蒲葵子甲醇提取物抗鼻咽癌的實(shí)驗(yàn)研究

許望純 朱賈嫻 李祖國

作者單位：510515 火箭軍廣州療養(yǎng)院二科(許望純)；510515 南方醫(yī)科大學(xué)病理學(xué)系(朱賈嫻，李祖國)

鼻咽癌是常見的惡性腫瘤之一，好發(fā)于我國南方各省，其發(fā)病率為男性26.1/10萬，女性10.1/10萬，嚴(yán)重危害人民身體健康[1]。目前對鼻咽癌的治療方法主要是放療或以放療為主的綜合性治療[2]，效果雖然滿意，但仍存在嚴(yán)重的放療反應(yīng)及毒副作用，并且需支付昂貴的醫(yī)療費(fèi)用，從而使部分患者難以接受治療。因此，開發(fā)研制高效、低毒、廉價，能同時預(yù)防和治療鼻咽癌的中藥制劑，一方面能促進(jìn)鼻咽癌高發(fā)地區(qū)人民的身體健康，同時對發(fā)展傳統(tǒng)制藥產(chǎn)業(yè)有著重要推動作用，具有極大的社會和經(jīng)濟(jì)意義。

蒲葵子為棕櫚科植物蒲葵的種子，性平，淡，味甘澀，治外傷出血，選方治療各種癌癥[3]。廣東省江門、新會、四會部分居民采用民間流傳秘方自行采集蒲葵子治療中晚期鼻咽癌，取得良好的治療效果。廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院研制的金浦抑瘤片由金不換、蒲葵子、高硒螺旋藻、絞股藍(lán)等組成，經(jīng)臨床應(yīng)用證明具有良好的抗鼻咽癌作用[4]。我們曾對經(jīng)病理診斷確診為鼻咽癌低分化鱗狀細(xì)胞癌的20例患者采用放射治療加蒲葵子為主的中藥治療，隨訪3年，無一例復(fù)發(fā)。另外2例老年鼻咽癌晚期患者，未行放射治療而僅服用蒲葵子，隨訪3年，癌腫有消退。從臨床實(shí)踐中觀察到，蒲葵子中含有有效的抗鼻咽癌藥用成分，且患者服用蒲葵子未見明顯毒副作用。本研究將利用蒲葵子的甲醇提取物，以鼻咽癌細(xì)胞株C666和5-8F為對象進(jìn)行系統(tǒng)的體外抗鼻咽癌活性實(shí)驗(yàn)，旨在確認(rèn)其抗鼻咽癌的作用效果，初步探討其抗癌的機(jī)制，并為受試提取物研制成為抗鼻咽癌的中藥有效制劑提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 細(xì)胞株 人鼻咽癌C666和5-8F細(xì)胞均購自美國ATCC公司，由本實(shí)驗(yàn)室保存。用含有8%的胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基置于37℃ 5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)備用。

1.2 藥物與試劑 蒲葵子采自南方醫(yī)科大學(xué)校園及解放軍廣州療養(yǎng)院院區(qū)綠化植物蒲葵，將蒲葵子自然晾干后粉碎，經(jīng)甲醇萃取為蒲葵子甲醇提取物。RPMI1640培養(yǎng)基購于美國Gibco公司，胎牛血清購于美國Corning公司。CCK8試劑盒購于上海翊圣生物科技有限公司。熒光二抗及DAPI購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。Caspase3和P21抗體及二抗購于美國proteintech公司。Caspase7抗體購于美國ABclonal公司。Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購于江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司。其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

2 方法

2.1 蒲葵子甲醇提取物(LCME)的制備 稱取5 g蒲葵子甲醇萃取物置于錐形瓶，加入100 mL無水甲醇，置于電爐上加熱至沸騰，持續(xù)20 min。過濾，回收濾渣，再加入100 mL無水甲醇煮沸20 min，重復(fù)3次。合并濾液，倒入蒸發(fā)皿中加熱蒸發(fā)至糊狀物，室溫冷卻后得到1.35 g浸膏，產(chǎn)率27%。將浸膏溶于PBS中，制成不同濃度LCME的PBS溶液，過濾，經(jīng)高溫高壓處理后可用于處理細(xì)胞。

