大理白族自治州不同居群堅(jiān)龍膽葉中裂環(huán)烯醚萜類物質(zhì)含量的研究

趙志蓮 張琳 李海峰

中圖分類號(hào) R284 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2018）05-0647-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.05.18

摘 要 目的：探討大理白族自治州（簡(jiǎn)稱大理州）不同居群堅(jiān)龍膽葉中裂環(huán)烯醚萜類物質(zhì)（龍膽苦苷、獐牙菜苦苷、獐牙菜苷）的含量，為堅(jiān)龍膽優(yōu)良品種篩選及其開發(fā)應(yīng)用提供參考。方法：采用高效液相色譜法（HPLC）測(cè)定大理州不同居群堅(jiān)龍膽葉中裂環(huán)烯醚萜類物質(zhì)含量，建立其HPLC指紋圖譜，并運(yùn)用單因素方差分析、總含量聚類分析和主成分分析法對(duì)不同居群堅(jiān)龍膽葉中裂環(huán)烯醚萜類物質(zhì)的含量進(jìn)行研究。結(jié)果：大理州不同居群堅(jiān)龍膽葉中龍膽苦苷、獐牙菜苦苷、獐牙菜苷的含量及其總含量差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05或P<0.01）；確定了HPLC 指紋圖譜中12個(gè)共有峰，除感通居群外，其余共有峰HPLC指紋圖譜相似度均在0.972以上，并指認(rèn)了其中龍膽苦苷、獐牙菜苦苷、獐牙菜苷3個(gè)與活性相關(guān)的特征峰；不同居群堅(jiān)龍膽葉中龍膽苦苷、獐牙菜苦苷、獐牙菜苷總含量聚類分析和HPLC指紋圖譜主成分分析結(jié)果相同。結(jié)論：大理州不同居群堅(jiān)龍膽葉中龍膽苦苷、獐牙菜苦苷、獐牙菜苷含量差異較大；除感通居群外，不同居群堅(jiān)龍膽葉中裂環(huán)烯醚萜類物質(zhì)相似度較高。

關(guān)鍵詞 大理白族自治州；居群；裂環(huán)烯醚萜類物質(zhì)；堅(jiān)龍膽葉；高效液相色譜法；含量測(cè)定；指紋圖譜；聚類分析；主成分分析

ABSTRACT OBJECTIVE： To explore the contents of secoiridoid substances （gentiopicroside， swertiamarin， sweroside） in the leaves of Gentiana rigescens from different populations in Dali Bai Autonomous Prefecture （Shorted for Dali prefecture）， and to provide reference for the selection of fine varieties， the development and utilization of G. rigescens. METHODS： The contents of secoiridoid substances in the leaves of G. rigescens from different populations in Dali prefecture were determined by HPLC， and the HPLC fingerprint was established. The contents of secoiridoid substances in the leaves of G. rigescens from different populations was studied by using single factor variance analysis， clustering analysis and principal component analysis. RESULTS： There were statistical significance in the contents of gentiamarin， swertiamarin and sweroside and the total contents in the leaves of G. rigescens from different populations in Dali prefecture （P<0.05 or P<0.01）. Twelve common peaks were found in HPLC fingerprint， and HPLC fingerprint similarities of common peaks except Gantong population were all over 0.972. Three peaks of them were identified as the characteristic peaks of gentiamarin， swertiamarin and sweroside which were correlated to the activities. The total contents of gentiamarin， swertiamarin and sweroside from different populations obtained by clustering analysis were consistent with that by HPLC fingerprint principal component analysis. CONCLUSIONS： There are great differences in the content of gentiamarin， swertiamarin and sweroside in the leaves of G. rigescens from different populations in Dali prefecture. The similarity of secoiridoid substances in the leaves of G. rigescens from different populations except Gantong population is higher.

