘蔗白條病是檢疫性病害，極易隨種苗傳播，對甘蔗產(chǎn)業(yè)發(fā)展具有潛在威脅。目前該病的防治措施主要是加強(qiáng)檢疫，控制病害大面積傳播和暴發(fā)。2015～2016年廣西北海蔗區(qū)陸續(xù)發(fā)現(xiàn)疑似甘蔗白條病癥狀的病株，本研究團(tuán)隊(duì)立即進(jìn)行大田采樣檢測，鑒定疑似甘蔗白條病的病株，調(diào)查發(fā)生情況和發(fā)病品種?！緮M解決的關(guān)鍵問題】采用甘蔗白條病病原白條黃單胞菌特異引物XAF1和XAR1對廣西北海蔗區(qū)發(fā)生的疑似甘蔗白條病樣本的DNA進(jìn)行PCR檢測，明確甘蔗白條病在北海的發(fā)生情況，為甘蔗白條病的防控提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

1. 1. 1 樣品采集 2016年11月，在廣西北海合浦縣、銀海區(qū)和鐵山港區(qū)采集疑似甘蔗白條病樣本（圖1），按五點(diǎn)取樣法取樣，每點(diǎn)取3個(gè)甘蔗樣本，共采集樣本372份，涉及19個(gè)甘蔗品種/系（表1）。樣本用封口袋封口，寫好標(biāo)簽，帶回實(shí)驗(yàn)室。

1. 1. 2 主要試劑和儀器設(shè)備 2×Taq PCR Master Mix購自生工生物工程（上海）股份有限公司； Wolact? Plant Genomic DNA Purification Kit植物基因組DNA提取試劑盒購自凱聯(lián)生物技術(shù)有限公司； 陽性對照DNA由云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究所提供，空白對照為滅菌雙蒸水；PCR儀為德國Biomentra公司產(chǎn)品；Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)為美國伯樂公司產(chǎn)品。

1. 2 試驗(yàn)方法

1. 2. 1 蔗莖DNA提取 取蔗莖組織（定量），用液氮研磨至白色粉末狀，按照Wolact公司生產(chǎn)的植物DNA提取試劑盒說明提取蔗莖DNA，并溶于100 μL 1×TE緩沖液中，置于-20 ℃保存。

1. 2. 2 引物設(shè)計(jì) 引物序列采用文獻(xiàn)（Wang et al.， 1999）報(bào)道的甘蔗白條病病菌[X. albilineans （Ashby） Dowson]基因保守序列設(shè)計(jì)特異引物，XAF1：5'-CCTGGTGATGACGCTGGGTT-3'；XAR1：5'-CGATCAGCGATGCACGCAGT-3'，并委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成，預(yù)期產(chǎn)物大小為600 bp。

1. 2. 3 PCR檢測 PCR檢測參考李文鳳等（2016）的方法并有所改進(jìn)。PCR反應(yīng)體系（20.0 μL）：DNA 模板3.0 μL，2×Taq PCR Master Mix 8.0 μL，上、下游引物各 0.2 μL（20 μg/μL），ddH2O 8.6 μL。 擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性 5 min；94 ℃ 45 s，65 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，進(jìn)行10個(gè)循環(huán)；94 ℃ 45 s，65 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，進(jìn)行10個(gè)循環(huán)；94 ℃ 45 s，65 ℃ 1 min，72 ℃ 3 min，進(jìn)行10個(gè)循環(huán)； 72 ℃延伸10 min。每個(gè)樣品進(jìn)行3次重復(fù)擴(kuò)增檢測。

1. 2. 4 電泳檢測 取8.0 μL擴(kuò)增產(chǎn)物，用1.5%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，在Image Maker VDS成像儀照像，根據(jù)PCR有無特異擴(kuò)增條帶，有特異條帶的經(jīng)凝膠回收試劑盒回收純化后，送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測序。所得序列在NCBI中進(jìn)行BLAST比對分析。