2.2 細(xì)胞培養(yǎng) 人鼻咽癌株C666和5-8F用含體積分?jǐn)?shù)為8%的胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液，在37℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.3 CCK8法檢測 C666和5-8F細(xì)胞中LCME的IC50值取對數(shù)生長期的細(xì)胞接種于96孔板中，每孔1 000個細(xì)胞，每孔體積200 μL，貼壁后加入LCME處理細(xì)胞，濃度設(shè)為0、25、50、100、200、400、500 μg/L 7個組，每個濃度組設(shè)6個平行孔，培養(yǎng)48 h。實(shí)驗(yàn)終止前2 h每孔加入20 μL CCK8試劑，再培養(yǎng)2 h后用酶標(biāo)儀在450 nm測定每孔的吸光度(OD450)值。計算細(xì)胞生長抑制率＝(空白對照組OD450值-藥物處理組OD450值)/空白對照組OD450值×100%。繪制藥物濃度－生長抑制率曲線，并計算IC50值。

2.4 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 取對數(shù)生長期的C666和5-8F細(xì)胞，分別加入130 μg/L和220 μg/L的LCME處理48 h，用普通光學(xué)顯微鏡分別觀察兩株細(xì)胞加藥處理前后的生長情況并攝片。

2.5 免疫熒光共聚焦檢測細(xì)胞中Caspase3蛋白的表達(dá)差異 取對數(shù)生長期的C666和5-8F細(xì)胞接種于共聚焦小皿，分別用濃度為130 μg/L和220 μg/L的LCME處理，培養(yǎng)至適宜密度，棄去培養(yǎng)液，PBS洗滌3次，5 min/次；用4%多聚甲醛室溫下固定30 min后PBS洗滌3次，5 min/次；用0.5%Triton X-100室溫下破膜10 min，PBS洗滌3次，5 min/次；10%正常山羊血清室溫下封閉30 min后稀釋兔抗Caspase3抗體，4℃孵育過夜；次日室溫孵育30 min后PBS洗滌3次，5 min/次；在暗室中加稀釋的山羊抗兔IgG/FITC，孵育30 min后PBS洗滌5次，5 min/次；避光加DAPI，孵育10 min后PBS洗滌3次，5 min/次；激光共聚焦顯微鏡觀察并攝片。

2.6 平板克隆形成實(shí)驗(yàn) 取對數(shù)生長期的C666和5-8F細(xì)胞接種于六孔板，每孔300個細(xì)胞，每孔體積2 mL，貼壁后加入LCME處理細(xì)胞：C666細(xì)胞中LCME濃 度設(shè)為0、65、130、195 μg/L 4個 組 ，5-8F細(xì)胞中LCME濃度設(shè)為0、110、220、330 μg/L 4個組，每個濃度組設(shè)3個復(fù)孔，培養(yǎng)7 d。PBS洗滌3次，5 min/次，用4%多聚甲醛固定20 min后用PBS洗滌3次，5 min/次；吉姆薩染色液染色30 min，流水沖洗15 min，空氣干燥。計數(shù)形成的細(xì)胞克隆數(shù)，并計算克隆形成率＝克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)×100%。

2.7 CCK8法檢測LCME對細(xì)胞增生的影響 取對數(shù)生長期的C666和5-8F細(xì)胞接種于96孔板中，每孔1 000個細(xì)胞，每孔體積200 μL，貼壁后加入LCME處理細(xì)胞：C666細(xì)胞中LCME濃度設(shè)為0、65、130、195 μg/L 4個組，5-8F細(xì)胞中LCME濃度設(shè)為0、110、220、330 μg/L 4個組，每組5個復(fù)孔，培養(yǎng)24 h、48 h、72 h和96 h。終止培養(yǎng)前2 h每孔加入20 μL CCK8試劑，再培養(yǎng)2 h后用酶標(biāo)儀在450 nm測定每孔的吸光度(OD450)值，并繪制各濃度組的時間-OD450值曲線。

