川芎中總生物堿、總酚酸和總揮發(fā)油對大鼠離體子宮平滑肌收縮活動(dòng)的抑制作用

劉娟 蒲忠慧 彭成 張鑫 李文兵 戴鷗

中圖分類號 R965.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號 1001-0408（2018）05-0621-04

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.05.11

摘 要 目的：考察川芎中總生物堿、總酚酸和總揮發(fā)油對大鼠離體子宮平滑肌收縮活動(dòng)的抑制作用，為闡明川芎活血調(diào)經(jīng)的傳統(tǒng)功效提供依據(jù)。方法：取大鼠離體子宮平滑肌浸泡于洛氏液中，以二甲基亞砜為空白對照、鹽酸維拉帕米為陽性對照，采用PowerLab生理記錄儀記錄子宮平滑肌收縮曲線，通過觀察收縮活動(dòng)力、收縮張力變化來評價(jià)川芎中總生物堿、總酚酸（質(zhì)量濃度均分別為0.025、0.05、0.1 mg/mL）和總揮發(fā)油（0.04、0.08、0.16 mg/mL）對縮宮素致大鼠離體子宮平滑肌收縮的抑制作用，并計(jì)算子宮平滑肌收縮活動(dòng)力抑制率和收縮張力抑制率。結(jié)果：加入縮宮素后大鼠離體子宮平滑肌的收縮活動(dòng)力、收縮張力較加入縮宮素前均顯著升高（P<0.05或P<0.01），不同質(zhì)量濃度3類川芎組分均可顯著降低子宮平滑肌的收縮活動(dòng)力、收縮張力（P<0.05或P<0.01）。與空白對照比較，除0.025 mg/mL總酚酸外，給予其余濃度藥物或組分后子宮平滑肌的收縮活動(dòng)力抑制率和收縮張力抑制率均顯著升高（P<0.05或P<0.01）。結(jié)論：川芎中總生物堿、總酚酸和總揮發(fā)油對縮宮素致大鼠離體子宮平滑肌收縮均有一定的抑制作用，這為川芎活血調(diào)經(jīng)的用法提供了參考依據(jù)。

關(guān)鍵詞 川芎；總生物堿；總酚酸；總揮發(fā)油；離體子宮；大鼠；平滑肌收縮

ABSTRACT OBJECTIVE： To investigate the inhibition effect of total alkaloid， total phenolic acid and total volatile oil from Ligusticum chuanxiong on the contraction of the isolated uterine smooth muscle of rats， and to provide reference for clarifying the promoting blood circulation to restore menstrual flow traditional efficacy of L. chuanxiong. METHODS： The isolated uterine smooth muscle of rats were collected and soaked in Lockes solution. Using dimethyl sulfoxide as blank control， verapamil hydrochloride as positive control， the contraction curves of the isolated uterine smooth muscle in rats were recorded with PowerLab electrophysiolograph. Inhibitory effects of total alkaloid， total phenolic acid （mass concentrations of 0.025， 0.05， 0.1 mg/mL） and total volatile oil （0.04， 0.08， 0.16 mg/mL） on the contraction of the isolated uterine smooth muscle of rats induced by oxytocin were evaluated by observing the changes of contraction activity and contraction tension. Inhibitory rates of contraction activity and contraction tension of uterine smooth muscle were calculated. RESULTS： The contraction activity and contraction tension of uterine smooth muscle in rats were increased significantly after treated with oxytocin （P<0.05 or P<0.01）. Different concentrations of 3 types of compounds from L. chuanxiong all decreased contraction activity and contraction tension of uterine smooth muscle significantly （P<0.05 or P<0.01）. Compared with blank control， except for 0.025 mg/mL total phenolic acid， the inhibitory rates of contraction activity and contraction tension of uterine smooth muscle were all decreased significantly （P<0.05 or P<0.01）after treated with other concentration drugs or components. CONCLUSIONS： The total alkaloid， total phenolic acid and total volatile oil from L. chuanxiong show certain inhibitory effect on the contraction of isolated uterine smooth muscle in rats， which provide reference for promoting blood circulation to restore menstrual flow use of L. chuanxiong.

