血管生成因子AGGF1表達(dá)與結(jié)腸癌患者預(yù)后關(guān)系的研究*

方瑜潔　張明麗

西安市第一醫(yī)院干五消化科(710002)

背景：血管生成在腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移過(guò)程中起關(guān)鍵作用。AGGF1是一個(gè)新發(fā)現(xiàn)的血管生成因子，在多種惡性腫瘤中存在異常表達(dá)。目的：探討AGGF1表達(dá)與結(jié)腸癌患者預(yù)后的關(guān)系。方法：收集西安市第一醫(yī)院2010年1月—2012年12月80例結(jié)腸癌手術(shù)患者的癌組織和配對(duì)癌旁組織標(biāo)本，以免疫組化法檢測(cè)AGGF1表達(dá)。分析癌組織AGGF1表達(dá)與腫瘤臨床病理特征和患者預(yù)后的關(guān)系，以Cox回歸模型分析結(jié)腸癌患者的預(yù)后影響因素。結(jié)果：結(jié)腸癌組織AGGF1表達(dá)陽(yáng)性率顯著高于癌旁組織(67.5%對(duì)32.5%,P<0.05)，并與腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、血管淋巴管浸潤(rùn)和TNM分期顯著相關(guān)(P<0.05)。Kaplan-Meier生存曲線分析顯示，AGGF1陰性表達(dá)結(jié)腸癌患者的生存率顯著高于AGGF1陽(yáng)性表達(dá)患者(P<0.05)。單因素和多因素分析表明，AGGF1與結(jié)腸癌患者預(yù)后顯著相關(guān)(OR=2.09, 95% CI: 1.67～4.45, P=0.011; OR=1.98, 95% CI: 1.72～4.59, P=0.000)。結(jié)論：結(jié)腸癌組織中血管生成因子AGGF1表達(dá)顯著升高，并與腫瘤轉(zhuǎn)移和患者預(yù)后不良相關(guān)，是一個(gè)潛在的預(yù)后指標(biāo)，值得進(jìn)一步深入研究。

結(jié)腸癌是常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤之一，年新發(fā)病例數(shù)在全球惡性腫瘤中居第三位[1]。結(jié)腸癌的發(fā)生、發(fā)展是一個(gè)多步驟、多階段的過(guò)程，但是其具體機(jī)制尚不清楚。AGGF1(angiogenic factor with G-patch and FHA domains 1)基因于2004年首次被克隆、鑒定[2]，該基因高表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞，編碼蛋白具有強(qiáng)烈的血管生成作用。研究發(fā)現(xiàn)AGGF1在多種惡性腫瘤中存在異常表達(dá)，可能參與了腫瘤演進(jìn)過(guò)程中的多種病理過(guò)程，在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中起重要作用，并與患者預(yù)后不良密切相關(guān)[3-6]。本研究通過(guò)分析80例結(jié)腸癌患者的AGGF1表達(dá)情況及其相關(guān)臨床資料，旨在探討AGGF1表達(dá)與結(jié)腸癌患者預(yù)后的關(guān)系。

材料與方法

一、一般資料

回顧性收集西安市第一醫(yī)院2010年1月—2012年12月結(jié)腸癌手術(shù)患者80例。入選患者中男性47例，女性33例，年齡37～78歲，平均(57.2±6.3)歲，術(shù)前均未接受放化療以及其他相關(guān)治療；結(jié)腸癌診斷經(jīng)術(shù)后病理檢查證實(shí)，手術(shù)標(biāo)本蠟塊保存于病理科，臨床病理資料和隨訪信息完整。研究方案經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審核通過(guò)。

二、方法

1. 資料采集：通過(guò)查閱住院病史獲取患者臨床病理資料，電話和門(mén)診隨訪生存信息，以手術(shù)時(shí)間為隨訪起點(diǎn)，截止至2017年12月。

