聲光可調(diào)—近紅外漫反射光譜法快速評(píng)價(jià)黃芪藥材質(zhì)量

任緒華　蘇婷　姜文月　李亞?wèn)|　鄭廣晶　高陸

中圖分類(lèi)號(hào) R978.7 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2018）02-0168-04

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.02.06

摘 要 目的：建立快速評(píng)價(jià)黃芪藥材質(zhì)量的方法。方法：采用烘干法測(cè)定黃芪藥材樣品水分含量，采用高效液相色譜（HPLC）-蒸發(fā)光散射檢測(cè)法（ELSD）測(cè)定黃芪甲苷的含量，采用HPLC法測(cè)定毛蕊異黃酮葡萄糖苷的含量（均作為參考值）。采用聲光可調(diào)-近紅外漫反射光譜法結(jié)合偏最小二乘法建立預(yù)測(cè)黃芪藥材中上述指標(biāo)含量的定量模型（作為預(yù)測(cè)值）。根據(jù)參考值，采集60批藥材樣品，采用一階導(dǎo)數(shù)聯(lián)合平滑降噪法預(yù)處理光譜，水分、黃芪甲苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量預(yù)測(cè)的最佳波段分別為1 100～2 300、1 080～2 160、1 170～2 230 nm。結(jié)果：藥材樣品中水分、黃芪甲苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷的含量測(cè)定方法學(xué)考察符合要求。水分、黃芪甲苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷定量模型校正均方根偏差分別為0.132 3、0.006 6、0.002 5，預(yù)測(cè)均方根偏差分別為0.237 1、0.016 3、0.004 7，校正集內(nèi)部交叉驗(yàn)證相關(guān)系數(shù)分別為0.975 9、0.953 3、0.968 0；定量模型內(nèi)部驗(yàn)證偏差分別為1.43%、1.90%、1.84%，外部驗(yàn)證偏差分別為1.73%、2.68%、2.71%。結(jié)論：該方法快速、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便、無(wú)污染，可用于黃芪藥材質(zhì)量的快速評(píng)價(jià)。

關(guān)鍵詞 近紅外漫反射光譜法；聲光可調(diào)；黃芪；水分；黃芪甲苷；毛蕊異黃酮葡萄糖苷

ABSTRACT OBJECTIVE： To establish the method for rapid quality evaluation of Astragali Radix. METHODS： The moisture of medicinal material was determined by oven drying method； the content of astragaloside Ⅳ was determined by HPLC-ELSD； the content of isoflavone glucoside was determined by HPLC （as reference value）. The partial least squares （PLS） method combined with acousto-optic turnable filter-NIDRS was adopted to build quantitative model of above indexes in Astragali Radix （as predict value）. According to reference value， 60 batches of sample were collected. The spectra pretreatment was conducted by first derivative method combined with Savitzky golay. The optimal bands of moisture， astragaloside Ⅳ and isoflavone glucoside were 1 100- 2 300 nm，1 080-2 160 nm，1 170-2 230 nm，respectively. RESULTS： The content determination of moisture， astragaloside Ⅳ and isoflavone glucoside in samples were all in line with methodology requirements. The corrected mean square root deviation of quantitative model for moisture， astragaloside Ⅳ， calycosin glucoside were 0.132 3， 0.006 6， 0.002 5， respectively； predicted mean square root deviation were 0.237 1， 0.016 3， 0.004 7； internal cross validation coefficient of correction set were 0.975 9， 0.953 3， 0.968 0； internal verification deviation of quantitative model were 1.43%， 1.90%， 1.84%； external verification deviation were 1.73%， 2.68%， 2.71%， respectively. CONCLUSIONS： The method is rapid， accurate，simple，pollution-free， and can be used for rapid quality evaluation of Astragali Radix.