KEYWORDS Ligusticum chuanxiong； Total alkaloids； Total phenolic acid； Total volatile oil； Isolated uterine； Rat； Contraction of smooth muscle

川芎為傘形科藁本屬多年生草本植物，首載于《神農(nóng)本草經(jīng)》。有文獻(xiàn)中記載：川芎上行頭角、助清陽之氣，止痛；下行血海，養(yǎng)新生之血調(diào)經(jīng)”[1]，廣泛用于各種瘀血阻滯之病癥。中醫(yī)臨床用于治療各種血瘀癥之婦科疾病的復(fù)方芎歸散、經(jīng)前三劑止痛方、四物湯、少腹逐瘀湯、香附四物湯等經(jīng)典方劑均含川芎這味重要中藥?，F(xiàn)代臨床也將川芎作為活血調(diào)經(jīng)之品，多以川芎復(fù)方治療原發(fā)性痛經(jīng)[2]，且主要通過抑制子宮平滑肌興奮來緩解子宮強(qiáng)烈收縮所致的痛經(jīng)。藥理研究表明，川芎對子宮平滑肌收縮活動(dòng)的影響的研究報(bào)道主要有川芎提取物[3]和川芎復(fù)方提取物[4]，而關(guān)于川芎不同組分以及川芎單體成分影響子宮平滑肌收縮的研究報(bào)道相對較少。就組分而言，目前僅發(fā)現(xiàn)川芎揮發(fā)油對小鼠離體子宮平滑肌收縮有一定的抑制作用[5]，川芎總生物堿[6]和川芎總酚酸[7-9]作為川芎的有效活性成分群，二者對子宮平滑肌收縮活動(dòng)的影響研究尚未見報(bào)道。川芎在臨床上常以水煎劑入藥，用于活血調(diào)經(jīng)，而川芎生物堿和川芎總酚酸作為川芎中的大極性成分，是否在活血調(diào)經(jīng)中發(fā)揮著重要作用，值得深入研究。因此，本研究采用課題組前期優(yōu)化的提取工藝，從川芎藥材中提取富集總生物堿、總酚酸和總揮發(fā)油這3類組分，利用大鼠離體子宮平滑肌收縮模型評價(jià)其對離體子宮收縮活動(dòng)的影響，以期為川芎應(yīng)用提供參考。

1 材料

1.1 儀器

PowerLab多功能生理記錄儀、恒溫水浴槽和Labchart Pro專業(yè)版軟件[澳大利亞埃德儀器國際貿(mào)易（上海）有限公司]；FA2004B電子天平（上海越平科學(xué)儀器有限公司）；DZKW-S-4電熱恒溫水浴鍋（北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司）。

1.2 藥材、藥品與試劑

川芎飲片由四川新綠色藥業(yè)科技發(fā)展股份有限公司提供，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院李敏教授鑒定為傘形科多年生草本植物川芎Ligusticum chuanxiong Hort.的根莖，標(biāo)本現(xiàn)存于成都中醫(yī)藥大學(xué)中藥資源系統(tǒng)研究與開發(fā)利用省部共建國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地（標(biāo)本號：LC-20150910）；縮宮素注射液（安徽宏業(yè)藥業(yè)有限公司，批號：140347，規(guī)格：10 u/mL，使用時(shí)用生理鹽水配成1 u/mL）；戊酸雌二醇片（拜耳醫(yī)藥保健有限公司廣州分公司，批號：309A，規(guī)格：1 mg/片，使用時(shí)用純水配成0.8 mg/mL）；鹽酸維拉帕米（四川省食品藥品檢驗(yàn)檢測院，批號：100223-200102，規(guī)格：50 mg/支，用純水配成1×10-3 mol/L的母液）；其余試劑均為分析純。