2 結(jié)果與分析

2. 1 PCR檢測結(jié)果

對采集到的372個(gè)甘蔗樣本進(jìn)行PCR檢測，經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)觀察，擴(kuò)增出特異條帶的為陽性，說明所采集的樣品中存在甘蔗白條病病原。健康蔗株、陰性對照和雙蒸水空白對照未能擴(kuò)增出目的條帶。部分樣品的PCR電泳結(jié)果見圖2。

2. 2 疑似白條病PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測序結(jié)果及序列分析

從檢測結(jié)果為陽性的樣本中隨機(jī)選取部分PCR產(chǎn)物回收后進(jìn)行連接、轉(zhuǎn)化，挑取陽性克隆進(jìn)行測序，目的片段大小均為600 bp，經(jīng)BLAST比對分析，發(fā)現(xiàn)其與白條黃單胞菌（X. albilineans）序列廣西分離物KY315212.1有99%的同源性（圖3），因而確定為是白條黃單胞菌引起的甘蔗白條病。

2. 3 廣西北海甘蔗白條病發(fā)生情況調(diào)查結(jié)果

分別提取樣本DNA進(jìn)行PCR檢測，結(jié)果（表2）顯示，19個(gè)甘蔗品種中有13個(gè)品種檢測出陽性條帶，陽性檢出率為68.42%；372份樣本中有78份樣本檢測出陽性條帶，樣本白條病檢出率為20.97%。陽性檢出率較高的是柳城07-95、桂糖46號、桂糖42號和柳城07-536，檢出率分別高達(dá)75.00%、68.75%、48.15%和33.33%；其次是桂糖10-2003、云蔗06-407、粵糖00-236、桂糖07-108、臺糖98-0432 、桂糖49號、柳城05-136、桂糖08-1180和新臺糖22號，陽性檢出率為6.67%～20.00%；桂糖43號、桂糖44號、粵糖93-159、福農(nóng)09-4095、福農(nóng)39號和臺引CE02-67等6個(gè)甘蔗品種的陽性檢出率均為0；桂糖46號以組培苗繁殖的宿根一年甘蔗所采集的樣本陽性檢出率為0。

2. 4 廣西北海不同區(qū)域甘蔗白條病發(fā)生情況

對所采集的372份樣本按行政區(qū)鐵山港區(qū)、銀海區(qū)和合浦縣進(jìn)行分析，結(jié)果（表3）顯示，北海市合浦縣的甘蔗白條病檢出率最高，達(dá)33.33%，其次為銀海區(qū)（18.89%），鐵山港區(qū)甘蔗白條病檢出率為0。

3 討論

據(jù)報(bào)道，甘蔗白條病在美國佛羅里達(dá)州、瓜德羅普島和毛里求斯等地暴發(fā)危害是感病品種大面積種植的結(jié)果（Davis et al.， 1997），對甘蔗產(chǎn)量和糖分造成嚴(yán)重影響（Hoy and Grisham，1994），說明感病品種是該病發(fā)生嚴(yán)重危害的重要因素。在我國臺灣，經(jīng)鑒定對甘蔗白條病具有抗性的品種有NCO310、F156、F160和F173，較抗病的品種有Q42、Q50、Q98、Q813、POJ36、POJ2725、CP807、CP29-116、Co290、Co301、Co331和B4908（黃應(yīng)昆和李文鳳，2002）。通過轉(zhuǎn)基因方法導(dǎo)入白條病解毒基因（albD）可減輕其危害癥狀，但未得到完全抗該病的品種（倉曉燕等，2017）。與此同時(shí)，甘蔗白條病潛伏侵染特性使無癥帶菌種蔗成為病害遠(yuǎn)距離傳播的主要途徑（王中康等，1998）。甘蔗白條病攜帶病菌具有隱藏性，肉眼難以區(qū)分正常植株與感病植株，因而尚未得到重視和采取任何防控措施，為該病害遠(yuǎn)距離傳播蔓延帶來了便利。甘蔗白條病在適宜環(huán)境下易呈突發(fā)性、毀滅性暴發(fā)危害，導(dǎo)致生產(chǎn)上防控處于措手不及的被動(dòng)局面。因此，加強(qiáng)甘蔗白條病的癥狀、致病病原、侵染途徑、病原檢測（王中康等，1998；倉曉燕等，2017）和品種抗性分析與評價(jià)顯得尤為重要。