KEYWORDS NIDRS； Acousto-optic turnable filter； Astragali Radix； Moisture； Astragaloside Ⅳ； Isoflavone glucoside

中藥材在采購(gòu)、驗(yàn)收、入庫(kù)、投料過(guò)程中存在著質(zhì)量檢測(cè)程序繁雜、費(fèi)時(shí)長(zhǎng)等問(wèn)題，不能滿(mǎn)足大批量的現(xiàn)場(chǎng)快速分析要求。為解決該問(wèn)題，有必要研發(fā)涵蓋水分、浸出物、特征性成分等不同檢測(cè)項(xiàng)目的快速檢測(cè)方法作為企業(yè)內(nèi)部質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。

近紅外漫反射光譜法（NIR）作為一種快速分析方法，具有很多優(yōu)點(diǎn)，如快速、無(wú)損、環(huán)保，并可對(duì)固體、液體和氣體樣品直接進(jìn)行測(cè)定，無(wú)需復(fù)雜的前處理過(guò)程[1]。隨著儀器與軟件的發(fā)展，NIR法已廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、生物醫(yī)學(xué)、石油化工等領(lǐng)域[2-4]。

黃芪藥材為豆科植物蒙古黃芪[Astragalus membranaceus（Fisch） Bge. var. mongholicus（Bge.） Hsiao]或膜莢黃芪[A. membranaceus（Fisch.） Bge.]的干燥根，化學(xué)成分以皂苷和黃酮類(lèi)化合物為主，具有調(diào)節(jié)免疫功能、促進(jìn)造血功能等作用[5]，是多種中成藥的主要原藥材之一。本研究中，筆者以黃芪藥材樣品中水分、黃芪甲苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷為指標(biāo)，應(yīng)用聲光可調(diào)（AOTF）-NIR法結(jié)合偏最小二乘法（PLS）[6]，建立了快速通用的多指標(biāo)測(cè)定方法，旨在為中藥材整體質(zhì)量的快速評(píng)價(jià)提供借鑒。

1 材料

1.1 儀器

Luminar-5030 型NIR儀，包括樣品旋轉(zhuǎn)臺(tái)、石英樣品杯、 SNAP 光譜分析軟件、CAMO 化學(xué)計(jì)量學(xué)軟件（美國(guó)Brimrose公司）；U3000型高效液相色譜（HPLC）儀（美國(guó) Thermo 公司）；The Unscrabler軟件（挪威CAMO公司）；L-3000 型HPLC儀，包括L-3530型蒸發(fā)光散射檢測(cè)器（ELSD）（北京普源精電科技有限公司）；GZX-9070 MBE型鼓風(fēng)干燥箱（上海博訊醫(yī)療生物儀器股份有限公司）；AB135-S型電子分析天平（瑞士Mettler-Toledo公司）。

1.2 試劑

黃芪甲苷對(duì)照品（批號(hào)：110781-201515，純度：>93%）、毛蕊異黃酮葡萄糖苷對(duì)照品（批號(hào)：111920- 201505，純度：>97.1%）均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，水為純化水。

1.3 藥材

60批黃芪藥材來(lái)源于內(nèi)蒙古、山西、甘肅、遼寧、黑龍江等省區(qū)，由吉林省現(xiàn)代中藥工程研究中心有限公司提供，經(jīng)長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)李煥榮教授鑒定為真品。

2 方法與結(jié)果

2.1 參考值的測(cè)定

2.1.1 水分含量測(cè)定 取藥材樣品粉末（過(guò)4號(hào)篩）約3 g，平鋪于干燥至恒質(zhì)量的扁形稱(chēng)量瓶中，厚度不超過(guò)5 mm，精密稱(chēng)定，開(kāi)啟瓶蓋在100～105 ℃干燥5 h；將瓶蓋蓋好，置于干燥器中，放冷30 min，精密稱(chēng)定，再在上述溫度下干燥1 h；放冷，稱(chēng)定質(zhì)量，重復(fù)至連續(xù)兩次質(zhì)量差異不超過(guò)5 mg為止。根據(jù)減失的質(zhì)量，可知藥材樣品中含水量。結(jié)果，藥材樣品中水分含量為5.11%～9.38%，詳見(jiàn)表1。

