hUCMSCs對半乳糖致衰老小鼠心臟保護作用

劉建亞 馮文靜 牟婕 安妮娜 王仁萍 毛擁軍

[摘要]目的探討人臍帶間充質干細胞（hUCMSCs）對D半乳糖（Dgal）誘導的衰老小鼠的心臟保護作用及其可能的機制。

方法將24只8周齡雄性C57BL/6小鼠隨機分為對照組、模型組和干細胞組，每組8只。對照組頸背部皮下注射滅菌注射用水（5 mL·kg-1·d-1）8周，模型組和干細胞組頸背部皮下注射Dgal（150 mg·kg-1·d-1）8周，至Dgal注射第5周和第7周時，干細胞組分別尾靜脈注射1×106個hUCMSCs，對照組和模型組尾靜脈注射1×PBS（每只0.2 mL）。采用蘇木精伊紅染色觀察心肌組織病理改變，Western Blot檢測熱休克蛋白70（HSP70）和血管內皮生長因子（VEGF）蛋白表達水平，RTPCR檢測炎癥小體相關基因NOD樣受體蛋白3（NLRP3）、白細胞介素18（IL18）、白細胞介素1β（IL1β）mRNA的表達。

結果病理學檢查顯示，模型組出現心肌組織退行性改變，而對照組和干細胞組無相應改變。模型組心肌組織HSP70和VEGF蛋白表達較對照組顯著下降，干細胞組HSP70和VEGF蛋白表達較模型組顯著升高（F=9.76、43.87，P<0.05）。模型組心肌組織中炎癥小體相關基因NLRP3、IL18、IL1β mRNA表達較對照組顯著增加，干細胞組心肌組織中炎癥小體相關基因表達較模型組顯著下降（F=30.04～44.45，P<0.05）。

結論hUCMSCs能有效緩解Dgal誘導的心臟老化，其機制可能與促進血管新生和抑制NLRP3炎癥小體通路有關。

[關鍵詞]間充質基質細胞;臍帶;心臟;衰老;NLR家族，熱蛋白結構域包含蛋白3;半乳糖

[中圖分類號]R329.3

[文獻標志碼]A

[文章編號] 20965532（2018）02018905

衰老是一種正常的生理現象，隨著年齡增長，機體出現一系列退行性改變，從而引起一系列疾病，如心血管疾病。在機體衰老的過程中，固有免疫應答被激活，從而產生一種系統性、低水平的慢性炎癥，即炎性衰老[1]。炎癥小體是由多種蛋白組成的復合體，在機體固有免疫應答和炎癥反應中起著重要的作用，其中NOD樣受體蛋白3（NLRP3）炎癥小體目前研究最為廣泛，它可以促進白細胞介素18（IL18）和白細胞介素1β（IL1β）等炎癥因子的成熟和釋放，從而引起一系列炎癥反應[23]。研究表明，當機體促炎癥遞質腫瘤壞死因子α（TNFα）、白細胞介素6（IL6）、IL18、IL1β等水平升高時，機體處于一種促炎癥狀態(tài)，引起炎性衰老的發(fā)生[4]。熱休克蛋白70（HSP70）具有抗炎作用，隨著年齡的增長其表達下調，在機體衰老過程中起著重要的作用，現已作為衰老的生物學標志物之一[56]。間充質干細胞具有多向分化潛能，可以延緩大鼠自然衰老引起的心臟老化，改善衰老引起的心功能下降[7]。人臍帶間充質干細胞（hUCMSCs）可以直接從人臍帶華爾通膠中獲得，具有易于獲取和分離、來源豐富、不涉及倫理問題、低免疫原性等優(yōu)點，現已廣泛應用于臨床研究[8]。hUCMSCs是一種具有自我更新和多向分化潛能的干細胞，在一定環(huán)境下可以分化成機體內各種細胞，具有促進組織修復與再生、調節(jié)免疫應答、促進血管內皮生長因子（VEGF）分泌等生物學作用[910]，有巨大的臨床應用價值。D半乳糖（Dgal）可以誘導氧化應激、炎癥反應的產生，進而加速機體衰老的進程，尤其是腦、心臟等組織器官的衰老;Dgal致衰老模型具有價格低廉、簡單易行、結果穩(wěn)定等優(yōu)點，現已被廣泛應用于老年病、衰老機制、抗衰老藥物篩選等方面的研究[1113]。本研究采用Dgal誘導的心臟老化動物模型，探討hUCMSCs對衰老小鼠的心臟保護作用及其可能機制，以期為延緩心臟老化提供新的理論依據及干預靶點?，F將結果報告如下。