甘蔗白條病在我國屬于檢疫性病害，曾在福建、江西和廣東等地報(bào)道發(fā)生（全國甘蔗重要病害研究協(xié)作組，1991； 黃鴻能，1993），甘蔗白條病的診斷主要采用PCR檢測（王中康等，1998；李文鳳等，2017），甘蔗白條病發(fā)生的輕重與蔗田地勢、土壤、栽培管理及品種等因素有關(guān)，蔗地低濕易積水誘發(fā)此病，大面積種植感病品種是該病發(fā)生流行的主要條件（倉曉燕等，2017）。本研究結(jié)果表明，廣西北海甘蔗上發(fā)生的病害為甘蔗白條病，病原是甘蔗白色黃單胞菌[X. albilineans（Ashby） Dowson]，與李文鳳等（2017）在廣西北海、來賓和百色3個(gè)蔗區(qū)的檢測結(jié)果一致。本次廣西北海蔗區(qū)甘蔗白條病大面積、多品種發(fā)生，與種植易感品種和利于該病發(fā)生的氣候條件相關(guān)。在以往的調(diào)查中，甘蔗白條病也有零星發(fā)生，但均未引起重視。在廣西北海蔗區(qū)所調(diào)查的19個(gè)甘蔗品種中有13個(gè)品種檢測出甘蔗白條病菌，其中在柳城07-95、桂糖46號、桂糖42號和柳城07-536的檢出率較高，以銀海區(qū)和合浦縣蔗區(qū)較嚴(yán)重，表明甘蔗白條病病原菌在上述蔗區(qū)普遍存在。

控制甘蔗白條病的發(fā)生危害應(yīng)選種不帶該原病菌的蔗種。種植抗病品種是防治甘蔗白條病病害的最有效措施（倉曉燕等，2017）。在甘蔗品種調(diào)運(yùn)擴(kuò)繁過程中，需加強(qiáng)檢驗(yàn)檢疫，杜絕從甘蔗白條病疫區(qū)調(diào)運(yùn)蔗種和留種，防止該病的大面積發(fā)生和傳播（李文鳳等，2009； 倉曉燕等，2017）；通過選用抗病品種、種苗溫水處理、建立無病苗圃等生產(chǎn)無病種苗；對病區(qū)加強(qiáng)栽培管理，及時(shí)拔除燒毀病株、合理排灌、防止干旱（倉曉燕等，2017）等均可有效減輕病害的發(fā)生程度。

本研究對甘蔗白條病病原序列進(jìn)行了比對，下一步將開展該病病原致病機(jī)理等研究，以便采取針對性抗病策略，保障廣西甘蔗產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)健康發(fā)展。

4 結(jié)論

對372份甘蔗樣本的PCR檢測結(jié)果表明，廣西北海發(fā)生的甘蔗病害為甘蔗白條病，該病在桂糖46號等13個(gè)甘蔗品種上有發(fā)生，其中發(fā)生較嚴(yán)重的是柳城07-95、桂糖46號、桂糖42號和柳城07-536，以北海市合浦縣蔗區(qū)發(fā)病最嚴(yán)重。今后需加強(qiáng)檢疫工作，防止從疫區(qū)調(diào)運(yùn)感病蔗種，以控制病害進(jìn)一步擴(kuò)散蔓延。

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（責(zé)任編輯 麻小燕）