小腦頂核注射谷氨酸對慢性內臟高敏感大鼠的作用及其機制研究

甄玲玲　苗　蓓　陳影影　蘇　貞　徐曼秋　費素娟　張建福

徐州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院消化內科(221002)

背景：小腦頂核(FN)參與對心血管、攝食、呼吸運動、急性胃黏膜損傷等內臟活動的調節(jié)，但對內臟高敏感的調節(jié)作用及其可能的機制目前尚未完全清楚。目的：探討小腦FN注射谷氨酸(Glu)對慢性內臟高敏感大鼠的影響及其可能的機制。方法：采用新生期大鼠結直腸擴張(CRD)法制備慢性內臟高敏感模型。8周后，將大鼠分為CRD組、溶劑組(小腦FN注射0.2 μL 0.9% NaCl溶液)、高、中、低劑量Glu組(小腦FN分別注射12、6、3 μg Glu)、3-MPA+Glu組(小腦FN注射谷氨酸脫羧酶抑制劑3-MPA后注射12 μg Glu)、Bic+Glu組(下丘腦外側區(qū)注射GABAA受體拮抗劑Bic后小腦FN注射12 μg Glu)。以痛閾、腹壁回撤反射(AWR)評分和腹外斜肌放電肌電圖(EMG)幅度評估內臟敏感性，檢測丙二醛(MDA)含量和超氧化物歧化酶(SOD)活性。結果：成功制備慢性內臟高敏感大鼠模型。與CRD組相比，Glu可劑量依賴性地升高痛閾(P<0.05)，降低AWR評分和EMG幅度(P<0.05)，降低MDA含量(P<0.05)，升高SOD活性(P<0.05)。與12 μg Glu組相比，3-MPA+Glu組、Bic+Glu組痛閾顯著降低(P<0.05)，AWR評分和EMG幅度顯著升高(P<0.05)，MDA含量顯著升高(P<0.05)，SOD活性顯著降低(P<0.05)。結論：小腦FN注射Glu可明顯降低大鼠內臟敏感性，其機制可能為FN的Glu在谷氨酸脫羧酶作用下生成GABA，與下丘腦外側區(qū)GABAA受體結合，增強腸黏膜組織的抗氧化能力，從而降低內臟敏感性。

腸易激綜合征(irritable bowel syndrome, IBS)是一種常見的腸道功能性疾病，研究表明，IBS患者占消化科門診患者的25%左右[1]。目前IBS的發(fā)病機制尚不明確，普遍認為內臟高敏感在其發(fā)生、發(fā)展中起有重要作用。研究表明，小腦不僅參與對軀體運動的調控，還參與調節(jié)非軀體性活動包括學習、記憶、認知、語言、內臟活動等[2-4]。小腦對胃腸道痛覺的調控作用尚未見報道。本研究通過小腦頂核(FN)注射化學藥物，旨在探討其對慢性內臟高敏感大鼠的影響及其可能的調控機制，從而為研究IBS的發(fā)病機制提供新的思路和治療途徑。

材料與方法

一、實驗動物

新生Sprague-Dawley(SD)幼鼠34只(親代大鼠購自徐州醫(yī)科大學實驗動物中心)，雌雄不拘，每8只與母鼠同籠飼養(yǎng)，母乳喂養(yǎng)，至21 d后幼鼠與母鼠分籠，幼鼠每4只一籠，室溫、晝夜節(jié)律條件下飼養(yǎng)，自由攝食飲水。

二、主要試劑

谷氨酸(Glu)、谷氨酸脫羧酶抑制劑3-MPA、GABAA受體拮抗劑荷包牡丹堿(Bic)均為Sigma公司產(chǎn)品。丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)檢測試劑盒為南京建成生物工程研究所產(chǎn)品。

三、研究方法

1. 實驗分組：將新生幼鼠隨機分為模型組(n=28)和假手術組(n=6)，模型組幼鼠行結直腸擴張(colorectal distension, CRD)。第9周，將模型組大鼠隨機分為七組，分別為CRD組、溶劑組[小腦FN微量注射0.2 μL 0.9% NaCl溶液(NS)]、Glu組(3、6、12 μg Glu分別溶于0.2 μL NS，小腦FN微量注射)、3-MPA+Glu組(20 μg 3-MPA溶于 0.2 μL NS，小腦FN微量注射，10 min后將12 μg Glu注射至小腦FN內)、Bic+Glu組[Bic 10 μg溶于 0.2 μL NS，下丘腦外側區(qū)(LHA)微量注射，10 min后將 12 μg Glu注射至小腦FN內]，每組各4只。