1材料和方法

1.1實驗材料

1.1.1動物SPF級C57BL/6雄性小鼠24只，8周齡，購自濟南朋悅實驗動物繁育有限公司。小鼠在12 h晝夜循環(huán)、室溫18～22 ℃、相對濕度40%～60%的條件下，飼養(yǎng)于青島大學醫(yī)學部實驗動物中心，自由進食飲水。

1.1.2細胞和試劑hUCMSCs由國家干細胞與生物診療工程研究中心青島奧克生物開發(fā)有限公司提供;Dgal購自美國Sigma公司，VEGF鼠單克隆抗體購自Santa Cruz公司，HSP70兔單克隆抗體購自Abcam公司，GADPH兔抗多克隆抗體、山羊抗鼠IgG抗體、山羊抗兔IgG抗體購自武漢伊萊瑞特公司，RIPA裂解液購自上海碧云天公司，BCA蛋白濃度測定試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司，ECL顯影液購自美國Millipore公司，TRIzol購自美國Life Technologies公司，逆轉錄試劑盒、PCR Mix購自瑞士Roche公司。

1.1.3主要儀器實驗用凝膠成像分析儀購自法國VILBER公司，Western Blot蛋白檢測儀購自美國BioRad公司，RTPCR儀購自瑞士Roche公司，熱循環(huán)儀購自美國Perkin Elmer公司，紫外線分光光度計購自德國IMPLEN公司，熒光顯微鏡購自日本Olympus公司。

1.2實驗方法

1.2.1實驗分組及處理24只小鼠隨機分為對照組、模型組和干細胞組，每組8只。小鼠適應性喂養(yǎng)1周后，對照組給予頸背部皮下注射滅菌注射用水5 mL·kg-1·d-1，模型組和干細胞組給予頸背部皮下注射Dgal 150 mg·kg-1·d-1，連續(xù)注射8周。至Dgal注射第5周和第7周，干細胞組尾靜脈注射1×106 個hUCMSCs，對照組和模型組尾靜脈注射1×PBS（每只0.2 mL）。實驗結束后，稱體質量、處死動物，留取心臟組織標本。取小鼠心肌組織，用甲醛固定后，常規(guī)石蠟包埋切片，蘇木精伊紅染色，在光學顯微鏡下觀察。

1.2.2Western Blot檢測HSP70和VEGF蛋白表達用RIPA裂解液裂解心臟組織，BCA法測定蛋白質含量，取等量的蛋白進行SDSPAGE凝膠電泳，至溴酚藍到達分離膠底部，轉移至PVDF膜上

（200 mA、110 min），以含30 g/L BSA和50 g/L脫脂奶粉的TBST溶液封閉2 h，加一抗4 ℃搖床孵育過夜，加二抗室溫孵育2 h，ECL顯影，用凝膠成像分析儀捕捉圖像，Quantity One軟件分析條帶灰度值。

1.2.3RTPCR方法檢測NLRP3、IL18以及IL1β的mRNA表達采用TRIzol法提取各組心臟組織的總RNA，紫外線分光光度法測定并計算提取的總RNA含量及濃度，逆轉錄獲得cDNA。采用RTPCR法檢測炎癥小體相關基因NLRP3、IL18和IL1β mRNA相對表達量。所用引物由上海生工生物工程股份有限公司設計合成，引物序列見表1。RTPCR反應條件：95 ℃、600 s;95 ℃、10 s，60 ℃、10 s，72 ℃、15 s，共45個循環(huán);95 ℃、10 s，60 ℃、60 s，97 ℃、1 s。以βactin作為參照，根據2-△△Ct計算目的基因的相對表達量。