1.3 動(dòng)物

健康成年未孕SD大鼠20只，普通級，♀，體質(zhì)量220～250 g，由成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供[動(dòng)物生產(chǎn)許可證號：SCXK（川）2015-030]。

2 方法

2.1 川芎不同組分的制備

2.1.1 川芎總生物堿的制備 稱取川芎藥材15 kg，粉碎，按照實(shí)驗(yàn)室前期優(yōu)化的提取工藝制備川芎總生物堿[10-11]，獲得0.75 kg的川芎總生物堿浸膏，采用酸性染料比色法測定川芎總生物堿含量，測得每g浸膏含137.28 mg總生物堿。臨用前用二甲基亞砜（DMSO）配成0.1 g/mL（以浸膏計(jì)，下同）。

2.1.2 川芎總酚酸的制備 稱取川芎藥材100 g，粉碎，加13倍量65%的乙醇超聲提取2次，每次55 min，過濾，濾液濃縮蒸干。殘?jiān)影彼浞秩芙?，濾過，濾液用濃鹽酸調(diào)pH為2～3，再用乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯萃取液，濃縮蒸干，共獲得4.63 g總酚酸浸膏，采用高效液相色譜法測定川芎總酚酸含量，測得每g浸膏含43.46 mg總酚酸。臨用前用DMSO配成0.1 g/mL。

2.1.3 川芎總揮發(fā)油的制備 稱取川芎藥材1 kg，粉碎，以8倍量蒸餾水浸泡過夜，按照常規(guī)水蒸氣蒸餾提取法提取10 h，收集揮發(fā)油，以無水硫酸鈉除水后，得到川芎總揮發(fā)油3.65 g。臨用前用DMSO配成0.1 g/mL。

2.2 正常大鼠離體子宮平滑肌肌條的制備

實(shí)驗(yàn)前2 d取大鼠，每天按8 mg/kg灌胃戊酸雌二醇溶液，復(fù)制動(dòng)情期大鼠模型[12]。于實(shí)驗(yàn)第3 d，頸椎脫臼處死大鼠并迅速剖取子宮，置于盛有洛氏液（取NaCl 9.2 g、KCl 0.42 g、CaCl2 0.24 g、NaHCO3 0.15 g、葡萄糖1.0 g，用生理鹽水制備成1 000 mL的溶液，即得）的玻璃皿中，輕輕剝離子宮上附有的結(jié)締組織和脂肪組織，然后取中間段子宮平滑肌2～3 cm。

2.3 川芎3類組分對縮宮素致大鼠離體子宮收縮活動(dòng)的影響

將肌條一端固定于盛有洛氏液20 mL的浴槽中，另一端連接張力換能器，負(fù)重為1 g，保持浴槽中的營養(yǎng)液溫度為（37±0.5） ℃，并通以95%O2+5%CO2的混合氣體，速度為1～2個(gè)小氣泡/s[13]，用PowerLab多功能生理記錄儀記錄子宮收縮曲線。待子宮收縮曲線穩(wěn)定30 min后，加入1 u/mL縮宮素160 μL復(fù)制子宮平滑肌收縮模型。10 min后，分別給予川芎總生物堿、總酚酸（終質(zhì)量濃度均分別為0.025、0.05、0.1 mg/mL）以及總揮發(fā)油（終質(zhì)量濃度分別為0.04、0.08、0.16 mg/mL），并以DMSO為空白對照，5×10-7 mol/L鹽酸維拉帕米為陽性對照，均按照等體積給藥。給藥后，觀察離體子宮平滑肌的收縮張力（即張力平均值）和收縮活動(dòng)力（即收縮張力×收縮頻率，其中收縮頻率為10 min內(nèi)子宮平滑肌的收縮次數(shù)）的變化，記錄給藥后10 min內(nèi)子宮平滑肌的收縮曲線，并計(jì)算給藥后的子宮平滑肌收縮張力抑制率和收縮活動(dòng)力抑制率[（給藥前數(shù)值-給藥后數(shù)值）/給藥前數(shù)值×100%]。試驗(yàn)重復(fù)6次。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。結(jié)果以x±s表示，加入縮宮素前后及給藥前后的比較采用配對t檢驗(yàn)；空白對照和給藥后指標(biāo)變化的比較采用單因素方差分析和獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 子宮收縮張力的測定結(jié)果