KEYWORDS Dali Bai Autonomous Prefecture； Population； Secoiridoid； Leaves of Gentiana rigescens； HPLC； Content determination； Fingerprint； Cluster analysis； Principal component analysis

堅(jiān)龍膽（Gentiana rigescens Franch.）為龍膽科（Gentianaceae）龍膽屬草本植物，俗稱滇龍膽、蘭花根、龍膽草、青魚膽等[1]，是云南道地藥材。堅(jiān)龍膽是龍膽藥材基源植物之一，被歷版《中國(guó)藥典》所收載，以根及根莖入藥，具有清熱瀉火、抗病毒、殺菌、抗腫瘤等作用[2-6]，是龍膽注射液、龍膽瀉肝片、龍膽瀉肝湯等中成藥的原料。龍膽苦苷、獐牙菜苷、獐牙菜苦苷是堅(jiān)龍膽中的活性成分，并且龍膽苦苷含量是2015年版《中國(guó)藥典》（一部）中藥材質(zhì)量控制的指標(biāo)成分[7]。

龍膽苦苷主要在堅(jiān)龍膽葉綠體中經(jīng)牻牛兒基二磷酸酯通過(guò)羥基化氧化成檸檬醛，再經(jīng)過(guò)環(huán)化、水合、還原形成臭蟻二醛，臭蟻二醛再經(jīng)過(guò)烯醇化、羥醛縮合和苷化成環(huán)烯醚萜苷，環(huán)烯醚萜苷通過(guò)環(huán)斷裂、氧化內(nèi)酯化最終形成龍膽苦苷，并在龍膽苦苷基礎(chǔ)上形成了獐牙菜苦苷和獐牙菜苷[8-9]。龍膽苦苷、獐牙菜苷、獐牙菜苦苷在堅(jiān)龍膽葉綠體中合成并進(jìn)行儲(chǔ)藏和分配，從葉經(jīng)莖向下運(yùn)輸，最后主要在根及根莖中積累和儲(chǔ)存。因此，堅(jiān)龍膽葉中裂環(huán)烯醚萜類物質(zhì)（龍膽苦苷、獐牙菜苷、獐牙菜苦苷）的合成能力是影響藥材品質(zhì)的主要原因。本研究擬采用高效液相色譜法（HPLC）對(duì)堅(jiān)龍膽主要原料來(lái)源地大理白族自治州（簡(jiǎn)稱“大理州”）的不同居群堅(jiān)龍膽葉中龍膽苦苷、獐牙菜苦苷、獐牙菜苷含量進(jìn)行測(cè)定，并建立其HPLC指紋圖譜，探討大理州不同居群堅(jiān)龍膽葉中3種裂環(huán)烯醚萜類物質(zhì)成分含量差異，為堅(jiān)龍膽優(yōu)良品種篩選及其應(yīng)用開發(fā)提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

Agilent1200型HPLC儀，包括G1315A/B型DAD檢測(cè)器、G1313A ALS型自動(dòng)進(jìn)樣器、Agilent ChemStation 色譜工作站（美國(guó)Agilent公司）；AE240型電子分析天平（瑞士Mettler-Toledo公司）； SK5200H型超聲波清洗儀（上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司）。

1.2 對(duì)照品與試劑

龍膽苦苷對(duì)照品（批號(hào)：110770）、獐牙菜苦苷對(duì)照品（批號(hào)：2000203）均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院（純度：均>98%）；獐牙菜苷對(duì)照品（貴州迪大生物有限公司，批號(hào)：14215-86-23，純度：>98%）；甲醇為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純。

1.3 藥材

2012年11月堅(jiān)龍膽開花期，在藥材的主要來(lái)源地云南大理州隨機(jī)選取10個(gè)居群堅(jiān)龍膽，居群間距離不小于30 km，同一居群不同植株距離大于3 m，每個(gè)居群隨機(jī)采集無(wú)病蟲害的植株30株，經(jīng)大理大學(xué)李海峰教授鑒定均為龍膽科龍膽屬堅(jiān)龍膽。樣品自然干燥后，在50 ℃烘箱中干燥至恒質(zhì)量作為供試樣品。樣品信息見表1。