2.8 Western Blotting檢測蛋白變化 取對數(shù)生長期的C666和5-8F細(xì)胞，分別加入130 μg/L和220 μg/L的LCME處理48 h；收集細(xì)胞并提取總蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳；用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜；用5%的脫脂牛奶室溫封閉1 h；稀釋Caspase3，Caspase7和P21抗體，4℃孵育過夜；次日室溫孵育30 min后用PBS洗滌3次，10 min/次；用5%的脫脂牛奶稀釋二抗，室溫孵育1 h后用PBS洗滌3次，10 min/次；化學(xué)發(fā)光法顯影，自動凝膠成像系統(tǒng)采集圖像；重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

2.9 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率 取對數(shù)生長期的C666和5-8F細(xì)胞，分別加入130 μg/L和220 μg/L的LCME處理48 h；用不含EDTA的胰酶消化收集細(xì)胞；用PBS洗滌細(xì)胞2次(2 000 rpm離心5 min)，收集約2.5×105個細(xì)胞/管；在暗室中加入Binding Buffer 500 μL/管 、Annexin V-FITC 5 μL/管 和Propidium Iodide 5 μL/管，混勻；反應(yīng)15 min后用流式細(xì)胞儀檢測凋亡細(xì)胞百分比。

2.10 統(tǒng)計學(xué)處理 所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism7進(jìn)行分析，計量資料采用(±s)表示，多組比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 CCK8法檢測C666和5-8F細(xì)胞中LCME的IC50值 各濃度LCME處理細(xì)胞48 h后的藥物濃度-生長抑制率曲線(圖1)?？梢姴煌瑵舛鹊腖CME對兩株細(xì)胞的增生均有一定的抑制作用，且濃度越高，抑制作用越明顯。計算得C666的48 h IC50＝130 μg/L，5-8F的48 h IC50＝220 μg/L。

圖1 不同濃度蒲葵子甲醇提取物作用下C666和5-8F細(xì)胞株的生長抑制率

3.2 形態(tài)學(xué)觀察分析 普通光鏡下未經(jīng)LCME處理的C666和5-8F細(xì)胞呈簇狀平鋪排列，形狀規(guī)則，界限清楚，飽滿透亮，呈旺盛的生長趨勢。經(jīng)LCME處理48 h后，貼壁細(xì)胞數(shù)量明顯減少，形狀變圓，折光性增強(qiáng)，胞內(nèi)有色素沉著，較多細(xì)胞皺縮或漂浮(圖2)?？梢奓CME誘導(dǎo)了兩種細(xì)胞株發(fā)生凋亡。

圖2 光學(xué)顯微鏡下C666和5-8F細(xì)胞株形態(tài)

3.3 免疫熒光共聚焦檢測細(xì)胞中Caspase3蛋白的表達(dá)差異 熒光顯微鏡下，未經(jīng)LCME處理的對照組C666和5-8F細(xì)胞中綠色熒光呈弱陽性，而經(jīng)過各自IC50濃度的LCME處理48 h后的細(xì)胞，綠色熒光呈強(qiáng)陽性，且均在胞質(zhì)中表達(dá)(圖3)?？梢娊?jīng)過LCME處理后的細(xì)胞胞質(zhì)中凋亡蛋白Caspase3蛋白的表達(dá)量明顯增加。

圖3 免疫熒光共聚檢測C666(A)和5-8F(B)細(xì)胞株中Caspase3的表達(dá)(×120)

3.4 平板克隆形成實(shí)驗(yàn) 不同濃度的LCME對C666和5-8F細(xì)胞的克隆形成均有明顯的抑制作用，且濃度越高，克隆形成率越低，對細(xì)胞生長的抑制作用越明顯，差異具有高度統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01，圖4)。

圖4 不同濃度LCME作用下C666(A)和5-8F(B)細(xì)胞的克隆形成率

3.5 CCK8法檢測LCME對細(xì)胞增生的影響 不同濃度LCME處理后的細(xì)胞與對照組相比，所測得的OD450值有顯著差異，表明各濃度LCME對C666和5-8F細(xì)胞的增生均有明顯的抑制作用，且濃度越高，處理的時間越長，抑制作用越顯著，具有時間和濃度依賴性，差異具有高度統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01，圖5)。