與造模前比較，造模后子宮平滑肌的收縮張力顯著升高（P<0.05或P<0.01）。與造模后比較，加入DMSO后子宮平滑肌的收縮張力有降低趨勢，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；加入鹽酸維拉帕米和川芎3類組分后子宮平滑肌的收縮張力均顯著降低（P<0.05或P<0.01），結(jié)果見表1。

3.2 子宮平滑肌收縮活動(dòng)力的測定結(jié)果

與造模前比較，造模后子宮平滑肌的收縮活動(dòng)力顯著升高（P<0.05或P<0.01）。與造模后比較，加入DMSO后子宮平滑肌收縮活動(dòng)張力有降低趨勢，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；給予鹽酸維拉帕米和不同質(zhì)量濃度3類川芎組分后，子宮平滑肌的收縮活動(dòng)力均顯著降低（P<0.05或P<0.01）。子宮平滑肌收縮曲線見圖1，收縮活動(dòng)力測定結(jié)果見表2。

3.3 子宮平滑肌收縮張力抑制率和收縮活動(dòng)力抑制率測定結(jié)果

DMSO對縮宮素致大鼠離體子宮平滑肌收縮活動(dòng)的影響不大，無顯著抑制作用。與DMSO比較，加入鹽酸維拉帕米和川芎3類組分后子宮平滑肌的收縮張力抑制率和收縮活動(dòng)力抑制率均不同程度升高，除0.025 mg/mL總生物堿和0.025 mg/mL總酚酸外差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05或P<0.01），但是川芎3類組分的作用均不及鹽酸維拉帕米，結(jié)果見表3。

4 討論

本研究探究了川芎3類主要藥效組分總生物堿、總酚酸以及總揮發(fā)油對縮宮素致大鼠離體子宮平滑肌收縮活動(dòng)的影響。本研究中川芎總揮發(fā)油給藥濃度的設(shè)置主要參照文獻(xiàn)[14]；而川芎總生物堿和總酚酸則主要參考預(yù)試驗(yàn)結(jié)果：0.2 mg/mL川芎總生物堿和總酚酸對子宮平滑肌的抑制作用太強(qiáng)，經(jīng)洛氏液沖洗3次后子宮平滑肌無法恢復(fù)活力，而0.1、0.05、0.025 mg/mL的川芎總生物堿與總酚酸對子宮平滑肌收縮的抑制率可達(dá)30%～60%。本研究結(jié)果表明，在選擇的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，川芎總揮發(fā)油對子宮平滑肌收縮具有顯著的抑制作用，且呈濃度依賴性，該結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道一致[5]；而川芎總生物堿和總酚酸對子宮平滑肌收縮活動(dòng)同樣均具有顯著抑制作用，當(dāng)給藥質(zhì)量濃度在0.1 mg/mL時(shí)，兩者對子宮平滑肌收縮活動(dòng)的抑制作用相當(dāng)，而在0.05、0.025 mg/mL時(shí)，前者對子宮平滑肌收縮活動(dòng)的抑制作用優(yōu)于后者。

川芎總揮發(fā)油是川芎研究報(bào)道較多的一類組分，也是最主要的藥效組分，臨床應(yīng)用及現(xiàn)代藥理研究均證實(shí)了其具有鎮(zhèn)痛鎮(zhèn)靜、改善血管功能等活性[15-16]，而針對川芎非揮發(fā)性組分（生物堿和酚酸類成分）的研究相對較少。除揮發(fā)油外，川芎傳統(tǒng)入藥方式常以水煎劑入藥，為進(jìn)一步明確其藥效，本研究發(fā)現(xiàn)川芎總生物堿和總酚酸對縮宮素致大鼠離體子宮收縮活動(dòng)同樣具有顯著的抑制作用，該研究結(jié)果為進(jìn)一步證實(shí)川芎活血調(diào)經(jīng)之傳統(tǒng)功效提供了參考資料。但是，不同組分對大鼠離體子宮平滑肌的作用機(jī)制以及藥效物質(zhì)基礎(chǔ)還有待進(jìn)一步深入研究。