2. AGGF1免疫組化染色：采用免疫組化SP法，主要試劑購(gòu)自北京諾和生物技術(shù)有限公司。結(jié)腸癌組織和配對(duì)癌旁非癌組織病理切片二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化；3% H2O2室溫孵育10 min；檸檬酸鈉緩沖液95 ℃加熱10 min，室溫放置30 min，PBS漂洗；10%羊血清室溫孵育30 min；加入AGGF1抗體，4 ℃過(guò)夜；多次沖洗后加入生物素標(biāo)記的兔二抗，室溫孵育30 min；DAB顯色，蘇木精復(fù)染，梯度乙醇脫水，中性樹(shù)脂封片，光學(xué)顯微鏡下觀察。

AGGF1主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)，免疫陽(yáng)性物質(zhì)呈淡黃色至棕褐色。于200倍視野下計(jì)數(shù)不少于200個(gè)細(xì)胞，根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞比例和染色強(qiáng)度進(jìn)行免疫組化評(píng)分。陽(yáng)性細(xì)胞比例：0分，無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞；1分，陽(yáng)性細(xì)胞<10%；2分，陽(yáng)性細(xì)胞10%～50%；3分，陽(yáng)性細(xì)胞>50%。 染色強(qiáng)度：0分，不著色；1分，淡黃色；2分，棕色；3分，棕褐色?？偡譃閮身?xiàng)評(píng)分的乘積，≥1分判定為AGGF1表達(dá)陽(yáng)性。由2名病理專(zhuān)科醫(yī)師進(jìn)行獨(dú)立評(píng)分，評(píng)分不一致時(shí)由上級(jí)病理學(xué)專(zhuān)家確定最終評(píng)分。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié)　　果

一、結(jié)腸癌組織AGGF1表達(dá)

免疫組化染色顯示，80例結(jié)腸癌組織中54例AGGF1表達(dá)陽(yáng)性，配對(duì)癌旁組織中26例AGGF1表達(dá)陽(yáng)性，癌組織AGGF1表達(dá)陽(yáng)性率明顯高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(67.5%對(duì)32.5%, χ2=19.600,P<0.001)(圖1)。

A：AGGF1陽(yáng)性表達(dá)；B：AGGF1陰性表達(dá)

二、AGGF1表達(dá)與結(jié)腸癌臨床病理特征的相關(guān)性

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示，結(jié)腸癌組織中的AGGF1表達(dá)與腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、血管淋巴管浸潤(rùn)和TNM分期之間存在顯著相關(guān)性(P<0.05)，與患者性別、年齡以及腫瘤大小和浸潤(rùn)深度無(wú)明顯關(guān)聯(lián)(P>0.05)(表1)。

三、AGGF1表達(dá)陽(yáng)性與陰性結(jié)腸癌患者生存率比較

Kaplan-Meier生存曲線分析顯示，AGGF1陰性表達(dá)結(jié)腸癌患者的生存率明顯高于AGGF1陽(yáng)性表達(dá)患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖2)。

四、結(jié)腸癌患者預(yù)后影響因素的單因素和多因素分析

Cox回歸模型單因素分析顯示，腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、血管淋巴管浸潤(rùn)、TNM分期和AGGF1表達(dá)與結(jié)腸癌患者的預(yù)后顯著相關(guān)(P<0.05)(表2)；多因素分析中、上述因素亦均與預(yù)后顯著相關(guān)(P<0.05)(表3)。

表1　AGGF1表達(dá)與結(jié)腸癌臨床病理特征的相關(guān)性分析

圖2AGGF1表達(dá)陽(yáng)性與陰性結(jié)腸癌患者生存率比較(Kaplan-Meier生存曲線)

表2　結(jié)腸癌患者預(yù)后影響因素單因素分析(Cox回歸模型)

表3　結(jié)腸癌患者預(yù)后影響因素多因素分析(Cox回歸模型)