2 方法與結(jié)果

2.1 堅(jiān)龍膽葉中龍膽苦苷、獐牙菜苦苷、獐牙菜苷含量測(cè)定

2.1.1 色譜條件 色譜柱：Thermore C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇-0.1%磷酸水（27 ∶ 73，V/V）；檢測(cè)波長(zhǎng)：龍膽苦苷為274 nm，獐牙菜苷和獐牙菜苦苷為243 nm；柱溫：25 ℃；流速：1 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL。

2.1.2 溶液的制備 （1）混合對(duì)照品溶液： 精密稱取龍膽苦苷3.27 mg、獐牙菜苷4.46 mg、獐牙菜苦苷5.00 mg，分別置于5、5、10 mL量瓶中，用甲醇溶解并定容，分別制成0.654 0、0.892 0、0.500 0 mg/mL的單一對(duì)照品貯備液。再分別精密量取單一對(duì)照品貯備液2.0 mL至10 mL量瓶中，用甲醇溶解并定容，制備成龍膽苦苷、獐牙菜苷、獐牙菜苦苷質(zhì)量濃度分別為0.130 8、0.178 4、0.100 0 mg/mL的混合對(duì)照品溶液。（2）供試品溶液：取堅(jiān)龍膽葉粉碎，50 ℃干燥至恒質(zhì)量，過(guò)100目篩，精密稱定樣品約0.1 g，置于50 mL三角瓶中，加入2 mL甲醇，于54 kHz、40 ℃超聲處理20 min，過(guò)濾，濾渣再用2 mL甲醇重復(fù)超聲1次；合并2次濾液至5 mL量瓶中，混勻，定容，即得。

2.1.3 方法學(xué)考察 參考文獻(xiàn)[10-12]方法進(jìn)行方法學(xué)考察。結(jié)果，本方法專屬性較好，供試品溶液中各成分與雜質(zhì)基線分離較好，雜質(zhì)對(duì)目標(biāo)成分檢測(cè)無(wú)干擾。線性關(guān)系[以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)（x），峰面積為縱坐標(biāo)（y）]、檢測(cè)限和定量限考察結(jié)果顯示，龍膽苦苷標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=1 046.0x-16.832（r=0.999 8），線性范圍為0.026 2～0.261 6 μg/mL，檢測(cè)限為0.116 5 μg，定量限為0.363 5 μg；獐牙菜苦苷標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=917.56x-57.832（r=0.999 4），線性范圍為0.020 0～0.200 0 μg/mL，檢測(cè)限為0.150 8 μg，定量限為0.370 2 μg； 獐牙菜苷標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=1 005.5x+31.517（r=0.999 2），線性范圍為0.035 7～0.356 8 μg/mL，檢測(cè)限為0.108 8 μg、定量限為0.386 6 μg。精密度試驗(yàn)中，龍膽苦苷、獐牙菜苦苷、獐牙菜苷檢測(cè)峰面積的RSD分別為0.96%、0.99%、0.14%（n=6）；重復(fù)性試驗(yàn)中（供試品為S3），3種成分峰面積的RSD分別為2.46%、2.74%、1.58%（n=6）；室溫條件下36 h穩(wěn)定性（供試品為S3）試驗(yàn)中，3種成分峰面積的RSD分別為0.96%、0.99%、0.14%（n=6）。準(zhǔn)確度試驗(yàn)中，3種成分的平均方法回收率分別為101.4%、96.9%、106.8%，RSD分別為2.82%、0.31%、1.82%（n=9）。

2.1.4 含量測(cè)定 按 “2.1.2”項(xiàng)下方法分別制備供試品溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，測(cè)定不同居群堅(jiān)龍膽葉中3種成分含量。采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用單因素方差分析法進(jìn)行不同居群中堅(jiān)龍膽葉中3種成分含量差異比較，結(jié)果見表2。