圖5CCKB法檢測不同濃度LCME對C666和5-8F細(xì)胞增生的影響

3.6 Western Blotting檢測蛋白變化 經(jīng)LCME處理48 h的C666和5-8F細(xì)胞與未經(jīng)LCME處理的對照組相比，凋亡蛋白Caspase3，Caspase7和P21表達(dá)水平均明顯上調(diào)(圖6)。

圖6 Western Blotting檢測C666和5-8F細(xì)胞中Caspase3、Caspase7和P21蛋白的表達(dá)變化，GAPDH加對照處理

3.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率 流式細(xì)胞儀PI/Annexin V-FITC雙染色法檢測細(xì)胞凋亡散點(diǎn)圖(圖7)，Q1象限表示機(jī)械性損傷細(xì)胞，Q2象限表示晚期凋亡或繼發(fā)性死亡細(xì)胞，Q3象限表示正常細(xì)胞，Q4象限表示早期凋亡細(xì)胞。從圖7中可見，未經(jīng)LCME處理的C666和5-8F細(xì)胞正常細(xì)胞比例較大，凋亡細(xì)胞較少；經(jīng)LCME處理48 h后正常細(xì)胞減少，凋亡細(xì)胞明顯增多，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。說明LCME可誘導(dǎo)C666和5-8F細(xì)胞發(fā)生凋亡。

圖7 流式細(xì)胞術(shù)檢測C666(A)和5-8F(B)細(xì)胞凋亡率

4 討論

當(dāng)今在惡性腫瘤的綜合治療中，中醫(yī)藥起著重要的作用，配合放療、化療、手術(shù)等現(xiàn)代醫(yī)學(xué)治療的應(yīng)用，具有減輕治療毒副反應(yīng)，增加療效，調(diào)節(jié)患者體質(zhì)等作用[5]。中藥經(jīng)過現(xiàn)代工藝提取其中的有效成分，可以對腫瘤起到直接抑制作用，與傳統(tǒng)中藥相比具有更高的效價和更廣泛的應(yīng)用空間。蒲葵子作為一種常見易采集的中藥材，在民間用于治療各種癌腫。其中以蒲葵子為主要成分的秘方用于治療鼻咽癌已有悠久的歷史，如常用偏方鼻上方(蒲葵子500 g，半枝蓮、莪術(shù)、桑寄生各15 g，鉤藤、山慈菇、走馬胎各12 g，蜂房9 g，蜈蚣3條)用于鼻咽癌的治療，有著良好的抗癌效果。因此，提取蒲葵子中的有效抗鼻咽癌成分，驗(yàn)證和探索其抗癌的藥理作用和作用機(jī)制，從而開發(fā)高效低毒的防治鼻咽癌中成藥，是本實(shí)驗(yàn)的主要研究方向與目的。