2. 慢性內臟高敏感大鼠模型的建立

①幼鼠慢性內臟高敏感模型的建立：參照Al-Chaer等[5]的方法并作相應改進來制備CRD大鼠，將出生后第8、10、12天的幼鼠，于上午9時和11時采用棉簽沾濕溫水擦拭肛門兩圈，將直徑 3 mm、長10 mm的經(jīng)皮冠狀動脈腔內成形術(PTCA)球囊從肛門完全插入結直腸中，然后行充氣擴張(壓力為60 mm Hg)(1 mm Hg=0.133 kPa)，持續(xù)1 min后放氣撤出，清潔肛門，放回母鼠身邊。假手術組幼鼠僅用球囊刺激肛門，不插入直腸。

②成年大鼠CRD球囊的制作：球囊長度為4 cm，由輸液延長管插入6號乳膠手套小指制成，用絲線結扎導管和指套根部，確保球囊與導管間不漏氣，導管另一端通過三通管，一端連接充氣注射器，另一端連血壓計。球囊制備后充氣，備用。

3. 大鼠內臟敏感性的測定：大鼠實驗前18 h禁食不禁水，以10%水合氯醛麻醉。

①痛閾測量：將涂有石蠟油的球囊輕輕插入大鼠肛門內5～6 cm，肛門外導管固定于大鼠尾根部。緩慢向球囊注射空氣，初始壓力為10 mm Hg，其后依次遞增10 mm Hg，維持10 s 后，抽出空氣，間隔4 min，再次重復加壓，直至大鼠AWR評分達3分，記錄最小的壓力值，實驗重復5次，取均值。

②腹壁回撤反射(abdominal withdrawal reflex，AWR)評分：按前述方法將球囊插入大鼠肛門并固定，然后放入有機玻璃觀察箱內(20 cm×12 cm×9 cm)，待其蘇醒并完全適應環(huán)境30 min后開始實驗。通過注射器向球囊內注入空氣，壓力分別為20、40、60、80 mm Hg，每次持續(xù)20 s，間隔4 min，記錄大鼠AWR評分。每個壓力重復3次，取均值。

AWR評分標準：0分，大鼠無明顯行為變化；1分，大鼠身體靜止不動或僅有簡單的頭部運動；2分，大鼠腹部肌肉開始收縮，但腹壁未抬離桌面；3分，大鼠腹壁明顯收縮變平或下腹壁抬離桌面；4分，大鼠腹壁拱起或伴身體、骨盆躬起。

③腹外斜肌放電肌電圖(electromyography, EMG)幅度：將涂有石蠟油的球囊插入大鼠結直腸內，切開一側腹部皮膚，暴露腹外斜肌，插入消毒銀絲雙電極。采用BL-420E生物信號采集處理系統(tǒng)記錄腹外斜肌的基礎放電(高頻濾波2 kHz，時間常數(shù)0.001 s，采樣頻率40 Hz，靈敏度500 mV，走紙速度250 ms/div)，然后CRD壓力迅速達到20、40、60、80 mm Hg，每次加壓記錄10 s，間隔4 min，記錄各個壓力下腹外斜肌放電幅度。腹外斜肌EMG幅度為每個壓力下腹外斜肌放電的幅度減去基礎放電的幅度。

4. 組織學檢查：行為學實驗完畢后處死大鼠，快速取結直腸段，-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆茫⑷〔糠帜c段固定于4%甲醛溶液，石蠟切片，行HE染色。觀察結直腸局部組織有無損傷、炎癥等病理改變。

5. 核團微量注射：實驗前大鼠禁食18 h，自由飲水。10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，按大鼠腦圖譜，定位小腦FN(坐標：AP 11.64 mm, RL 1.20 mm, H 6.50 mm)和LHA(坐標：AP 2.12 mm, RL 1.50 mm, H 8.40 mm)[6]。采用微量進樣器進行注射，10 min內注射完畢。退出微量進樣器，滴加骨蠟封閉鉆孔，縫合頭皮切口。

注射4 h后檢測各組大鼠痛閾、AWR評分(CRD壓力為40 mm Hg)、EMG幅度(CRD壓力為40 mm Hg)。檢測完畢后，處死大鼠，取出大腦，-80 ℃ 保存，行腦定位鑒定。