2.1.2 黃芪甲苷含量測(cè)定 （1）色譜條件。色譜柱：Shimadzu-GL C18（250 mm×4.6 mm，5 ?m）；流動(dòng)相：乙腈-水（32 ∶ 68，V/V）；流速：1.0 mL/min；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量：20 ?L。色譜見(jiàn)圖1。（2）對(duì)照品溶液的制備。精密稱(chēng)取黃芪甲苷對(duì)照品適量，加甲醇制成黃芪甲苷質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL的對(duì)照品溶液。（3）供試品溶液的制備。取藥材樣品粉末（過(guò)4號(hào)篩）約4 g，精密稱(chēng)定，置于索氏提取器中，精密加甲醇40 mL，冷浸過(guò)夜，再加甲醇適量，加熱回流4 h；回收溶劑并濃縮至干，殘?jiān)铀?0 mL，微熱使溶解，用水飽和正丁醇振搖提取4次，每次40 mL，合并正丁醇液；用氨試液充分洗滌2次，每次40 mL，棄去氨液，正丁醇液蒸干，殘?jiān)铀? mL使溶解，放冷；通過(guò) D101型大孔樹(shù)脂（內(nèi)徑為1.5 cm，柱高為12 cm），以水50 mL洗脫，棄去水液，再用40%乙醇溶液30 mL洗脫，棄去洗脫液，繼續(xù)用70%乙醇溶液80 mL洗脫；收集洗脫液，蒸干，殘?jiān)蛹状既芙?，轉(zhuǎn)移至5 mL量瓶中，加甲醇定容，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。（4）方法學(xué)考察。按相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行方法學(xué)考察。結(jié)果，精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗(yàn)中黃芪甲苷峰面積的 RSD均小于1.8%，表明儀器精密度、溶液穩(wěn)定性、方法重復(fù)性均較好。（5）藥材樣品中黃芪甲苷含量測(cè)定。取60批藥材樣品各適量，按“（3）”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“（1）”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算藥材樣品中黃芪甲苷的含量。結(jié)果，藥材樣品中黃芪甲苷含量為0.033 8%～0.289 8%，詳見(jiàn)表1。

2.1.3 毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量測(cè)定 （1）色譜條件。色譜柱：Shimadzu-GL C18（250 mm×4.6 mm，5 ?m）；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.2%甲酸溶液（B），梯度洗脫（0～20 min，20%A→40%A；20～30 min，40%A）；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：260 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 ?L。色譜見(jiàn)圖2。（2）對(duì)照品溶液的制備。精密稱(chēng)取毛蕊異黃酮葡萄糖苷對(duì)照品適量，加甲醇制成毛蕊異黃酮葡萄糖苷質(zhì)量濃度為50 μg/mL的對(duì)照品溶液。（3）供試品溶液的制備。取藥材樣品粉末（過(guò)4號(hào)篩）約1 g，精密稱(chēng)定，置于圓底燒瓶中，精密加甲醇50 mL，稱(chēng)定質(zhì)量，加熱回流4 h，放冷，再次稱(chēng)定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)；精密量取續(xù)濾液25 mL，回收溶劑至干，殘?jiān)蛹状既芙?，移? mL量瓶中，加甲醇定容，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。（4）方法學(xué)考察。按相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行方法學(xué)考察。結(jié)果，精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗(yàn)中毛蕊異黃酮葡萄糖苷峰面積的RSD均小于1.3%，表明儀器精密度、溶液穩(wěn)定性、方法重復(fù)性均較好。（5）藥材樣品中毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量測(cè)定。取60批藥材樣品各適量，按“（3）”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“（1）”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算藥材樣品中毛蕊異黃酮葡萄糖苷的含量。結(jié)果，藥材樣品中毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量為0.007 7%～0.211 3%，詳見(jiàn)表1。

2.2 NIR定量模型建立與驗(yàn)證

2.2.1 NIR的采集 采樣方式：樣品杯固體采樣。采集條件：掃描間隔2 nm，掃描范圍為1 000～2 500 nm，掃描300次[7]。每批藥材樣品采集3張光譜，計(jì)算平均光譜以建立模型，每次掃描前振蕩樣品杯。藥材樣品的裝樣厚度、裝填的緊密性和顆粒均勻性等在試驗(yàn)中都力求一致，以減小對(duì)結(jié)果的影響。60批藥材樣品的近紅外光譜疊加圖見(jiàn)圖3。