已有相關(guān)文獻(xiàn)報道，蒲葵子的水提物具有抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞和多種腫瘤細(xì)胞系的體外增生作用，包括小鼠纖維肉瘤、人類乳腺癌和結(jié)腸癌細(xì)胞，對人肝癌細(xì)胞株HpG2有促凋亡作用，且未觀察到毒副作用[6-7]；蒲葵子的乙醇提取物對人白血病細(xì)胞HL60和人肝癌Bel-7402細(xì)胞的體外增生具有抑制作用[8-9]；并且已從蒲葵子中分離出β-谷甾醇、豆甾醇、薯蕷皂苷元、β-胡蘿卜苷、小麥黃素、芹菜素、正二十六碳醇等主要化學(xué)成分[10]。在預(yù)實(shí)驗(yàn)中我們采用現(xiàn)代中藥分離提純技術(shù)，得到蒲葵子甲醇提取物，發(fā)現(xiàn)其在抑制鼻咽癌細(xì)胞體外增生方面，較水提物的效價更高。為進(jìn)一步分析其抗癌效應(yīng)，我們選擇LCME作為研究對象，通過摸索首先解決了蒲葵子醇提取物難溶于水，不方便做細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)的難題，并通過反復(fù)醇溶解蒸餾的辦法，獲得能溶于水的LCME浸膏，并進(jìn)一步純化，制成PBS溶液用于處理細(xì)胞，使細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)順利進(jìn)行。同時，選擇高成瘤高轉(zhuǎn)移特性鼻咽癌細(xì)胞株5-8F與成瘤具有一定轉(zhuǎn)移特性鼻咽癌細(xì)胞株C666兩種細(xì)胞株進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，使LCME的抗鼻咽癌作用得到更全面的證實(shí)，并且對比其對不同鼻咽癌細(xì)胞株的作用效果。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，LCME對體外培養(yǎng)的C666和5-8F細(xì)胞的增生具有明顯的抑制作用，并且具有時間和濃度依賴性。通過CCK8法測得C666的48 h IC50＝130 μg/L，5-8F的48 h IC50＝220 μg/L，定量其增生抑制活性，可知LCME對C666細(xì)胞株的效價較5-8F細(xì)胞株高。平板克隆形成實(shí)驗(yàn)和CCK8實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證了LCME抑制鼻咽癌細(xì)胞增生的作用。通過經(jīng)LCME處理后的細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察以及流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率，可發(fā)現(xiàn)其誘導(dǎo)了鼻咽癌細(xì)胞發(fā)生凋亡。Western Blotting和免疫熒光實(shí)驗(yàn)提示LCME通過上調(diào)凋亡蛋白Caspase3，Caspase7和P21的表達(dá)水平來誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡。

腫瘤細(xì)胞的增生生長受多種因素的影響，而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡在控制腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中起到重要作用。細(xì)胞凋亡涉及一系列的基因和通路的激活、影響和調(diào)控，最終通過影響蛋白的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)[11]，其中Caspase3，Caspase7和P21均為細(xì)胞凋亡過程中很重要的蛋白質(zhì)。Caspase3和Caspase7是細(xì)胞凋亡的效應(yīng)蛋白，激活后能抑制與細(xì)胞結(jié)構(gòu)、細(xì)胞周期、DNA修復(fù)相關(guān)的多種蛋白和激酶失活，抑制細(xì)胞增生并促進(jìn)凋亡[12]；而P21蛋白可抑制細(xì)胞周期依賴性激酶的活性，參與細(xì)胞的增生、分化、衰老、凋亡等多種功能的調(diào)節(jié)，顯著抑制腫瘤細(xì)胞的生長[13]。由此提示LCME誘導(dǎo)鼻咽癌細(xì)胞凋亡可能通過調(diào)控與細(xì)胞生長發(fā)育相關(guān)的基因和通路來實(shí)現(xiàn)。如 ICE、Bcl-2、Fas/APO-1、C-myc、p53、AIM等均為重要的凋亡調(diào)控因子，LCME可能參與調(diào)控其表達(dá)或影響其功能的發(fā)揮來誘導(dǎo)鼻咽癌細(xì)胞的凋亡。

目前已有實(shí)驗(yàn)研究證明蒲葵子對多種癌癥具有抑制作用[14]，有文獻(xiàn)報道，從蒲葵子中分離出的新型酚類物質(zhì)EHHM通過Caspase途徑和調(diào)節(jié)自噬蛋白來誘導(dǎo)HCC細(xì)胞的凋亡[15]，為深入研究蒲葵子抗癌機(jī)制提供了方向與思路。而蒲葵子提取物中具有確切抗癌活性的化學(xué)成分和配伍，其誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡的具體機(jī)制，對人體內(nèi)環(huán)境的影響，是否與免疫相關(guān)等方面還并非特別明確。本課題組今后將在分析LCME中有效成分及配伍的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探討其誘導(dǎo)鼻咽癌細(xì)胞發(fā)生凋亡的相關(guān)靶向調(diào)控基因及其調(diào)控機(jī)制，并進(jìn)行動物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)療效，從而證實(shí)蒲葵子抗癌的藥理作用和作用機(jī)制，為充分利用蒲葵子資源，開發(fā)研制高效、低毒、廉價，能同時預(yù)防和治療鼻咽癌的中藥制劑提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。