1.3統計學處理

應用SPSS 21.0軟件進行統計分析，所得計量資料數據以[AKx-D]±s表示，多組比較采用單因素方差分析（ANOVA），組間兩兩比較采用LSD法，以P<0.05為差異有顯著性。

2結果

2.1小鼠一般情況

對照組和干細胞組小鼠精神狀態(tài)好，行動敏捷，毛發(fā)有光澤，皮膚彈性好;模型組小鼠體質量增長緩慢，自主活動減少，行動遲緩，身體略弓起，毛發(fā)枯黃且易脫落，皮膚彈性差，精神萎靡。

2.2小鼠心肌組織病理學變化

對照組心肌結構和細胞形態(tài)、大小正常;模型組心肌細胞排列紊亂、間隙增大，細胞變大，表現出老化的特征;與模型組比較，干細胞組心肌細胞大小正常、排列規(guī)整、間隙變小。

2.3各組小鼠心肌組織HSP70和VEGF蛋白表達比較

模型組小鼠心肌組織HSP70和VEGF蛋白表達較對照組下降，干細胞組HSP70和VEGF蛋白表達較模型組升高，差異有統計學意義（F=9.76、43.87，P<0.05）。見圖1。

2.4各組小鼠心肌組織NLRP3、IL18和IL1β mRNA表達比較

模型組小鼠心肌組織中的炎癥小體相關基因NLRP3、IL18、IL1β mRNA表達較對照組升高，干細胞組心肌組織中炎癥小體相關基因表達較模型組下降，差異有統計學意義（F=30.04～44.45，P<0.05）。見圖2。

3討論

隨著年齡的增長，衰老相關性疾病發(fā)病率增長迅速，因此延緩衰老的速度，甚至逆轉衰老成為目前研究的熱點。近年來，Dgal誘導的衰老模型被國內外的學者廣泛應用，如神經退行性變模型、心臟老化模型、生殖功能退化模型等[11，14]。在正常情況下，機體可以將Dgal代謝為葡萄糖，然而在過量的情況下，Dgal誘導機體產生過量的氧自由基和糖基化終末產物，后者作用于糖基化終末產物受體，導致炎癥反應、氧化應激、線粒體功能障礙和細胞損傷，誘導劑，激活小鼠體內炎癥小體通路，引發(fā)炎癥反應，加速衰老，表現為小鼠體質量增長緩慢、自主活動減少、毛發(fā)枯黃、精神萎靡等衰老的特征，另外，心肌組織出現心肌細胞間隙增大、細胞肥大等損傷的病理學表現。尾靜脈注射hUCMSCs后，Dgal誘導的機體衰老特征得到改善，心臟組織損傷得到恢復。

HSP70作為衰老的標志物之一，具有抑制炎癥反應的作用。HSP70可能是通過抑制IκBα磷酸化，從而抑制NFκB激活下游的TNFα、IL1β、IL6等促炎癥因子的釋放，抑制炎癥反應的發(fā)生[5，17]。HSP70還可通過調節(jié)全身炎癥狀態(tài)，保護機體臟器不受增齡相關的慢性炎癥損傷[18]。VEGF作用于血管內皮細胞，可促進新生血管生成，改善心肌梗死后心臟功能[1920]。hUCMSCs可促進VEGF的分泌，作用于血管內皮細胞，從而促進血管新生，抑制細胞凋亡和壞死的發(fā)生[9]。本文研究結果顯示，靜脈注射hUCMSCs能夠上調Dgal誘導的老化心肌組織中HSP70、VEGF蛋白的表達，具有抑制心臟慢性炎癥進展、促進心臟血管新生，進而延緩心臟老化的作用。