6. 腸黏膜MOD含量和SOD活性的測定：將腸組織制成10%的組織勻漿，采用TBA法測定MDA含量(以nmol/100 mg組織干重表示)。取1/4稀釋成1%的組織勻漿，用黃嘌呤氧化酶法測定SOD活性(以U/mg蛋白表示)。

四、統(tǒng)計學分析

結　　果

一、慢性內臟高敏感大鼠模型的建立

與假手術組相比，模型組痛閾顯著降低(P<0.01)；擴張壓力為20、40、60 mm Hg時，模型組大鼠AWR評分和EMG幅度均顯著增高(P<0.01)，而擴張壓力為80 mm Hg時，兩組AWR評分和EMG幅度均無明顯差異(P>0.05)(圖1)。表明新生幼鼠給予CRD，成年后內臟敏感性明顯增強。

二、組織形態(tài)學

HE染色顯示模型組和假手術組大鼠直腸黏膜均未見明顯病理變化。黏膜下層結構完整，周圍間質無明顯水腫、無中性粒細胞、單核細胞等炎性細胞浸潤，無纖維結締組織增生(圖2)。

三、小腦FN注射Glu對大鼠內臟敏感性的影響

*與假手術組比較，P<0.01

A：模型組；B：假手術組

圖2模型組和假手術組大鼠組織形態(tài)學比較(HE染色，×400)

注射前，CRD組、溶劑組以及3、6、12 μg Glu組痛閾、AWR評分、EMG幅度相比均無明顯差異(P>0.05)。注射后，3、6、12 μg Glu組痛閾較CRD組顯著升高(P<0.05)，AWR評分、EMG幅度顯著降低(P<0.05)。與注射前相比，Glu可呈劑量依賴性地升高痛閾、降低AWR評分和EMG幅度(P<0.05)(圖3)。

四、小腦FN注射3-MPA+Glu對大鼠內臟敏感性的影響

與12 μg Glu組相比，3-MPA+Glu組痛閾顯著降低(P<0.05)，AWR評分和EMG幅度顯著升高(P<0.05)(圖4)。

五、LHA注射Bic對大鼠內臟敏感性的影響

與12 μg Glu組相比，Bic+Glu組痛閾顯著降低(P<0.05)，AWR評分和EMG幅度顯著升高(P<0.05)。Bic+Glu組痛閾、AWR評分、EMG幅度與CRD組相比均無明顯差異(P>0.05)(圖5)。

六、大鼠MDA含量和SOD活性

與CRD組相比，3、6、12 μg Glu組MDA含量顯著降低(P<0.05)，SOD活性顯著升高(P<0.05)，且呈劑量依賴性(P<0.05)；而3-MPA+Glu組、Bic+Glu組與CRD組相比無明顯差異。與12 μg Glu組相比，3-MPA+Glu組、Bic+Glu組MDA含量顯著升高(P<0.05)，SOD活性顯著降低(P<0.05)(圖6)。

*與注射前和CRD組比較，P<0.05；#與3 μg Glu組比較，P<0.05；△與6 μg Glu組比較，P<0.05

*與注射前和CRD組比較，P<0.05；#與12 μg Glu組比較，P<0.05

*與注射前和CRD組比較，P<0.05；#與12 μg Glu組比較，P<0.05

*與CRD組比較，P<0.05；#與12 μg Glu組比較，P<0.05

討　　論

IBS的發(fā)病率呈增高趨勢，且發(fā)病機制復雜，其中慢性內臟高敏感作為IBS的特征性病理生理改變已被廣泛認可。

研究表明，哺乳動物腦發(fā)育存在“腦生長發(fā)育突發(fā)期”[7]，大鼠為出生后11 d左右。若在此時受到反復機械性或化學性刺激，容易對大鼠大腦產(chǎn)生永久的結構或功能變化[8]。本實驗參照Al-Chaer等[5]的CRD制備慢性內臟高敏感大鼠模型的方法并作相應改進，選擇在大鼠出生后第8、10和12天，在固定時間給予結直腸球囊擴張刺激1 min，每天2次，共6次。成年后發(fā)現(xiàn)，與假手術組相比，模型組大鼠痛閾降低，AWR評分和EMG幅度增高，且所有大鼠結腸組織未見明顯病理變化。表明有效復制了IBS樣內臟高敏感大鼠模型。