如表1所示，大理州不同居群間堅(jiān)龍膽葉中龍膽苦苷、獐牙菜苦苷、獐牙菜苷含量及其總含量差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05或P<0.01）。除S1外，不同居群堅(jiān)龍膽葉中龍膽苦苷含量在4.496%～8.642%之間。S8中龍膽苦苷含量顯著高于其他居群（P<0.01），S7與S5、S10與S2中龍膽苦苷含量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。不同居群間堅(jiān)龍膽葉中獐牙菜苦苷含量在0.187%～0.569%之間，相差3倍多。S8中龍膽苦苷含量同樣顯著高于其他居群（P<0.01），S4與S2、S6與S9、S7與S5的堅(jiān)龍膽葉中龍膽苦苷含量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。僅在S3、S7中檢測(cè)到獐牙菜苷。S8中3種成分的總含量最高，其次是S9，S1最低。

2.2 聚類分析

參照文獻(xiàn)[10-11]的方法，以表1中不同居群堅(jiān)龍膽葉中龍膽苦苷、獐牙菜苦苷及獐牙菜苷總含量為依據(jù)，通過(guò)SPSS 17.0軟件中平方歐式距離計(jì)算樣品間的相似系數(shù)，并采用Ward法進(jìn)行系統(tǒng)聚類，樹狀聚類見圖1。

根據(jù)不同居群堅(jiān)龍膽葉中3種成分總含量可以將大理州不同居群堅(jiān)龍膽分為4類。第Ⅰ類為S8，第Ⅱ類為S7、S6、S9，第Ⅲ類為S2、S10、S3、S4、S5，第Ⅳ類為S1。第Ⅰ類與第Ⅱ類距離較近，說(shuō)明第Ⅰ類與第Ⅱ類堅(jiān)龍膽葉中3種成分總含量相接近。再結(jié)合表2 Ⅲ種成分的總含量可知，第Ⅰ類總含量最高，第Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ類的總含量依次降低。

2.3 堅(jiān)龍膽葉 HPLC 指紋圖譜的建立

2.3.1 色譜條件 色譜柱：Hypersil BDS C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇（A）-0.1%磷酸水（B） ，梯度洗脫（0～10 min，15%→27%A；10～50 min，27%→73%A；50～65 min，73%→95%A）；檢測(cè)波長(zhǎng)：250 nm；柱溫：25 ℃；流速：0.8 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL。

2.3.2 精密度試驗(yàn) 取S3樣品6份，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，以龍膽苦苷的相對(duì)峰面積和相對(duì)保留時(shí)間為參照，記錄各共有峰的相對(duì)峰面積和相對(duì)保留時(shí)間，計(jì)算得到各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于0.93%（n=6）、相對(duì)峰面積的RSD均小于2.42%（n=6）。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取S3樣品，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別放置0、2、4、6、8、10、12 h后按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以龍膽苦苷的相對(duì)峰面積和相對(duì)保留時(shí)間為參照，記錄各共有峰的相對(duì)峰面積和相對(duì)保留時(shí)間，計(jì)算得到各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于1.08%（n=7），各共有峰的相對(duì)峰面積的RSD均小于3.00%（n=7）。

2.3.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批S3樣品6份，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6次，以龍膽苦苷的相對(duì)峰面積和相對(duì)保留時(shí)間為參照，記錄各共有峰的相對(duì)峰面積和相對(duì)保留時(shí)間，計(jì)算得到各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于1.53%（n=6），相對(duì)峰面積的RSD均小于2.79%（n=6）。

2.3.5 HPLC指紋圖譜建立及相似度評(píng)價(jià) 取不同居群堅(jiān)龍膽葉樣品，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，將不同居群堅(jiān)龍膽葉HPLC圖譜的AIA格式原始數(shù)據(jù)導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2004A版”軟件系統(tǒng)，以S3為參照?qǐng)D譜，經(jīng)過(guò)多點(diǎn)校正，自動(dòng)匹配，以中位數(shù)法，生成對(duì)照?qǐng)D譜R，建立指紋圖譜，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)。結(jié)果，不同居群堅(jiān)龍膽葉 HPLC 指紋圖譜中共有12個(gè)共有峰，經(jīng)過(guò)與對(duì)照品保留時(shí)間比較，確認(rèn)7、9號(hào)峰分別為獐牙菜苦苷和龍膽苦苷。S1樣品 HPLC 指紋圖譜的相似度較低，僅為0.597，其余居群堅(jiān)龍膽葉 HPLC 指紋圖譜相似度較高，均在0.972以上（S1～S10樣品的HPLC指紋圖譜相似度分別為0.597、0.994、0.962、0.996、0.993、0.996、0.978、0.997、0.995、0.972），大理州不同居群堅(jiān)龍膽葉HPLC 指紋圖譜見圖2。