NLRP3炎癥小體在許多慢性疾病中扮演著重要角色，能夠引起慢性、系統性炎癥以及慢性器官衰竭[21]。有研究表明，Dgal誘導的衰老模型可激活炎癥小體通路，引起機體IL18、IL1β等促炎癥因子的釋放，從而加速炎性衰老的進程，該通路在年齡相關的心血管疾病中亦起著重要的作用[2，22]。研究也表明，移植間充質干細胞可以延緩大鼠自然老化導致的心功能下降[7]，抑制脂多糖活化的NLRP3炎癥小體活性，從而抑制因炎癥反應引起的損傷[23]。hUCMSCs在適當的條件下可以分化為心肌細胞，參與心臟損傷的組織修復[24]，還可通過旁分泌機制分泌細胞因子，促進受損心臟組織的自我修復[25]。本文研究結果顯示，將hUCMSCs通過尾靜脈注射到Dgal誘導的衰老小鼠體內，不僅小鼠的衰老特征得到改善，心肌組織中NLRP3炎癥小體通路也得到抑制，促炎癥因子IL18和IL1β mRNA表達下降，說明hUCMSCs可以改善Dgal誘導的心臟老化，抑制炎性衰老的進展。

綜上所述，hUSMSCs可以延緩Dgal誘導的小鼠心臟老化進展，該作用可能是通過促進血管新生、抑制炎癥小體通路激活實現的，但其具體的作用機制還有待進一步研究。

[參考文獻]

[1]XIA S J， ZHANG X Y， ZHENG S B， et al. An update on inflammaging：mechanisms， prevention， and treatment[J]. Journal of Immunology Research， 2016，2016（1）：112.

[2]GOLDBERG E L， DIXIT V D. Drivers of agerelated inflammation and strategies for healthspan extension[J]. Immunological Reviews， 2015，265（1，SI）：6374.

[3]CHEN Z， LIU Y， SUN B， et al. Polyhydroxylated metallofullerenols stimulate IL1beta secretion of macrophage through TLRs/MyD88/NFkappaB pathway and NLRP （3） inflammasome activation[J]. Small， 2014，10（12）：23622372.

[4]MINCIULLO P L， CATALANO A， MANDRAFFINO G， et al. Inflammaging and antiinflammaging：the role of cytokines in extreme longevity[J]. Archivum Immunologiae et Therapiae Experimentalis， 2016，64（2）：111126.

[5]TODA IM D， FUENTE M D L. The role of Hsp70 in oxiinflammaging and its use as a potential biomarker of lifespan[J]. Biogerontology， 2015，16（6）：709721.

[6]XIA M， DING Q， ZHANG Z D， et al. Remote limb ischemic preconditioning protects rats against cerebral ischemia via HIF1 alpha/AMPK/HSP70 pathway[J]. Cellular and Molecular Neurobiology， 2017，37（6）：11051114.

[7]ZHANG M Y， LIU D， LI S， et al. Bone marrow mesenchymal stem cell transplantation retards the natural senescence of rat hearts[J]. Stem Cells Translational Medicine， 2015，4（5）：494502.

[8]LI T， XIA M X， GAO Y Y， et al. Human umbilical cord me

senchymal stem cells：an overview of their potential in cellbased therapy[J]. Expert Opinion on Biological Therapy， 2015，15（9）：12931306.

[9]LI J， MAO Q X， HE J J， et al. Human umbilical cord mesenchymal stem cells improve the reserve function of perimeno

pausal ovary via a paracrine mechanism[J]. Stem Cell Research & Therapy， 2017，8（1）：55.

[10]CHENG Q T， ZHANG Z， ZHANG S Y， et al. Human umbilical cord mesenchymal stem cells protect against ischemic brain injury in mouse by regulating peripheral immunoinflammation[J]. Brain Research， 2015，1594：293304.

[11]CHANG Y M， CHANG H H， KUO W W， et al. Antiapoptotic and prosurvival effect of alpinate oxyphyllae fructus （AOF） in a Dgalactoseinduced aging heart[J]. International Journal of Molecular Sciences， 2016，17（4）：466.

[12]ALI T， BADSHAH H， KIM T H， et al. Melatonin attenuates Dgalactoseinduced memory impairment， neuroinflammation and neurodegeneration via RAGE/NFBK/JNK signaling pathway in aging mouse model[J]. Journal of Pineal Research， 2015，58（1）：7185.

[13]MU X Y， ZHANG Y Y， LI J， et al. Angelica sinensis polysaccharide prevents hematopoietic stem cells senescence in Dgalactoseinduced aging mouse model[J].