2.2.2 校正集和驗(yàn)證集樣品的選擇 根據(jù)“2.1”項(xiàng)下水分、黃芪甲苷和毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量分布情況，從 60 批藥材樣品中選取一定數(shù)量組成校正集，用于建立NIR模型；其余藥材樣品組成驗(yàn)證集，用于驗(yàn)證模型，詳見(jiàn)表 2。

運(yùn)用The Unscrambler軟件對(duì)表1數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，以PLS 法建立NIR定量分析模型。選擇R2、RMSEC為評(píng)價(jià)指標(biāo)，綜合評(píng)價(jià)不同模型的準(zhǔn)確性與適用性。其中，R2越接近 1，NIR 預(yù)測(cè)值與參考值相關(guān)性越好；RMSEC 越小，所建定量分析模型適用性越強(qiáng)、預(yù)測(cè)效果越好[10]。結(jié)果表明，以FD+SG法預(yù)處理效果最好，可以消除多重光譜偏差；對(duì)導(dǎo)數(shù)光譜進(jìn)行微調(diào)處理，經(jīng)最佳光譜預(yù)處理方法處理后得NIR，詳見(jiàn)圖4。

2.2.4 建模波段的選擇 建模波段要求在包含藥材樣品大量信息的同時(shí)避免冗余信息，降低噪聲干擾。采用 FD+SG法對(duì)不同的波段進(jìn)行手動(dòng)優(yōu)化比較，通過(guò) The Unscrambler 軟件分析得到水分含量預(yù)測(cè)最佳波段為1 100～2 300 nm，黃芪甲苷含量預(yù)測(cè)最佳波段為1 080～2 160 nm，毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量預(yù)測(cè)最佳波段為1 170～2 230 nm，詳見(jiàn)表4。

2.2.5 定量模型的建立 運(yùn)用 The Unscrambler 軟件對(duì)校正集55批藥材樣品進(jìn)行建模，對(duì)光譜采用 FD+SG法預(yù)處理，在“2.2.4”項(xiàng)下波段內(nèi)對(duì)3個(gè)指標(biāo)進(jìn)行建模。結(jié)果，預(yù)測(cè)值與參考值的相關(guān)性較高，且結(jié)果很接近，表明該模型的性能較好，可以用于黃芪藥材中多指標(biāo)的定量分析。校正集樣品NIR模型見(jiàn)圖5。

2.2.6 定量模型的驗(yàn)證 選擇校正集和驗(yàn)證集樣品分別進(jìn)行內(nèi)部驗(yàn)證和外部驗(yàn)證，將其N(xiāo)IR輸入定量模型，預(yù)測(cè)各指標(biāo)含量，再與含量測(cè)定參考值進(jìn)行比較，計(jì)算偏差，結(jié)果見(jiàn)表5（注：表中RMSEP為預(yù)測(cè)均方根偏差）。

3 討論

本試驗(yàn)利用AOTF-NIR法建立了快速測(cè)定黃芪藥材中水分、黃芪甲苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量的分析方法，選用各指標(biāo)的特征光譜區(qū)間，并根據(jù)不同分析對(duì)象優(yōu)選出合適的預(yù)處理方法，對(duì)NIR原始光譜進(jìn)行預(yù)處理，進(jìn)而采用 PLS 法建立了各指標(biāo)含量的NIR 定量模型。

結(jié)果表明，本方法快速、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便、無(wú)污染，可用于黃芪藥材質(zhì)量的快速評(píng)價(jià)。雖然NIR法的準(zhǔn)確度不及HPLC法，但因其上述特點(diǎn)，能滿(mǎn)足工業(yè)生產(chǎn)中大批量采集藥材樣品化學(xué)信息的需求，適用于快速測(cè)定藥材中多指標(biāo)含量，可與法定標(biāo)準(zhǔn)一起構(gòu)建準(zhǔn)確、便捷、普適性強(qiáng)的中藥材整體質(zhì)量快速評(píng)價(jià)方法體系，對(duì)保障最終制劑產(chǎn)品質(zhì)量的穩(wěn)定可控具有重要意義。

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（收稿日期：2017-04-22 修回日期：2017-06-16）

（編輯：張 靜）