2.4 指紋圖譜的主成分分析

參照文獻(xiàn)[10-11]的方法，將大理州不同居群堅(jiān)龍膽葉 HPLC 圖譜各共有峰的峰面積與藥材稱樣量之比，即單位質(zhì)量藥材峰面積進(jìn)行量化，得到10×12階的數(shù)據(jù)矩陣，應(yīng)用SPSS 17.0軟件對(duì)其進(jìn)行主成分分析。以特征值大于1為提取標(biāo)準(zhǔn)，得到3個(gè)主成分，累積貢獻(xiàn)率達(dá)到83.58%。其中，第Ⅰ主成分λ=6.419，方差貢獻(xiàn)率為53.49%，貢獻(xiàn)率最大，包含的信息最多。第Ⅱ主成分λ=2.434，方差貢獻(xiàn)率為20.29%。第Ⅲ主成分λ=1.176，方差貢獻(xiàn)率為9.80%。第Ⅰ和第Ⅱ主成分總的方差貢獻(xiàn)率為73.78%，故選擇第Ⅰ、第Ⅱ主成分繪制主成分得分圖。結(jié)果，不同居群堅(jiān)龍膽葉被分為4組，其分組結(jié)果與不同居群堅(jiān)龍膽葉中龍膽苦苷、獐牙菜苦苷、獐牙菜苷總含量的聚類分析結(jié)果一致。大理州不同居群堅(jiān)龍膽葉中主成分得分圖見圖3。

3 討論

大理州不同居群堅(jiān)龍膽葉中獐牙菜苷差異較小，獐牙菜苦苷、龍膽苦苷含量差異較大；除S1樣品HPLC 圖譜的相似度較低外，其余不同居群堅(jiān)龍膽葉 HPLC圖譜相似度較高，說(shuō)明大理州不同居群堅(jiān)龍膽葉中裂環(huán)烯醚萜類物質(zhì)種類相似性較高；不同居群堅(jiān)龍膽葉中龍膽苦苷、獐牙菜苦苷、獐牙菜苷總含量聚類分析和 HPLC 圖譜主成分分析結(jié)果一致，進(jìn)一步說(shuō)明大理州不同居群堅(jiān)龍膽葉中合成和積累的裂環(huán)烯醚萜類物質(zhì)種類相似性較高?？梢?，大理州不同居群堅(jiān)龍膽葉中裂環(huán)烯醚萜類物質(zhì)種類具有較穩(wěn)定的遺傳性，而不同居群堅(jiān)龍膽葉中龍膽苦苷、獐牙菜苦苷、獐牙菜苷含量差異較大，可能與堅(jiān)龍膽所生長(zhǎng)的氣候、土壤等生態(tài)條件不同有關(guān)，在不同生態(tài)條件下，堅(jiān)龍膽葉中裂環(huán)烯醚萜類物質(zhì)合成關(guān)鍵酶的表達(dá)量存在較大差異，而這種差異可能是導(dǎo)致堅(jiān)龍膽葉中裂環(huán)烯醚萜類物質(zhì)含量差異形成的主要原因；同時(shí)，只有在S3和S7樣品葉中檢測(cè)到獐牙菜苷，獐牙菜苷雖然在植物葉中合成，但其可能主要在根莖和花中積累，不同部位的貯藏、運(yùn)輸、積累及轉(zhuǎn)化可能是導(dǎo)致其在葉中含量差異較大的原因，有關(guān)問(wèn)題值得進(jìn)一步研究。

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（收稿日期：2017-09-11 修回日期：2017-12-20）

（編輯：林 靜）