討　　論

結(jié)腸癌是最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移力強(qiáng)，但腫瘤轉(zhuǎn)移的確切機(jī)制尚不清楚。血管生成在腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移過(guò)程中起關(guān)鍵作用，以腫瘤血管生成為靶點(diǎn)探索新的預(yù)后評(píng)估指標(biāo)和新的治療方案具有重要臨床意義。AGGF1是一個(gè)新發(fā)現(xiàn)的血管生成因子，參與血管分化，啟動(dòng)血管生成和血管網(wǎng)絡(luò)維護(hù)。在斑馬魚(yú)胚胎中，AGGF1被證實(shí)具有調(diào)控血管生成和分化、參與靜脈建立的作用[7]。對(duì)肢體缺血小鼠模型的研究[8]亦表明，AGGF1能促進(jìn)血管生成、增加血流量、抑制組織壞死。

研究發(fā)現(xiàn)AGGF1在多種惡性腫瘤中表達(dá)異常，但關(guān)于其在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用機(jī)制尚不完全清楚。本研究檢測(cè)了80例結(jié)腸癌組織及其配對(duì)癌旁非癌組織中的AGGF1表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)癌組織AGGF1表達(dá)陽(yáng)性率顯著高于癌旁組織，與既往在食管鱗癌[3]、肝細(xì)胞癌[4-5]、胃癌[6]中的發(fā)現(xiàn)相一致。上述研究還發(fā)現(xiàn)，AGGF1高表達(dá)與患者生存率降低顯著相關(guān)，是患者預(yù)后不良的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。本研究進(jìn)一步分析了結(jié)腸癌組織AGGF1表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系，結(jié)果顯示其表達(dá)與腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、血管淋巴管浸潤(rùn)和TNM分期顯著相關(guān)；Kaplan-Meier生存曲線分析表明AGGF1陰性表達(dá)患者的生存率顯著高于AGGF1陽(yáng)性表達(dá)患者；Cox回歸模型單因素和多因素分析表明AGGF1是結(jié)腸癌患者的獨(dú)立預(yù)后因素。提示AGGF1可能通過(guò)參與結(jié)腸癌腫瘤血管生成，參與腫瘤進(jìn)展和轉(zhuǎn)移。既往研究[3-5]證實(shí)，AGGF1表達(dá)與腫瘤組織血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)表達(dá)和微血管密度呈顯著正相關(guān)。關(guān)于AGGF1調(diào)控腫瘤血管生成的分子機(jī)制，目前尚不清楚。有研究發(fā)現(xiàn)β-連環(huán)蛋白(β-catenin)在結(jié)腸癌中參與VEGF的表達(dá)調(diào)控[9]；而AGGF1作為核染色質(zhì)相關(guān)蛋白，參與了β-catenin介導(dǎo)的結(jié)腸癌細(xì)胞基因轉(zhuǎn)錄[10]。因此，通過(guò)β-catenin信號(hào)通路誘導(dǎo)VEGF表達(dá)可能是AGGF1參與調(diào)節(jié)結(jié)腸癌腫瘤血管生成的機(jī)制之一。

除參與腫瘤血管生成外，AGGF1表達(dá)異常尚可能通過(guò)其他機(jī)制參與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。有研究[11]發(fā)現(xiàn)，AGGF1蛋白在高級(jí)別尿路上皮癌中的強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)率明顯低于低級(jí)別尿路上皮癌和正常尿路上皮組織，可能的原因是低氧在高級(jí)別尿路上皮癌中更為常見(jiàn)，AGGF1表達(dá)下調(diào)可能通過(guò)抑制低氧誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞凋亡，對(duì)低氧環(huán)境中的腫瘤細(xì)胞發(fā)揮保護(hù)作用。其確切作用機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究。

綜上所述，血管生成因子AGGF1在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)顯著升高，并與腫瘤轉(zhuǎn)移和患者預(yù)后不良相關(guān)，是一個(gè)潛在的預(yù)后指標(biāo)。本研究局限性主要在于樣本量較小以及未評(píng)估AGGF1基因表達(dá)。后續(xù)研究擬完善上述不足，進(jìn)一步探討AGGF1參與結(jié)腸癌腫瘤血管生成的確切機(jī)制。