參考文獻(xiàn)

[ 1 ] 劉麗寧.談中藥經(jīng)典方劑應(yīng)用中的動(dòng)力藥[J].遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，11（9）：28-29.

[ 2 ] 方玲，朱新冰，祝誠誠，等.經(jīng)前三劑止痛方治療原發(fā)性痛經(jīng)的機(jī)制研究[J].中草藥，2010，41（4）：615-617.

[ 3 ] 寧其娟，黃金花，鄧世富，等.川芎提取液對小白鼠離體子宮平滑肌收縮性能的影響[J].中國醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2009，6（17）：19-20.

[ 4 ] 陳芳，朱敏，唐于平.川芎白芍及配伍對離體小鼠子宮痛經(jīng)模型的影響[J].時(shí)珍國醫(yī)國藥，2011，22（7）：1557- 1558.

[ 5 ] 宿樹蘭，華永慶，段金廒，等.當(dāng)歸-川芎揮發(fā)性成分與其抗子宮痙攣活性相關(guān)性分析[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2009，15（2）：64-67.

[ 6 ] 劉絮，姜秀文，王立英，等.川芎生物堿對大鼠腦缺血-再灌注損傷的保護(hù)作用[J].北華大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2016，17（3）：339-343.

[ 7 ] SAULNIER L， MAROT C， ELGORRIAGA M， et al. Thermal and enzymatic treatments for the release of free ferulic acid from maize bran[J]. Carbohyd Polym，2001，45（3）：269-275.

[ 8 ] 顧俊菲，封亮，袁嘉瑞，等.赤芍總苷、川芎總酚酸組分組成結(jié)構(gòu)對缺氧損傷人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的影響[J].中國中藥雜志，2015，40（5）：920-926.

[ 9 ] BARONE E， CALABRESE V， MANCUSO C. Ferulic acid and its therapeutic potential as a hormetin for age-related diseases[J]. Biogerontology，2009，10（2）：97-108.

[10] 蒲忠慧，蘇海國，王力，等.正交試驗(yàn)法優(yōu)選川芎總生物堿的提取工藝[J].成都中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2017，40（2）：20- 24.

[11] 蒲忠慧，王力，高宇，等.大孔吸附樹脂純化富集川芎總生物堿的工藝[J].食品研究與開發(fā)，2017，38（11）：85-90.

[12] 代良萍，謝曉芳，孫晨，等.益母草注射液生物堿單體配伍對離體子宮收縮活動(dòng)的影響[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2016，28（10）：1633-1638.

[13] 袁鳳娟，孫玉華，哈木拉提·哈斯木，等.神香草不同洗脫物對豚鼠離體氣管平滑肌收縮的影響[J].中國藥房，2017，28（13）：1790-1793.

[14] 劉琳娜，梅其炳，尚磊，等.當(dāng)歸精油對大鼠離體子宮平滑肌收縮的影響[J].中成藥，2004，26（4）：308-311.

[15] 杜旌暢，謝曉芳，熊亮，等.川芎揮發(fā)油的化學(xué)成分與藥理活性研究進(jìn)展[J].中國中藥雜志，2016，41（23）：4328- 4333.

[16] 劉露絲，岳美穎，李文兵，等.當(dāng)歸油與川芎油的化學(xué)成分及其對急性化學(xué)性腦損傷保護(hù)作用差異研究[J].中藥藥理與臨床，2016，32（6）：105-108.

（收稿日期：2017-08-25 修回日期：2018-01-08）

（編輯：林 靜）