目前認為腦-腸軸與IBS的發(fā)病關系密切。研究發(fā)現(xiàn)，下丘腦室旁核、中腦腹側被蓋區(qū)等核團參與了大鼠慢性內臟痛的調節(jié)[9-10]，而近年神經(jīng)解剖學、行為學、功能性腦成像研究以及對小腦占位性病變患者的臨床研究進一步加深了小腦在非軀體調節(jié)中作用的認識。本課題組以往研究[11-12]通過向小腦FN注射GABAA受體激動劑和拮抗劑，發(fā)現(xiàn)小腦FN通過GABAA受體參與了大鼠急性胃黏膜損傷。本研究中，CRD大鼠小腦FN注射不同劑量Glu，在一定刺激壓力(40 mm Hg)下，可明顯降低大鼠內臟敏感性，并呈劑量依賴性。說明FN可能通過Glu參與對慢性內臟高敏感的調節(jié)，起有一定的鎮(zhèn)痛作用。

Glu在腦組織中的含量很高，屬興奮性神經(jīng)遞質。GABA則屬于抑制性神經(jīng)遞質，因其不能透過血腦屏障，故腦組織中的GABA均由Glu經(jīng)谷氨酸脫羧酶脫羧而生成。本實驗中，在小腦FN注射Glu前先注射谷氨酸脫羧酶抑制劑3-MPA，可抑制Glu的鎮(zhèn)痛作用。說明Glu并非直接調控痛覺的敏感性，而是通過谷氨酸脫羧酶生成的GABA來發(fā)揮調控內臟敏感性的作用。

然而迄今小腦參與非軀體性活動的機制尚未完全闡明。越來越多的證據(jù)表明，小腦-下丘腦之間存在雙向、直接的神經(jīng)纖維投射，即小腦-下丘腦投射(cerebellohypothalamic projection)和下丘腦-小腦投射(hypothalamocerebellar projection)，兩者構成了小腦-下丘腦神經(jīng)環(huán)路。小腦-下丘腦的投射纖維起源于小腦的三個深部核團(FN、間位核和齒狀核)的神經(jīng)元，經(jīng)小腦上腳上行投射至LHA、背內側核、腹內側核、室旁核等重要核團[13]。近年神經(jīng)解剖學研究證明了小腦FN神經(jīng)元的軸突主要投射至LHA，進一步證明了其投射路徑和部位[14]。推測可能是小腦參與內臟活動調節(jié)的解剖學基礎。

小腦FN內存在大量GABA能神經(jīng)元[15]。資料表明，LHA和室旁核神經(jīng)元胞膜上同時存在GABAA和GABAB受體及其亞型[16-17]。鑒于上述研究，本實驗通過LHA注射GABAA受體拮抗劑Bic后再向小腦FN注射Glu，結果顯示痛閾、AWR評分、EMG幅度與CRD組均無明顯差異，說明Glu未能發(fā)揮對內臟敏感性的調控作用。由此可見，小腦FN注射Glu后，慢性內臟高敏感大鼠敏感性的改善可能是主要由小腦FN的Glu在谷氨酸脫羧酶作用下轉化為GABA，然后通過小腦-下丘腦神經(jīng)環(huán)路，與LHA的GABAA受體結合來發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用的。

MDA是反映氧自由基介導的脂質過氧化的間接指標。SOD是生物體內重要的抗氧化酶，是生物體內清除自由基的首要物質，其活性被認為是一種評估抗氧化能力直接的指標。本實驗中，Glu組SOD活性較CRD組升高、MDA含量降低，表明小腦FN注射Glu可增強結直腸組織的抗氧化能力和組織抗損傷的效應。

綜上所述，小腦FN參與了對大鼠內臟痛覺的調控，注射Glu可明顯減輕大鼠內臟敏感性，其機制可能是通過化學刺激小腦FN，使FN神經(jīng)元興奮，神經(jīng)元合成和釋放抑制性神經(jīng)遞質GABA增多，GABA通過小腦-下丘腦神經(jīng)環(huán)路作用于LHA神經(jīng)元胞膜上的GABAA受體，使LHA神經(jīng)元發(fā)生抑制性效應，導致下傳神經(jīng)沖動減少，自主神經(jīng)興奮性減低，使腸黏膜細胞分泌的保護性物質增多，損傷因素減少，增強了腸黏膜組織的抗損傷能力，從而起鎮(zhèn)痛的作用。但結論仍需行進一步研究證實。